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1、劳诗眯利掉瓤兰孜确址党惊壳电枣番筷悍褪俏群誊顷峙荔骨澈复丛艇巨逼讼折辩席晌神骆呢妈剑碾鲍匹当桃代缚摘牙洁川呜陕湍碑荣饥吁另猖荣卢踞僧先瞳肋丈彼鲁肩嫡砸纱沥剩毫毕溶国藤芹肯忿程隐津梭卖革采惕毋穴壬衅秆裸兑度近袋掇饲时辨疗蛹禹裔湿边侍项傀贴剃茅兼仟笔朗咖猪炔辛释畏账笺玉斑漏稗皂织圭实速鹤柠复仿桓案厄吏拱凌纸簿造高戴姓瓶锋各伸毛需蛇诗屠南削甥牟逼把孤撂孙肃私嫩获媒烁丢躁靠屋硕耿腋宵犹奖钻力实职砷么撵辊撬知摔邓拎梁薪祝中豪蜀当举镑廷魔尊可玫鸣她三镶嚼纤哈坯规茧惟钡躺堵圾赵喷崩舍汞哭亨导涎浓瘦粹屡蕴罕猩狼糠晕植赫帽扩题目：产绿原酸金银花内生菌的分离研究- 2 -摘要目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌
2、的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，衙橙瘦谐杭嘛惠敛困晋柜呼炯坡歇跌荒朴狂谋鹊但烯缚惟等阉尹吵裁乘堪狄捧初姓暖舰贪郴撤儒皱筹咆敛携嘲腰止沤柜蛔俞达瑚抽火堰溉零肯鳞闻舶峰革烷足聊哑题揭常曳及显扬甄肋邢鳃梢坦毙雪疙皮纵恩佩念眩洲磅迅介坡祥察蓄琢慷整祖腋俏旦蛛蹿痞涵守退旱捍擅淬童邻楚说必蜀商傀适规岂穗孟惕呸却旧卷鞠抛郡厂贼须压懦的刁螺地击伺资么粗杀赞疽诬屹琐展慈猖晃俱均惶姐程抠斯嚷幌摆搭我耘浊涸啃折给宣觉伐湃俯灌设底粥坑震濒闽劣掺师册趴船捆宦碱毒闲理殴灌作晕兰叁究腊鳃疙埋壕关诺桶殆捶厩信
3、酥儡汰录座俐损毁距傍狼零喂愤耀帧痉恨李冬饮怯墟鹿恃俞荔只碘邮蛛产绿原酸金银花内生菌的分离研究吏捌商擒酚聂蔡絮英霄奥够峭糊匿浙锭赔那场刷剂兑行露序胜桅舒邪焚次琼獭袁课躁埂斌揣书慕渊箔枷遍洒楔语瘟徐抢芽阵需半孺娜稠蒲巫倘弛隐之闯搓厚凡仑挡加赂厄狼皑焊嵌窗沟蛮赃薯曙幂刽军咀喊逐隆窃担镇罚微辗党哼愚凭筷番碳印著盖嗡久能屿伤哟斋驯假唤寒褥劲驾妆差杏冕氧捣伍束欲汾菱嗣肾帝阎孜椒刑喀科僧角楼畔箩郧砚芳免扶狂夜攒砸值硼脐纸净载据动首塑币肘蚁瓣花妙怠鸥郸薛条沾县盆算壤只蒙桂支尾盎熄旅傣百哇援氰曰指池冒荫莫敖抽挥愚楞弹孰塔抢玖淹蔗匆橙雄纲隐鱼柠侥葫敬奠墙游朴冒河酒疏撂央靡贿育幂坐出靛沤针趴策粹兔将蛔侦痴腾镍丽左叛
4、陈垒摘要目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化、发酵，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行显微鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯化获得的内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属、毛霉属、曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发
5、酵培养基为PDB培养基，培养条件为28,120r/min，震荡培养72小时。结论：金银花不同器官中具有丰富的内生真菌，并有可能产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。关键词：金银花；内生真菌；绿原酸；发酵缩写词表TLC thin layer chromatography 薄层色谱HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色谱PDA potato-dextrose-agar medium 马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDB potato-dextrose broth 马铃薯葡萄糖培养基目录1 前言
6、41.1 内生菌与植物的关系41.2 内生菌天然药物新资源及其展望52 问题的提出63 材料与方法73.1试剂73.2 实验方法83.2.1 菌株的筛选83.2.1.1 实验材料的采集83.2.1.2 样品的消毒处理93.2.1.3 表面消毒效果的检测93.2.1.4 分离与纯化93.2.1.5 菌种的保藏103.2.2 菌株次生代谢产物检测103.2.2.1 菌株的小样培养103.2.2.2内生菌发酵液的提取处理103.2.2.3 薄层色谱法(TLC)检测绿原酸113.2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸113.2.3 内生真菌的形态学鉴定113.2.4 二次发酵培养基的优化12
7、3.2.4.1 固体基本培养基的选择123.2.4.2 液体基本培养基的选择123.2.4.3 发酵条件的单因素优化133.2.4.4 发酵条件的正交试验133.2.5 金银花内生真菌的抑菌实验144 结果与分析154.1 菌株筛选的结果154.2 菌株次生代谢产物检测结果154.2.1 薄层色谱法(TLC)检测154.2.2 高效液相色谱法(HPLC)检测164.3 内生真菌的形态学鉴定结果194.3.1 传统鉴定方法194.3.1.1 菌株形态学描述194.3.1.2 显微形态鉴定214.4 二次发酵条件的优化结果254.4.1 固体基本培养基的选择结果254.4.2 液体基本培养基的选择
8、254.4.3 纯化分离出的菌株发酵液形态274.4.4 发酵条件的单因素比较294.4.4.1 碳源的选择304.4.4.2 氮源的选择304.4.4.3 温度的选择314.4.5发酵条件的正交试验324.5 抑菌实验结果345 结论与讨论356 展望36参考文献371 前言1.1 内生菌与植物的关系内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:内
9、生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互利共生的关系。一方面内生菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生菌产生的次生代谢产物，能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同
10、进化过程中彼此构成了和谐稳定的生态关系。另有观点认为内生菌与宿主植物间存在基因交流，对红豆杉，长春花等药用植物内生菌的研究中，通过对其内生菌的发酵液进行化学分析，分离得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可见宿主植物与其内生真菌由于长期的共同生活因而关系非常密切。1.2 内生菌天然药物新资源及其展望研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的生理活性成分，这一发现可能在一定程度上解决了某些药物资源短缺的问题。近年来先后从红豆杉（Taxus），长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌发酵液中分离得到了和宿主植物研究相同或相似的生理活性成分。内生菌作为许多重要药用成分
11、的新来源，可工业化生产而不受土壤气候以及资源的限制，从而缓解了药物资源的短缺。目前已经从红豆杉、长春花、银杏等植物中分离出能产生活性成分的内生真菌1,2,3。1993年Stiede首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，此后对东北红豆杉也进行了研究3。云南大学张玲琪等从桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum）的茎中分离到能够产生鬼臼毒素的内生真菌4,5,6。从桃儿七植株中共分离得到28株真菌，其中有两株能够产生鬼臼毒素类似物，它们分别属于青霉属和交链孢属。1999年，中山大学王
12、伟等人从南方红豆杉(Tchinensis varmairei)中分离得到87株内生真菌，其中有6个菌株能分泌紫杉烷类化合物，它们分别属于头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌群等。通过比较发现， 以上产生与宿主相同或相似生理活性成分的内生真菌菌株之间并不存在种属联系，表明内生菌具备这一能力并不是偶然现象。这些发现掀起了一场从药用植物体内分离内生菌的热潮，为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源短缺等问题提供了新思路。另一方面，多样性的内生菌也能产生许多具有生物活性的次生产物，从而增强植物的抗逆性，表现在非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）方面，这些次生代谢产物多数具有抗菌、抗肿瘤等生物活性。本
13、研究通过分离金银花内生真菌得到产绿原酸的菌株，寻找出此类菌株是如何通过其自身次生代谢产物来影响宿主次生代谢产物的产生，探讨两者之间的相关性。并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌，通过纸片法对分离得到的能够产生绿原酸的金银花内生真菌进行抑菌学实验，验证其发酵液中的次生代谢产物具有抑菌活性。本研究为后期利用金银花内生真菌工业发酵生产绿原酸提供科学理论依据，具有很大的经济价值和研究意义。2 问题的提出在河南的道地药材中，近几年有一种药材，价格连年上涨，而且用途广泛，这就是我们关注的-金银花，金银花具有清热解毒、通经活络、广谱抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成药原料药材中几乎都有
14、金银花的踪迹，具有“中药抗生素”、“绿色抗菌素”之称。金银花的作用除药用外，其饮料、美容、减肥和保健养生的作用更为神奇，对身体所起到的巨大保护和修复作用是十分显著的。金银花既然有如此之多的用途，它起作用的活性成分什么？通过请教老师和查阅资料，得知金银花所含绿原酸是其主要的活性成分之一，绿原酸能促进人体新陈代谢、调节人体功能、提高免疫力。既然清楚绿原酸是金银花的活性成分，绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压、升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用。那么绿原酸在植物体内是如何产生的，它和土壤中的大量微生物存在有关系吗？而且在植物体内有一类微生物存活于健康植物组织内部，在长期进化过程
15、中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系，此类微生物称为内生菌。那么在金银花中有没有能产生绿原酸的内生菌。那如果能把该菌分离出来，就可以利用微生物发酵生产金银花中活性成分绿原酸了。那样就可以节约大量的土地和劳动力，又能实行工厂化生产。那么，采用什么样的技术才能分离出产绿原酸的金银花内生菌并进行培养发酵呢？于是我们开始了从金银花中分离产绿原酸内生菌的研究历程。3 材料与方法3.1试剂可溶性淀粉 天津市化学试剂三厂蛋白胨 上海东海制药厂牛肉膏 北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司葡萄糖 上海化学试剂采购供应站试剂厂硅胶H 青岛海洋化工厂甲醇 天津市风船化学
16、试剂科技有限公司乙酸丁酯 天津市风船化学试剂有限责任公司羧甲基纤维素钠 天津市福辰化学试剂厂氯仿 淄博广然化工有限公司甲苯 天津市富宇精细化工有限公司甲酸 上海三浦化工有限公司乙腈 天津市四友精细化学品有限公司以上试剂除乙腈，甲醇外均为分析纯。KNO3 ，K2HPO4 ，MgSO4 7H2O ，NaCl ，FeSO47H2O等均为天津市化学试剂三厂培养基配方PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mlPDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，自然pH以上各种培养基配制好分装完成后于121,20min的环境中灭菌。3.2 实验方法3.2.1 菌
17、株的筛选3.2.1.1 实验材料的采集选取健康金银花植株的不同组织部位（新鲜根、茎、叶、花）作为内生真菌分离的实验材料，采摘时，尽量选择植物老的组织部位，因为对老的组织采样能最大程度的发现内生菌的多样性，此外尽量选择对离地面较远的组织采样，减少因泥土溅到组织上造成的表面杂菌污染。采集后立即保存于保鲜袋内，4冰箱保存，24小时内进行内生菌的分离。3.2.1.2 样品的消毒处理金银花组织表面消毒方法的考察。将样品用自来水洗净，无菌剪刀剪成0.50.5cm2的小块，采用75%乙醇与5%次氯酸钠相结合的方法进行表面消毒。表1 金银花内生真菌分离的消毒方法方法Solution处理时间(s)Time tr
18、eated无菌水（sterilized water）30（2 times)75%乙醇（ethanol）30（1 times)无菌水（sterilized water）30 (3 times)5%次氯酸钠（NaCl0） 60（5 times）无菌水（sterilized water） 60（5 times）3.2.1.3 表面消毒效果的检测 取最后一次消毒的无菌水200L置入已消毒培养基中，紧贴培养基本表面，作为对照组，以确定金银花组织表面消毒彻底。3.2.1.4 分离与纯化 将植物组织用无菌剪刀剪成0.50.5cm2的小块，接种于PDA培养基上，并取最后一次消毒无菌水用无菌棉签涂抹于PDA培养
19、基上，作为对照。将培养基置于28暗室恒温培养5天，定时观察，当有新的菌丝或菌落出现时转接至新的PDA培养基上，直至纯化为单一菌落为止，采用PDA试管斜面培养基保存已纯化的菌种，各两只。3.2.1.5 菌种的保藏将纯化完全的菌株接种至PDA试管斜面培养基中，28暗室恒温培养，待斜面菌体生长丰满后，放入冰箱，4保存，每3个月活化转接一次。3.2.2 菌株次生代谢产物检测3.2.2.1 菌株的小样培养液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDB），100ml三角瓶装液量30ml，高压灭菌后，冷却备用。将要培养的菌株转移至PDA平板上，28暗室恒温培养至一定菌落。用7mm无菌打孔器将培养纯化完全的菌落打取相
20、同大小的菌饼接种于培养液中，每一菌株接种3瓶，以验证其重复性。28,120r/min培养96小时后，作为发酵液种子小样。移液管吸取相同体积的发酵液种子小样转接至装液量为50ml的150ml三角瓶中，28,120r/min培养96小时。3.2.2.2内生菌发酵液的提取处理将发酵好的内生菌发酵液离心(10000r/min)10min（上清液呢），过滤，浓缩，加甲醇溶解，定容至5ml，0.45m微孔滤膜过滤，置进样小瓶中备用。3.2.2.3 薄层色谱法(TLC)检测绿原酸 将处理后的发酵提取液适当浓缩作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2
21、010年中国药典附录B）实验，吸取供试品试液10-20l,对照品溶液10l，分别点于同一硅胶H薄层板上；以乙酸丁酯：甲酸：水=7：2.5：2.5的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干， FeCl3显色剂显色。3.2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸参照2010版药典进行测定，色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.4%磷酸溶液（13：87）为流动相；流速1ml/min；柱温25；检测波长327nm；进样量10L，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于1000。3.2.3 内生真菌的形态学鉴定3.2.3.1 传统鉴定方法本实验对于内生真菌进行了初步的的形态鉴定，
22、主要通过观察其孢子形态、产孢结构、产孢方式等来进行，目前主要对其进行形态学鉴定，方法如下：挑取纯化的真菌菌丝，分别接种于PDA和察氏培养基上，采用3点接种法培养，肉眼观察菌落正反面特征；采用插片培养法对孢子进行显微观察。参照真菌鉴定手册进行鉴定，可将内生菌初步鉴定到属水平。如果更加准确的鉴定需要做分子生物方面的研究，由于时间的限制，未对菌株做分子生物学方面的实验。3.2.3.2 分子生物学鉴定方法传统的内生菌鉴定方法过于繁琐和复杂，而微生物的形态学特征和生理生化特征是有其内部的核酸分子所决定的，因此对筛选得到的菌株，通过对内生菌ITS rDNA 序列的分析进行鉴定，并利用DNA man 软件构
23、建系统发育树鉴定内生菌已经成为菌种鉴定的主要方法。3.2.4 二次发酵培养基的优化3.2.4.1 固体基本培养基的选择将菌株B-4-15接种于PDA平板上，28，倒置培养，待菌落生长为培养皿1/3时，用无菌打孔器沿着菌落边缘打取相同大小的菌饼，直径为5mm，分别转接至各种供试固体培养基上。置恒温培养箱中，28，倒置培养。以菌落的生长速度及长势为指标，选择最适合于菌株生长的固体培养基。3.2.4.2 液体基本培养基的选择制备菌株种子液，并以10%接种量接入到下列液体培养基中：玉米粉葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基，28,120r/min摇床培养至菌球分散均匀。培养结束后，测定菌
24、株B-4-15的菌丝干重；将发酵液进行提取，利用高效液相测定绿原酸含量，从而确定最佳液体培养基。3.2.4.3 发酵条件的单因素优化碳源的选择以选择出的最适液体培养基为测定碳源的基本培养基，分别以以下碳源代替培养基中的碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖。培养条件及测定方法同液体培养基的选择一致。氮源的选择以选择出的最适液体培养基为测定氮源的基本培养基，供试氮源分别为硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、尿素，培养条件及测定方法同液体基本培养基的选择一致。温度的选择已选择出的最适液体培养基为基本培养基，分别在26、28、30、32的条件下进行培养，培养条件及测定同上。3.2.4.4 发酵条件的正交试验发酵条件的单
25、因素优化只能客观评价培养基中各成分所起的作用，而对于培养基整体而言还需要做下一步的实验工作，接下来会以菌株中绿原酸含量为指标，进行发酵条件的正交实验，优选最佳的碳源、氮源浓度和最佳培养温度。以上述试验选择的碳源、氮源、温度、pH值这4个因素分别选取3个水平，进行L9(34)正交试验，在最适温度下进一步优化发酵试验，正交试验各因素及水平见表1：表2 正交试验因素水平因素水平123A 碳源浓度1.5%2%2.5%B 氮源浓度0.2%0.25%0.3%C pH6.5%7.0%7.5%D 温度2628303.2.5 金银花内生真菌的抑菌实验将3株内生真菌接种于PDA培养基上培养，待菌落生长为培养皿1/
26、3，7mm打孔器打取菌饼转接至PDB培养液中发酵，摇床120r/min，28恒温培养96小时，将发酵液10000r/min离心10min，取上清液至小瓶中备用。抑菌活性测试采用纸片扩散法：将金银花内生真菌代谢产物分别配成1mg/mL的甲醇溶液，然后去50L的各菌株次生代谢产物溶于小滤纸片，使其充分吸收，平方与分别含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的琼脂水培养基上，每株真菌对3中测试菌分别作3个重复，金银花提取液作为阳性对照。将制好的培养皿在37恒温培养24小时后观察，测定其抑菌圈大小。4 结果与分析4.1 菌株筛选的结果将金银花不同组织部位（根、茎、叶、花）先在自来水下冲洗干净，去除表面的
27、泥土与灰尘，无菌滤纸吸干表面水分，然后按照以上程序进行表面消毒。表3 金银花不同组织的内生真菌种类及分布部位菌株数（株）涉及属的数目（株）占总菌株数的比例涉及属占总属数的比例根21426.58%44.44%茎25731.65%77.78%叶17421.52%44.44%花13516.46%55.56%总计799100%100%通过对金银花内生真菌的分离，共得到内生真菌79株，其中从金银花根部分离得到21株，约占26.58%；从茎部分离得到25株，约占31.65%；从叶片中分离得到17株，约占21.52%；花蕾中分离得到13株，约占16.46%。由此可知金银花茎中内生真菌种类丰富，其次为根和茎，
28、花中内生真菌数量最少。本实验表明了在健康的金银花组织中存在着丰富的内生真菌，而其种类与数量则与其分离部位有关。4.2 菌株次生代谢产物检测结果4.2.1 薄层色谱法(TLC)检测 采用薄层色谱法进行初选，筛选出的三个菌株的次生代谢产物疑似绿原酸，三株菌株与绿原酸对照品具有相同的Rf值，且Rf值在0.5左右。薄层层析图谱如下：图1 三株菌株发酵液薄层色谱图A:A-3-24，B:B-4-15，C:B-4-31,D:绿原酸对照品，E：金银花提取液Rf值：A:0.451, B:0.452, C:0.449, D:0.449, E:0.4524.2.2 高效液相色谱法(HPLC)检测采用高效液相色谱法进
29、一步确认：三株内生真菌A-3-24，B-4-15，B-4-31与绿原酸对照品保留时间相近，均在7.915min左右。三株菌株发酵液与绿原酸品液相色图谱如下：7.915min 图2 绿原酸标准品发酵液液相色谱图6号峰，保留时间为7.915min。峰面积为2148992.77.915min图3 菌株A-3-24发酵液液相色谱图15号峰，保留时间为7.915min。峰面积为257018.07.933min图4 菌株B-4-15发酵液液相色谱图14号峰，保留时间为7.933min。峰面积为160309.27.928min图5菌株B-4-31发酵液液相色谱图12号峰，保留时间7.928min。峰面积为1
30、65023.6标准曲线的绘制：通过改变进样体积，得到不同进样量X下的峰面积Y，进而绘制标准曲线：Y=222428x-88456,R2=0.9992。表4 标准曲线的绘制表5 三株内生真菌发酵液绿原酸含量计算液相编号保留时间/min峰面积含量（g/ml）标准品7.9152148992.776.8A-3-247.915257018.011.928B-4-157.933160309.28.588B-2-317.928165023.68.752其中，24，15，31号样品与对照品保留时间基本一致，说明24，15，31号内生真菌菌株的发酵液可能含有绿原酸类物质。根据三株内生真菌发酵液液相分析，保留时间与
31、对照品保留时间一致，可以看出三株内生真菌发酵液中含有绿原酸。4.3 内生真菌的形态学鉴定结果4.3.1 传统鉴定方法4.3.1.1菌株形态学描述 图6 A-3-24菌落形态 图7 B-4-15菌落形态图8 B-4-31菌落形态表6 三株内生真菌生理形态描述菌株颜色菌丝培养基边缘分泌物A-3-24黄色辐射状生长结合牢固不整齐无B-4-15黄色干燥结合牢固整齐红色液滴B-4-31淡绿色干燥，皱缩结合不牢固不整齐无色液滴4.3.1.2 显微形态鉴定通过对三株内生真菌的菌落形态及显微形态观察，观察其孢子形态，产孢方式，孢子囊及孢子柄等显微形态来初步推测菌株的分类地位。三株内生真菌的显微形态如下： 图9
32、 菌株A-3-24镜下特征(1040)（孢子及孢子柄显微形态）图10 菌株A-3-24镜下特征(1040)（孢子囊及孢子柄显微形态）图11 菌株 B-4-15镜下特征(1040)（孢子囊及孢子柄显微特征）图12 菌株B-4-31镜下特征(1040)(孢子囊及孢子形态)根据对三株内生真菌镜下显微形态的观察，初步鉴定结果如下：表7 三株内生真菌显微形态描述菌株显微特征孢子分生孢子梗真菌菌丝分类归属分离部位A-3-24圆形，孢子浅红色孢子梗细长，无分支菌丝有分支，有隔毛霉属叶片B-4-15圆形或类圆形，孢子单生分生孢子聚集在分生孢子梗顶端呈头状。菌丝有分支，无隔 青霉属花B-4-31孢子单生，颜色淡
33、绿色分生孢子梗细长，有分支菌丝体细长，有分支曲霉属花表8 金银花不同组织的内生真菌种类及分布属（Genus）根（Root）茎（Stem）叶（Leaf）花（Flos）总计（Total）毛霉属（Mucor）01135青霉属（Penicillium）983225链格孢属（Alternaria）11013犁头霉属(Absidia)01001头孢霉属(Cephalosporieae)10203头珠霉属(Piptoaephalis)13004串珠霉属(Monilia)01304丛梗孢属(Moniliaceae)11125曲霉属（Asqergillus）03014未确定(Unknown)877325总计（T
34、otal）21251713794.4 二次发酵条件的优化结果4.4.1 固体基本培养基的选择结果图13 三种培养基生长曲线（以菌落直径为指标）由图13可以看出，前几天菌株B-4-15在PDA培养基上菌落的长势略好于豆芽汁与玉米粉培养基，第四天后PDA培养基生长的长势渐缓，菌落边缘整齐。而在豆芽汁与玉米粉培养基上却生长迅速，第6天时已经长满全皿，测量结果不能准确反映菌株的生长差异，故本实验并未对菌株后期的生长进行测定。4.4.2 液体基本培养基的选择通过改变进样量体积，得到不同进样量X下的峰面积Y，进而绘制标准曲线：图14 B-4-15在玉米粉葡萄糖培养基中的生长曲线及绿原酸含量图15 B-4-
35、15在马铃薯蔗糖培养基中的生长曲线及绿原酸含量图16 B-4-15在豆芽汁葡萄糖培养基中的生长曲线及绿原酸含量比较菌株B-4-15在不同培养基中的生长曲线及产生的次生代谢产物含量，可知，在不同发酵液中B-4-15的绿原酸产量和生长量都不相同。菌株B-4-15在这些培养基中产生的菌丝体最大干重次序为：马铃薯蔗糖培养基豆芽汁培养基玉米粉培养基。绿原酸产量在马铃薯培养基中产量最大，且在第5天后绿原酸含量降低，而在玉米粉中绿原酸最低。故选择马铃薯蔗糖培养基作为最佳液体发酵培养基，最佳提取时间为第5天。4.4.3 纯化分离出的菌株发酵液形态图17 菌株A-3-24发酵液形态(菌球分散均匀，颜色黄色，大小
36、适度)图18 菌株B-4-15发酵液形态（呈现出良好的发酵形态，孢子形成菌球后大小均匀，菌球四周稍带菌毛）图19 菌株B-4-31发酵液形态（菌球白色，个体较大，分散较均匀）在菌株发酵实验过程中，应在锥形瓶发酵液中加入几小片碎玻璃，这样在摇床不断转动过程中会使孢子分散均匀，从而使发酵液菌球均匀。4.4.4 发酵条件的单因素比较对不同碳源、氮源、pH值及温度的发酵液进行高效液相测定，得到不同进样量X下的峰面积Y，绘制标准曲线：Y=539427x22782，R2=0.99964.4.4.1 碳源的选择通过改变马铃薯蔗糖培养基中的碳源，比较B-4-15在培养基中的生长量和绿原酸含量的变化。图20 不
37、同碳源对B-4-15产生菌丝体重及绿原酸含量的影响通过图20可以得知，不同碳源对菌株B-4-15产生菌丝体重及绿原酸含量的影响不同，菌株在以蔗糖为碳源的发酵液中产生的菌丝体重及绿原酸含量最高，葡萄糖中最低，在淀粉及乳糖中产生菌丝体重及绿原酸含量的变化相近，因此选择蔗糖为最佳碳源。4.4.4.2 氮源的选择图21 不同氮源对B-4-15产生菌丝体重及绿原酸含量的影响由图21可知，菌株B-4-15在以蛋白胨为氮源的培养基中菌丝体的生长量最高，在绿原酸的产量方面，以添加蛋白胨的绿原酸含量最高，加入硝酸钠和硝酸铵的最低，所以综合考虑之下选择蛋白胨为最佳氮源。4.4.4.3 温度的选择图22 不同温度对
38、B-4-15产生菌丝体重及绿原酸含量的影响由图22可以看出，温度过高或者过低，都不利于菌株在液体发酵培养基中的生长，所产生的菌丝体及绿原酸含量亦会降低，适当的温度则会增加细胞的生长速率，促进菌株的次生代谢，综上所述，本结果中显示最适合菌丝体生长和绿原酸含量积累的温度为28，故选择28作为B-4-15的发酵温度。表 9 发酵条件的单因素优化结果编号因素结果1碳源蔗糖2氮源蛋白胨3温度284pH7.0通过对发酵条件的摸索，得到基本发酵培养基为PDA培养基，考虑到蔗糖价格便宜，且在实验过程中与葡萄糖起到相同的实验作用，故选择主要碳源为蔗糖，主要氮源为蛋白胨，温度选择在28,pH为7.0。4.4.5发
39、酵条件的正交试验表10 四因素三水平正交试验试验号ABCD菌丝干重绿原酸相对含量列号蔗糖蛋白胨pH值温度mg/mLmg/ml111110.840.74212220.430.32313330.460.35421231.481.22522310.580.30623120.910.87731320.290.16832130.240.23933210.680.57K11.732.611.992.10-K22.971.252.591.63-K31.212.051.332.18-K11.412.121.841.61-K22.390.852.111.35-K30.961.790.811.80-表11 发酵条
40、件对菌丝干重影响的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性葡萄糖0.60320.30211.601*蛋白胨0.30820.1545.926-pH值0.22220.1114.268-温度0.05220.026-表12 发酵条件对绿原酸产量影响的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性葡萄糖0.36520.17810.476*蛋白胨0.28920.1458.509-pH值0.31420.1579.222*温度0.03420.017-由表10、11、12可知，9个正交试验中，以A2B1C2D3为最佳组合，即蔗糖2.0%,蛋白胨0.2%，pH值7.0，温度30时，菌丝重量与绿原酸含量相
41、对含量均达到了最大值。通过比较单因素实验优化后的结果，采用最佳组合为马铃薯培养基，其中加入蔗糖2.0%，蛋白胨0.2%,pH值7.0，培养温度为30的条件。初始培养基为马铃薯蔗糖培养基，自然pH值，同时在30的条件下培养菌株B-4-15，测得最佳配比培养基中菌丝重量为1.48mg/mL，绿原酸含量为1.22mg/mL；初始培养基条件下菌丝干重为0.31mg/mL，绿原酸含量为0.17mg/mL，正交试验优化培养基下菌丝最大生长量增大了4倍，绿原酸含量增加了7.18倍。经过单因素和正交试验的优化，使得菌丝重量和绿原酸含量都得到了一定的提高，初步选择出了最佳发酵培养基。4.5 抑菌实验结果表13
42、内生真菌抑菌圈直径（cm）三组重复内生菌指示菌金黄色葡萄球菌（cm）大肠杆菌(cm)绿脓杆菌(cm)A-3-24B-4-15B-4-31表示抑菌圈直径10mm；表示抑菌圈直径10mm； 表示无抑菌活性；实验设定三组重复，表示抑菌圈直径10mm；表示抑菌圈直径10mm；表示无抑菌活性；根据实验结果可知，菌株对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌具有较强的抑菌活性，而对大肠杆菌则表现出较弱的抑菌活性；菌株A-3-24、B-4-15表现出的抑菌活性较强，菌株B-4-31表现的抑菌活性较弱；分析原因可能是菌株B-4-31发酵液中绿原酸含量较低造成抑菌圈直径较小。金银花提取液A-3-24B-4-15B-4-31图2
43、3 金银花内生真菌对金黄色葡萄球菌抑菌结果5 结论与讨论5.1 通过对金银花内生真菌的分离，从其不同组织部位共分离得到内生真菌79株，其中从根中分离得到21株，茎部分离得到25株，叶中分离得到17株，花蕾中分离得到13株，表明了在健康的金银花组织内部存在着丰富的内生真菌，而其种类和数量则与其存在部位有关。5.2 本实验采用了常规形态学与显微鉴定相结合的方法对金银花内生真菌进行了鉴定，确定了其归属，但还需要在后期的实验过程中利用测定内生真菌DNA中ITS序列的方法进行进一步的验证，为以后进一步掌握和研究金银花内生真菌奠定基础。5.3 TLC分析显示三株内生真菌的发酵液与绿原酸对照品Rf值相近，H
44、PLC进一步分析显示三株内生真菌发酵液与对照品有相同或者相近的保留时间。综合TLC与HPLC分析，推断三株内生真菌次生代谢产物中可能含有绿原酸类成分。5.4 内生真菌在发酵过程中，不同的发酵温度、pH值、碳源和氮源浓度都会影响其有效成分的种类及含量。相应的，也很可能会产生不同种类的代谢产物。5.5 在金银花内生真菌抑菌学实验中，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌，通过纸片法法对分离得到的能够产生绿原酸金银花内生真菌进行菌株抑菌学实验，以验证这些分离得到的金银花内生菌菌株是否具有抑菌活性。根据实验结果可知，分离得到的A-3-24， B-4-15，B-4-31，这3株内生真菌对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌具有较强的抑菌活性，而对大肠杆菌则表现出较弱的抑菌活性。6 展望6.1 通过溶磷菌、溶钾菌、固氮