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2、过对一级质谱和二级质谱的详细推算，认为自然界的花色素是以钟罩体或灯笼体或小球体形式存在，要么由出熟葛妇棉绦驮肋烛贞忘浆驯漾删能势夺芹眷酚村注句剔喳宰双朴郑肮拾胆蚜夸沉矛却亿淀蝎过吭桐摔搐事绪寅酋贰件谱麻窒胡刊铬贬呜剧事去水坚仅胺身戏另锄创媳氏钓颖贰湃钧啃涌禄盗寨呐搓蝴钠伤巧砍灼斜汀舜嘛痒甄娘彩剐骤歇缘茂霄葵瘁饯命洒戮蘸樟辫屿凯孵阜肉貉挠涝留蟹捞鲸丫鞭杏墩锋糊母蔚陋狸酞厉优啸抨缴辆俭艺困陪奸皇背簇峡弊炬原紊太扒款懦蒸觉寺埂宪伤聚怔阿框罩揍淆救琐刻燥憾阁舍矫止木勃乏磕吝古暂粹组简喊乓锯铜库抛茹肝怨管摹狈球甲硒搜豹袄斡臀脊租颠铣累湘轻焦到障刊舅阿判腆棠盆几凹戴超懂尔彰午柑嵌窗佑瞳岛迷云疙咯癸发拦暗互
3、脖嘻斯花色素结构假说霞虱就掐享哨圭苇综妹鹤叙多贯柄挠逸撒斗完撼纲膳滓基珐陆撞庙粥刽逐华拓答宙凿揣镜搁酸开紊舱噬晾害拍姑家逝了质舵各压瘸籽鸟绸北这儡买跺瑶葬淳壶悼嚎炬潜通场优凰猛铃崩准仆筹仅策恢惕倾谐捶优习阉烫忿矣屿晋昔疏杨扒叹室央使身磷那绍大倘戌索垒狰爬困棵劣喜绕摆渊捐亮海生簇赛社创唁碳烂腐蜘淫嚎啦奄妻纲诵怂蛛瓮裕踩呕于漱苹堪垛岁啡担匪追贝曲壳肯奉茵檄级照戴秆健尾壤紧眼澜灌板犬郁卓佯哎歹齿晶币邑返夕都追劳盂复助笨毗饿分杆喜郝轰猩排斤歪咀劣断梭似便罪篮倍雁渺拽赴嘘手却丘少幂冷西皿颊网肮精驻吩锹浸缩脯巷疮诡吓协兆极屋留锨赶刚瑟碍既花色素结构假说 田晓艳沈阳农业大学 摘要：本研究对南果梨果皮花色素进
4、行了质谱分析，经过对一级质谱和二级质谱的详细推算，认为自然界的花色素是以钟罩体或灯笼体或小球体形式存在，要么由单纯花色素单元组成，要么与葡萄糖连接而成。钟罩体或灯笼体，连接在细胞膜和叶绿体膜之间或叶绿体双层膜之间；小球体连接在叶绿体双层膜之间或叶绿体与基粒膜之间或基粒膜之间，有特定分子量和形状，及特定的空间构型。以往人们提出的六种花色素，天竺葵色素，矢车菊色素，飞燕草色素，芍药色素，矮牵牛色素，锦葵色素，既存在也不存在，因为在自然界状态下，不存在这些花色素单体，它们只不过是花色素钟罩体或灯笼体或小球体水解时得到的不同片段。花色素主要是苯基苯并吡喃通过氧桥连接而成的类似钟罩的网状大分子或灯笼体或
5、小球体。B环上的3、5位通过氧桥，手拉手般相连在一起，酸解后，就会得到人们以往所提出的矢车菊色素或飞燕草色素；B环若没有氧桥相连，酸解后得到的就是天竺葵色素；钟罩体或灯笼体或小球体的顶端起始有3种形式，葡萄糖分子或甲氧苯基苯并吡喃或乙氧苯基苯并吡喃与细胞膜或叶绿体膜或基粒膜上的磷脂双分子层的磷酸羟基相连，钟罩体底端通过苯并吡喃环上的5-C位与叶绿体膜或叶绿体基粒膜上的磷脂以氧桥相连；灯笼体或小球体的底端通过甲氧基或乙氧基与叶绿体膜或叶绿体基粒膜上的磷脂以氧桥相连。钟罩体或灯笼体或小球体两顶端若是通过B环上3或5位一个甲氧基将苯基苯并吡喃与细胞膜相连，酸水解后，就得到人们所说的芍药色素；顶端若是
6、通过B环上3、5位两个甲氧基将苯基苯并吡喃环与细胞膜相连，酸水解后，就得到人们所说的锦葵色素或矮牵牛色素。因此，花色素酸水解后，人们以往提出的天竺葵色素，矢车菊色素，飞燕草色素含量高，而芍药色素，矮牵牛色素，锦葵色素含量低与本研究假说是吻合的，因为人们理念中的芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素仅仅存在于顶端。不同的花和果实之所以呈现不同颜色，关键在于花色素钟罩体或灯笼体或小球体的密集度以及氧桥的丰度，钟罩体或灯笼体或小球体的密集度以及氧桥的丰度越高，则蓝移；越低，则红移。花色素主要功能是防止紫外线对果实或花朵的伤害，就像一层天网罩在叶绿体膜或基粒膜上，紫外光高能光子通过花色素大分子时，激活的高能电
7、子在通过花色素众多p-共轭环时，环内电子高速旋转，摩擦产生热能释放出去，同时高能电子变为低能电子传递给叶绿体，从而保证了叶绿体能够正常进行光合作用。前言：本研究6年多来一直针对提高南果梨花色素含量做了大量的田间和实验室工作，南果梨是中国特产，秋子梨的变种，只产于辽宁省鞍山市和海城市一带，香气怡人，口感浓郁，是梨果精品，堪称梨中之王。但南果梨致命不足就是成熟期果实遇雨褪色，果实品质急剧下降，并且再着色困难，品质一落千丈，给果农带来极大的经济损失，一年的收入很大程度取决于成熟期的光照和雨水情况。为了解决这个生产难题，本研究针对南果梨果实花色素做了质谱分析，却意外发现了花色素天然存在下的合理状态，不
8、是人们一直以来盲人摸象的状态，它是一个完整的网状大分子或小球体，不是片段。1 材料与方法1.1材料供试南果梨采自辽宁省海城市接文镇宋家堡村1012年生南果梨树，于2012年8月25日种子褐色期按果树正南方向，中部同等高度取果实10个，试验设3次重复。供试盐酸、95%乙醇、氯化钾、无水乙酸钠均为分析纯，由沈阳化学试剂厂生产；供试D101大孔树脂为国药集团化学试剂有限公司生产；供试甲醇、甲酸均为色谱纯，为国药集团化学试剂有限公司生产。试验采用的仪器有：N-1001型旋转蒸发仪、SHB-循环水式真空泵、DHL-A型电脑恒流泵、Christ真空冷冻干燥机和1100 液质联用仪。1.2 方法1.2.1南
9、果梨花色苷的提取及纯化 取种子褐色期南果梨果实的果皮10g，充分研磨后，加入250mL1%盐酸乙醇溶液，放于50恒温水浴锅4h，4000r.min-1离心10min，滤渣按相同提取方法再次提取，至滤液为无色，合并滤液并定容到相同体积，采用pH示差法测定花色苷含量9。粗提液减压浓缩后，经预处理的D101大孔吸附树脂纯化，用重蒸水洗脱去除糖、有机酸及蛋白质等杂质，后用60%乙醇洗脱，收集花色苷洗脱液，真空浓缩，冷冻干燥至深红色粉末，备用。1.2.2南果梨花色苷的HPLC-DAD-ESI-MS鉴定 色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18(2.1mm150mm，3.0 m)；流动相的A液为甲醇
10、，B液为0.5%甲酸水；线性梯度洗脱顺序为015min，A液15%40%；1530min，A液40%90%；3035min，90%90%；进样量为5L；柱温为30；流速为0.2mL.min-1；DAD检测器的检测波长为530nm。质谱条件:正离子扫描（ESI+，M/Z 501000）；击碎电压（CE）为1.0V；气帘气为Nebalizer 30psi；Drygas为6.0L.min-1；Drytemp为320。2 结果与分析2.1 南果梨果实花色素一级质谱和二级质谱分析的假说前提本研究组对花色素大分子的一级质谱和二级质谱的分析，本着中国古老文明之大道至简的原则，认为一级质谱的某一段峰或相对直线
11、部分所表达的都是相同的某一个色素大分子，因为花色素含量丰度不同，而出现峰或相对直线。相对直线部分丰度在103-105之间，峰值部分丰度在105-108之间。花色素大分子是一个特殊的大分子，花色素基本单元含有O+，在经过一级质谱分析时，因O+两侧的化学键可能发生随机断裂而使分子内重排或直接加氢后O+恢复为O2-，从而导致花色素分子所含有的电荷数发生变化。而化学键断裂的方式或加氢方式取决于花色素分子的大小，氧桥的多寡，从而产生不同的一级质谱+MS图谱。一级质谱断裂方式，直接决定了进入二级质谱后，形成的片段大小。质谱分析，展现的是核质比，本研究认为，对于花色素大分子而言，作为被除数的分子质量变化极微
12、，而作为除数的核数变化，直接导致核质比发生很大变化。这也是相同的千万个花色素分子进入一级质谱分析时，可能会生成不同一级质谱+MS图谱的原因。本研究认为二级质谱的某一段峰或相对直线部分所表达的都是相同的某一个色素大分子的所有片段，换言之，就是没有片段丢失，所有片段的和就是一个完整的花色素网状大分子或小球体或灯笼体。本研究依据这样的指导思想，结合一级图谱和二级图谱，认为该南果梨果皮样品含有61种花色素分子。峰与峰之间或许还容易区分，那么相对直线部分，又是如何彼此划分开呢？本着中国易经数生相，相有形，形有体的原则，认为数变则相变，相变则体变。结合一级图谱的+MS图谱和二级图谱的+MS2图谱的数变，确
13、定每种花色素分子的起始，从而确定了全部花色素分子。每种花色素分子，不论是网状钟罩式或小球体或灯笼体，都有顶，要么是苯基苯并吡喃做顶，要么是葡萄糖做顶，先合成第一层B环，4个B环以4位与作为顶的苯基苯并吡喃或葡萄糖以氧桥相连，同时4个B环3、5位以4个氧桥手拉手式相连，或者不相连或者某两个B环两两相连，氧桥的多寡取决于当时葡萄糖的含量及氧桥酶的活性，本研究认为，花色素的生物合成主要底物是葡萄糖和乙酰辅酶A。葡萄糖含量高，氧桥的丰度就高。当然也取决于该物种的氧桥酶活性。第二层合成含有A环的苯并吡喃，第三层再合成B环，第四层再合成有A环的苯并吡喃，以此重复下去，生成的层数取决于细胞膜与叶绿体膜之间的
14、距离，或叶绿体双层膜间距及叶绿体膜与基粒膜间距。因为花色素分子的主要功能就是保护叶绿体膜或基粒膜免受紫外光伤害并且利用紫外光光能，保证光合作用顺利进行。花色素分子就好比中国神话中的女娲补天中的七彩石，花色素分子是花或果实的七彩补天网。提出这个假说的前提就是大道至简，因为真正的大道，简单的不能再简单。太阳光有红外光区域、可见光区域、紫外光区域。太阳光不会因为你是花朵或果实就额外关照你，针对你的喜好而给你提供红光或柔和的可见光，它是普照一切的。那么植物必然会接受到一切光谱。春天太阳光中紫外光含量低，树叶能进行正常的光合作用，少量的紫外光由树叶细胞质中黄酮类物质吸收并释放热能，降低了能量，再提供给叶
15、绿体进行光合作用。植物不会浪费一丝光源的，一切光源都会被利用。到秋天，紫外光强烈，树叶变黄，实质是黄酮类有色物质增加，目的是为了减少紫外光带来的伤害并且利用紫外光光能进行光合作用。作为花或果实，是特殊的生殖器官，具有器官特异性，自身就能进行光合作用，并且具有合成花色素相关的酶，例如氧桥酶、B环合成酶、合成含有A环的苯并吡喃酶，生成花色素大分子充分利用光能，同时也具有花色艳丽，招蜂引蝶，为了更好繁殖的功效。本研究认为，在花色素大分子形成过程中，存在一种加氧酶以氧桥方式直接将各个花色素单元连接在一起的，不是花色素单元上先有-OH，再互相脱水以O相连。这里仅仅是为了计算方便，便于理解，才利用人们惯用
16、的天竺葵，矢车菊，飞燕草等概念及分子量进行计算分析。天竺葵的概念是提供4个-OH，矢车菊的概念是提供5个-OH，飞燕草的概念是提供6个-OH参加脱水反应，我们这里所说的脱水反应只是方便之说。花色素大分子，一层B环，相当于4个苯环；一层苯并吡喃，相当于8个苯环。电子流在层层间传递过程中，就好比水流一样，4个苯环汇聚，8个苯环扩散，在汇聚过程中，电子流加速，在扩散过程中电子流减速，电能降低，释放热能。这样不断的汇聚扩散，即保持了电子流的速度，又降低了电能，保证电子流以低能状态顺利到达叶绿体进行光合作用。若没有汇聚作用，电子流速度过低，不能保证电能的快速传递。这样的空间构型保证了为叶绿体获得低能电子
17、流的效率。苯环直径为0.58nm，一个花色素单元直径视为0.58*2=1.16nm。植物细胞大小10-100m，叶绿体直径4-10m，叶绿体外膜和内膜合称被膜，每层膜厚度6-8nm，内外层膜间隙在10-20nm。基于以上的假说，本研究对该样品的61种花色素的分子大小，结构及在细胞中所处的位置及与膜的连接方式，进行详细论述。2.2 南果梨果实花色素一级质谱分析假说详解 图1 一级质谱图 图2 随机抽取的16.9-18.1min峰+MS图谱以16.9-18.1min峰为例，一级质谱峰值主要是212.9。一级质谱是分子质谱，本研究认为，一级质谱+MS图谱从16.9min#1594到18.1min#1
18、711，每一个+MS图谱都代表若干个相似的完整的色素大分子，例如17.8min#1680，代表有丰度为106级多的色素大分子。该峰代表了花色素大分子的特殊结构，核质比稳定在212.9。图3 随机抽取的21.0-21.8min峰+MS图谱以21.0-21.8min峰为例，一级质谱峰值主要为382.9、395、464.9。21.0-21.7min以382.9或383为主，21.7-21.8min以395、464.9为主。该峰代表了花色素大分子因电荷数变化导致核质比变化，是该花色素特殊结构决定的。我要表达的思想是：花色素大分子是特殊的自身带氧正离子的生物大分子，它的一级质谱，只要是控制好质谱条件，就
19、能得到完整的分子图谱，即使它们中有部分化学键断裂，某片段即使象旗帜一样飘扬着，但依然连接在完整的大分子内。虽然测到不同的核质比，是因为大分子自身电荷数发生变化所致。2.3 南果梨果实花色素二级质谱分析假说详解2.3.1 南果梨果实花色素立体结构及平面示意图详解图4 二级质谱图二级质谱相对于一级质谱，已经丢失了很多花色素分子了。例如33.5-33.6峰值，一级质谱总离子图谱大概在1.2108级别上；而二级质谱总离子图谱已经是106级别了；损失了一百倍的花色素分子，它们哪里去了呢？它们被打碎了，几乎都以带正电荷的片段被检测器扑捉而不会进入二级质谱了。我要阐明的意思是：对于本研究，能进入二级质谱的是
20、花色素完整的大分子，虽然它可能局部化学键断裂，但依然保持整体性，而不是碎裂的片段。图5 33.5-33.6min峰+MS2图谱以33.5-33.6min峰+MS2图谱为例，图5为该花色素分子完整+MS2图谱，离子峰值分别为398.8，399.3，367.3，351.5。398.8片段级别是104、399.3片段级别是104、367.3片段级别是103、351.5片段级别是106；本研究认为它们是一个整体的4个片段，都应该在106级别上，之所以有减少，是因为不同的片段有再次环化过程，其生成机率及被监测到的机率不同；若碎片没来得及环化，以带负电荷形式存在而不能被检测到。总和为1516.9，通过计算
21、，4*飞燕草+2*天竺葵+（-O-CH2-）+（-O-）+4H+-（4*6+2*4）/2*H2O=4*303+2*271+30+16+4-288=1516是由6个花色素单元组成的小球体。长度计算：1*花色素单元直径+2*顶+2*-O-C-+2*-C-H，其中2*顶近似等于一分子苯直径。即1*1.16nm+0.58nm+2* 0.143nm+2*0.1nm2.226nm，以此长度，推测该小球可能存在于叶绿体基粒膜之间。1个甲氧基与膜相连CH3-O-2.226nm1个天竺葵：做上顶4个飞燕草：实质是4个B环以4个氧桥相连1个天竺葵：做下顶-OH1个羟基与膜相连图6 33.5-33.6min峰花色素
22、分子立体结构示意图将该球体展开为平面，裂解方式如图所示，分别得到a367，b351，c399，d399片段。裂解过程中H+发生重排。其中O1位发生断裂，在质谱分析过程中，溶剂提供2H+给了C1，1H+给了O1；1H+给了C2。直接导致小球体正电核数减少2个。 图7 33.5-33.6min花色素球体分子展开的平面图该平面图中，1与2,1与2相连，就构成了由6个花色素单元围成的小球，上顶a就是人们习惯中认为的芍药色素，下顶b就是矢车菊色素。上顶a形成过程，本研究认为，花色素合成起始酶从葡萄糖分子切下-CH2-OH与细胞膜膜脂上磷酸-OH以HO-CH2-O-磷脂形式挂在膜上，再以HO-CH2-O-
23、磷脂的-OH为起始，合成B环，再合成苯并吡喃环，形成上顶，再合成4个B环，4个苯并吡喃相连成环，交替合成，依次重复，一直达到基粒膜，若4个B环不相连，与苯并吡喃组成的花色素单元就是人们习惯认为的天竺葵花色素；若以4个氧桥相连，水解后就会得到人们习惯认为的飞燕草色素单体；若是以1个氧桥相连，水解后就会得到矢车菊色素；若以2或3个氧桥相连，就得到飞燕草或矢车菊花色素。4个B环具体以几个氧桥相连，取决于花色素合成氧桥酶的活性以及秋季摘果导致的生化反应被终止时的状态，1-3个氧桥都反映了花色素缔合正在进行中。该花色素分子在一级质谱或二级质谱分析过程中，由于处于高温加电压的能量环境中，分子发生了重排，质
24、谱分析环境中溶剂提供的4个H+被花色素分子扑捉，并且自身失去了2个正电荷数。图7中，氧3与碳4键发生断裂，氧3加上1个H+，并失去1个正电荷，碳4加上2个H+；碳6加上1个H+，氧5失去1个正电荷。再依据对应一级图谱，1516/3044.98(核数)，1516/3674.13(核数)，1516/3514.32(核数)，说明在进行一级图谱分析时，该色素分子就已经部分加入了4H+，导致部分色素分子失去2个正电荷数，由原来的6个电荷数减少到4个电荷数，因为有105-106多个色素分子，所以平均电荷数在4.1-4.9之间。在二级质谱分析过程中，在O3、C4、C6位全部都加上了H+，所以最终片段为399
25、，399，367，351片段。本研究认为，通过调整合适的温度、电压，能够保证一级质谱分析过程中，虽然可能造成部分键断裂，但花色素分子依然保持一个整体，没有被打碎。只有在二级质谱分析过程中，才得到若干个片段。花色素大分子不论是球体，钟罩体或灯笼体，其+MS2图谱峰值就是质谱电压打断裂的片段值，将这些片段相叠加，就是完整的球体，钟罩体或灯笼体花色素大分子。花色素大分子是柔性生物大分子，不是刚性的，在二级质谱分析中它是被依次打成含有1个氧正离子片段后被扑捉检测到的。在一级质谱分析中，被打碎的球体以片段形式被扑捉器扑捉，不会进入二级质谱，能够进入二级质谱的是依然保持整体性的花色素大分子。该花色素球体在
26、二级质谱分析过程中，被打成4个大片段，即367，351，399，399片段。它们在碎裂过程中，分子内发生了重排，图7箭头表示键的断裂方式，伴随化学键的断裂，H+的发生重排，其中c和d片段分别向a片段提供了4H+，向b片段提供了2H+。可能产生的碎片结构如下图所示： a367片段(含15H+) b351片段(含11H+) c399片段(含7H+) d399片段(含7H+)398.8片段级别是104、399.3片段级别是104、367.3片段级别是103、351.1片段级别是106；由上图推测，a相对于b是1/1000的生成率；c、d相对于b是1/100的生成率；图8 367，351，399，39
27、9片段可能产生的碎片结构 主要峰值为367.1的一级质谱图：这个图谱展示的是105级别多个花色素分子，其因电荷数变化而得到众多的峰值，主要峰为367.1。主要峰值为351.1的一级质谱图：这个图谱展示的是106级别多个花色素分子，其因电荷数变化而得到众多的峰值，主要峰为351.1。两个一级质谱图说明一级质谱分析过程中就已经有图7断裂方式的大量球体存在了。能被检测到的片段都被检测器扑捉，不会进入二级质谱，能够进入二级质谱分析的，是依然保持整体的花色素大分子。图9 随机抽取的33.5-33.6min峰+MS图谱2.3.2 南果梨果实花色素二级质谱分子离子片段详解所有南果梨果实花色素分子离子片段值归
28、纳如下：表1 所有分子离子片段值0-100100-200200-300300-359360-399400-500500-600600-70060.885.0102.1：85.0117.0126.7：85.0147.0155.0157.0163.0183.0185.0190.0200203204205207209210212213217221227：155231：185243：102245250：84253255257：117258259266271272273274275277279282283284：250285293299：271301303307311：250314315316317：3
29、01318319327：183329：301331333335336：147；279337：147339340345347：329349：185；331350351;279352：190（G）353355：163357359：331360.5：163361362365：203（G）366：349367：335368369：333371：209（G）373：211（G）374：329375：303377：331378379：333380381：219（G）381：253383：203；163387389390.8：279391.2：279392：375395：233（G）396：361397：2
30、35（G）398：361399：327399：237（G）400：255401：365403：213405：163408.3：335409：247（G）411：249（G）412：301413：251（G）415417：255（G）418：285420：349421：349423：395423：405；243424429：383；245431：271433：271（G）435：273（G）437：275（G）439：277（G）441：279（G）442：205447：243449：287（G）451：289（G）452：301453：301454：301461463：301（G）465：30
31、3(G)467：245469：307（G）471：453473475：285479：317（G）484487：325（G）489：471495：259501：339（G）505：395510：331511：349（G）515：203516：337517：355（G）519：271521：359（G）523：273525527：347532：383542：283545：435541：273551：287551：389（G）565：317575：299578579：301583：303591：371593：317596597：303607：315615：319625：478695：350表1数字下
32、斜体画线的部分如283表示出现频率高；463：301（G）等表示含有G的分子离子片段，并且出现频率也高；284：250表示284分子离子片段可以继续碎裂为250片段，而250在表中能找到它单独存在时的分子离子片段。从上表可以看出，花色素大分子在断裂时，还是有一定规律可循的，本研究认为花色素大分子的断裂主要发生在吡喃环上，围绕O+发生化学键断裂；及所有氧桥都有断裂机率，现举例如下所示：2.3.2.1 0-100段举例：85分子离子的可能片段形式： （1）吡喃环的可能断裂方式 （2） 5*C+1*O+9*H=85图10 85分子离子的可能片段形式2.3.2.2 100-200段举例：163分子离子
33、的可能片段形式： （1）B环连接3个或2个氧桥的可能断裂形式 （2）B环连接1个氧桥的可能断裂形式 （3）9*C+3*O+7*H=163 （4）12*C+1*16+3*H=163 （5）9*C+3*O+7*H=163 图11 163分子离子的可能片段形式在100-200分子量期间，其可能的组成是由1.5-2个环组成，H+的自由移动，以及在320高温下分子内重排，环的再生，使得具有相同分子量的分子离子结构多样性成为可能。2.3.2.3 对于200-300分子量期间的分子离子片段，其可能组成是由3-3.5个环组成，以243片段为例： （1）吡喃环可能的断裂方式 （2）17*C+2*O+7*H=24
34、3 （3）17*C+2*O+7*H=243图12 243分子离子的可能片段形式2.3.2.4 对于300-400分子量期间的分子离子片段，其可能组成是由4-5个环组成，以399片段为例：见图8。2.3.2.5 对于400-500分子量期间的分子离子片段，其可能组成是由5-6个环组成，以439片段为例： （1）G及O+一侧化学键的可能断裂方式 （2） 27*C+6*O+19*H=439图13 439分子离子的可能片段形式2.3.2.6 对于500-600分子量期间的分子离子片段，其可能组成是由6-7个环组成，以523片段为例： （1）2个花色素单元的可能断裂方式 （2） 30*C+9*O+19*
35、H=523图14 523分子离子的可能片段形式2.3.2.7 对于600-700分子量期间的分子离子片段，其可能组成是由7-9个环组成，以695片段为例： （1）4个花色素单元的可能断裂方式 （2） 45*C+9*O+11*H=695图15 695分子离子的可能片段形式2.4 南果梨果皮花色素0.1-35.9min+MS2质谱分析2.4.1 0.1-1.6min花色素分子立体结构特征及着落点 表2 0.1-1.6min花色素+MS2离子峰值Time0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6m/z390.8 39
36、1.0 429.0 408.3 391.7 102.1 391.4 391.3 413.5 413.1 413.2 413.3 391.4 391.5 391.4 391.2413.3 413.6 391.1 391.2 413.4 391.7 413.6 279.1 391.3 391.5 391.7 391.2 412.8 102.4 413.4 413.4 391.2 413.2 391.2 413.3总和 13738本研究认为花色素合成过程中，氧桥的加入是先脱4H后加OH-，H+的过程。例如2个B环的氧桥连接，每个B环脱2H后，再加入OH-，H+，并且OH-，H+的2个H+发生重排。为
37、了计算的方便和便于大家的理解，依然沿用人们惯用的天竺葵色素，矢车菊色素及飞燕草色素，通过脱水方式连接。4*飞燕草+54*天竺葵-（4*6+54*4）/2*H2O+2(-O-CH2-)-8H=4*303+54*271-2160+60-8=13738式中飞燕草提供6个-OH，天竺葵4个-OH，（4*6+54*4）/2*18表示脱掉水的分子量。本研究中认为，能单独提供4个活性碳位形成氧桥的苯基苯并吡喃假称为天竺葵；能单独提供5个活性碳位形成氧桥的苯基苯并吡喃假称为矢车菊；能单独提供6个活性碳位形成氧桥的假称为飞燕草；能提供4个活性碳位形成氧桥并且含有1个-O-CH3的假称为芍药、含有2个-O-CH3
38、的假称为锦葵；能提供5个活性碳位形成氧桥并含有1个-O-CH3的假称为矮牵牛。如图16，该色素大分子以甲氧基与细胞膜磷酸-OH相连，花色素合成起始酶识别甲氧基或乙氧基，以3个乙酰辅酶A为底物先合成B环，再以2分子乙酰辅酶A和1分子葡萄糖为底物合成苯并吡喃环连接在B环上，即合成一分子苯基苯并吡喃作为上顶，该上顶能提供2、5、7、4碳位以氧桥形式连接下一层B环，即天竺葵顶。合成一层B环后，再合成一层苯并吡喃环，每层都是4个单位，一层B环与一层苯并吡喃环为一个重复单位，一共14层，再以一分子苯基苯并吡喃作为下顶，以一分子甲氧基与叶绿体膜相连。本模型是先合成基本单位的苯基苯并吡喃，再以氧桥相连。形成氧
39、桥之前，先脱氢。本模型仅仅第一层B环以4个氧形成氧桥，相当于4个飞燕草以8个-OH脱掉4分子H2O，下一层B环已经脱8个H+，为加氧桥做好了准备。长度推算及可能位置： 14*花色素单元直径+2*天竺葵顶+2*-O-C-+2*-C-H，其中2*天竺葵顶近似等于一分子苯直径。即14*1.16nm+0.58nm+2* 0.143nm+2*0.1nm17.306nm，以此长度，推算该花色素可能存在于叶绿体双层膜之间。CH3-O- 以-O-CH2-与膜磷酸-OH相连 1个天竺葵：做上顶 以-O-CH2-与膜磷酸-OH相连一个天竺葵：做下顶-O-CH34个天竺葵各脱2H，为加氧桥做准备，即先脱氢再加氧4个
40、飞燕草，4个B环以4个氧桥相连17.306nm12层4个天竺葵，B环均未氧桥相连 图16 0.1-1.6min花色素立体结构示意图2.4.2 1.7-2.1min花色素分子立体结构特征及着落点表3 1.7-2.1min花色素+MS2离子峰值分钟1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 离子峰值85.2 85.2 203.4 203.2 382.7126.7 126.8 383.3 383.0 203.1 203.2 383.0总和 2768.627698*飞燕草+1*天竺葵+2*B2（）+2*B3（）-（8*6+1*4+2*3+2*2）/2*H2O+1(-O-CH2-)+1*苯并吡喃基=8*30
41、3+1*271+2*126+2*110+30+130=2769以-CH2-O-连在膜上起始花色素分子合成CH3-O-1天竺葵做花色素分子的顶4.013nm2层4飞燕草，4个B环以4氧桥彼此相连先合成4个B环，3氧桥相连，还差1氧桥1个苯并吡喃环已经合成与B1相连 图17 1.7-2.1min花色素立体结构示意图 这是一个正在形成的花色素，最低层刚刚形成第一个苯并吡喃基与B环相连，还有3个苯并吡喃基有待生成或利用细胞质中现有的苯并吡喃基直接相连到B环上。本研究认为，花色素的合成过程类似于组装过程，苯并吡喃基及B环在细胞质中作为基本原件或者已经合成，花色素合成酶直接将其进行组装，再由氧桥酶将B环及
42、苯并吡喃环通过氧桥进一步相连；或者一边合成一边连接氧桥。长度推算及可能位置： 3*花色素单元直径+1*天竺葵顶+1*-O-C-+1*-C-H，其中1*天竺葵顶因倾斜而近似等于半分子苯直径，四个B环及一个苯并吡喃基在长度上看做一个花色素单元长度。即3*1.16nm+0.58/2nm+ 1* 0.143nm+1*0.1nm4.013nm，因为是正在合成中的花色素分子，虽然不能确定其位置，但依此长度可能存在于基粒膜之间。2.4.3 2.1-3.0min花色素分子立体结构特征及着落点 表4 2.1-3.0min花色素分子+MS2离子峰值Min2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.
43、8 2.9 3.0 离子峰值244.9 467.0 467.0 467.0 467.1 245.1 466.9 245.0 413.5 231.2467.0 244.9 245.0 245.2 244.9 467.1 244.9 391.4 245.1 245.2 466.8 467.0 245.0 244.9 391.4 245总和 8815.5 88156*飞燕草+2*矢车菊+29*天竺葵-（6*6+2*5+29*4）/2*H2O+1(-O-CH2-)-8H=8815长度推算及可能位置：9*花色素单元直径+1*天竺葵顶+1*-O-C-+1*-C-H，其中1*天竺葵顶近似等于半分子苯直径。即9*1.16nm+0.58/2nm+ 1* 0.143nm+1*0.1nm10.973nm，依此长度，推测该花色素可能存在于叶绿体双层膜之间，上顶与叶绿体外膜相连，底部4个天竺葵以氧桥与叶绿体内膜相连，提取过程中，从内膜脱落，4个A环上的-OH脱水两两以氧桥彼此