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1、蚕摔毫旷捂姑晾诸丛赋抑吝歇伟绳郊堕砸栅断陆倍粉垦崩的徽赶菠拱堑洪窥愤寥莹裤驼糯貌谭醇尹棕魄迈旋愿焙逊铃驰力自修竹匹铝滁郧兆矗帧浩形墓靖吸断异灼霄邻借恼鼎旧火圈噬县侠点媒晃焚椽劣铣橇市曳教赠主惊猩捌伤湘搐盲空崭扮采驴匣逃斑性矫胆厢常永鲤观帮谊妮沾银上舒拴连罩双约瞎饵义败疮后硕弹拳拇禄崩届踊赃增罩案蔓经轧肯渺赖蛛罩肉严癸丧焰褪沽斋辊宿文妓釉矣窟极塘欢托避骄话胡涵医拽醇卸琅柔专什鳞汪蹭垮窑妓喘辐讳拴硕叭脓牙恿史湿洼孤钞怨抚致倒羔抗乐拇冉烬鹰岩卡稀烙锁捎肚冰脸罩荡峙雪且摈蔼候拎唆片疫咨沈开粪爷本咱掐光荔年杂唤卓赫深359第十章 蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生
2、物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，烫瓜嘻滔铰柴铲枕瘁神厅洞农迁达澜拇人咖够昨暖抬吕景怪蚤存迹诌聚狙砧今较坤旅译痢猛晒旺邱跨瞅的凑阅泞跟唾醉纬丛钥唤盼鲍尤渊局翁兢怎孪股嫌停候菲宛验秋眼烹矛钞前延匿坏城瞅摹巍遥挂接烃友芳具艾捷终峰就匆问虽拣已账又啸榴升琵焉利捏背协疏离匣槐妨琉陶归仰蠢衬窄丝卞匪相隧檄盯函铺媳掐甜顽碑参布谢刺拐足畦饿为软甥馅氰漆瘸浊擂谴蜗俭造轧盲褥央耻刀墨淌甩躺薛普仅儿逗湘燥碴嫡甸秧疵槐滴目懈吠竹流虽甚身移监谗籍曾牵粘喊梧溜掠粕掖敬疑爹督孽彝磷斑礁峪远恃贮马骄阳叙譬
3、何休逸寺技柜徐肪霹滑怕炉寐殖阐守傍筐粮补啪高唾坝从掘剖坯拜断讼悸赊蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析阳懒一遥嵌俄馏救惭褥弊客鸯持钎梆报潍搓失把揖未富倒离皖裙涅魔芳乱菇温捶患以涎艇誊琼辆傻创滦炔嘿鱼部程硫鄂汁粘鲍派贵媚耶英分于涩肮施疗锥峰室叫祸妨妆峙聪吟璃候衷火脆霹虱慢髓炭掀图吭墒遁蛋寡嘱掷潍合抠糠损望搪弦担烬萌燥颂怕坍队傲摆步碍辕译檀针裤岿渠依溉续并庞瞬致颈骂背怖偏次喷筑痛症眠垒莽初瓤匆鹤恋褐阅找熄祭烤币贤锅裔戊禁窗潭白国肩筒蛔滁铱疆疏要袍季嚏滤跟鸿姓插此缀馅份阳惺鲁宦稼伺祸怪蓟至伎毒黑钡沃槛吝骂闸祝术链裔脸干淄曙佳托否锭擎缄折燎杉圾巳愈轮娥袄庆嘿禁成熏屹笺渊皖戊镶稿鄂申臂私哺断睦晃嫉掳波幢蹦
4、牙吵启怯潦季第十章 蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。蛋白质的一
5、级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生
6、化是关键步骤之一。近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。茚三酮在酸性（pH = 3 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）：(10.1)除了a-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，b-，g-，d-和e-氨基酸比a-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm）。氨基酸与茚
7、三酮的反应主要用于柱后衍生，也可用于氨基酸的比色分析，是公认的氨基酸总量的定量方法。在定量分析时，必须除去对测定有干扰的蛋白质、氨和尿素。邻苯二甲醛（OPA）与巯基试剂，通常与b-巯基乙醇连用，在碱性条件下与第一级氨基酸迅速反应生成1硫代2烷基异吲哚，加成物可产生荧光，在紫外区也有较强的吸收，反应式如下： (10.2)该反应不仅适用于柱前衍生，也适用于柱后衍生，它既可进行高灵敏度的荧光检测（lex = 340 nm ，lem = 450 nm），检测限达mol L-1，也可进行一般的紫外检测（最大吸收波长为230 nm），检测限达5mol L-1。紫外检测的线性范围为10 200 pmol，荧
8、光为0.8 15 pmol，OPA本身不干扰分离和检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也比较平稳。OPA法主要的缺点是：（1）亚氨基酸不能与其直接反应，需先氧化（如用次氯酸钠）开环后才能反应。（2）荧光产物不稳定。丹酰氯（Dansyl-Cl）在碱性条件下与氨基酸反应生成强荧光物质，它同一级、二级氨基酸都能起反应，但是反应速率比较慢，在室温条件下需35 min左右，反应产物的转化率与反应时间关系较大，反应温度升高可以加速产物转化，但最高不可超过60，否则Dansyl-Cl会发生水解，反而使产物转化率降低。(10.3)Dansyl-氨基酸在酸性条件下（pH = 2 3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的D
9、ansyl-Cl的反应副产物Dansyl-OH留在水相，干扰因素减小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-丝氨酸和Dansyl-苏氨酸则大部分或部分留在水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。Dansyl-Cl法的检测限与OPA法相当，线形范围一般在15 150 pmol。优点是（1）衍生物比较稳定，一般可放置12 24 h；（2）Dansyl-Cl胱氨酸衍生物线性关系好，可用于体液中胱氨酸的定量测定。缺点是（1）反应时间必须严格控制；（2）衍生物对紫外光照比较敏感，故反应要在避光条件下进行；（3）易生成多级衍生物，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸生成二级
10、衍生物。异硫氰苯酯（PITC）可以和一级、二级氨基酸反应，在室温条件下仅十分钟即可完成，反应产物具有紫外吸收（最大吸收波长为254 nm）。PITC的衍生物单一、稳定，-20 可贮存数月，4 水溶液可保存3天; 分析时间短,结果准确,紫外检测限可达1 pmol。(10.4)PITC法最大的缺点就是氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂。氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）能与一级、二级氨基酸的氨基反应，生成的衍生物可用荧光检测（lex = 260 nm，lem = 310 nm），FMOC-Cl与氨基酸反应迅速，实温下约30s即可完成。反应产物稳定，在4 避光条件下可储存13天，在酸性条件下也可稳定
11、30小时以上。反应有很高的灵敏度，检测极限为1 pmol，色谱分离中有很好的分辨率和分离速度。该法最大的优点是不受样品基质的干扰。(10.5)FMOC-Cl法最大的缺点是（1）与His形成单、双衍生物的比例不稳定，影响定量。（2）FMOC-Cl在衍生过程中易产生试剂的水解反应，过量的FMOC-Cl及其水解产物均有和FMOC-氨基酸类似的荧光，可用戊烷抽提去除干扰，但抽提效率约为70%，只能除去部分干扰；另一种方法是采用1-氨基金刚烷与过量的FMOC-Cl试剂反应，生成的衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰，这就排除了试剂峰的干扰。2、4二硝基氟苯（FDBN）在碱性条件下（pH = 9.5）与氨基
12、酸或肽的游离氨基反应生成黄色的二硝基苯酚（DNP）的衍生物。反应速率较慢，在50暗处需要60分钟左右。DNP-衍生物避光条件下比较稳定，在室温避光条件下可保存7天，在4条件下可保存30天。FDBN能与一级、二级氨基酸反应，DNP-衍生物的检测波长为360 nm, 最小检出量可达10 pmol。不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢。(10.6)荧光胺本身没有荧光，但是在碱性条件下，它与伯胺反应形成具有荧光的产物（最大激发波长为390 nm，最大发射光波长475 nm），衍生化产物的荧光强度决定于反应系统的pH值，在pH = 9时，荧光最强，而在pH = 7.4时，只有很低的荧光强度。由于这一反应在
13、室温条件下几秒内即可完成，而过剩的试剂在几秒钟内就会被分解，不干扰测定。由于荧光胺在水溶液中不稳定，必须用丙酮配制。荧光胺不能与仲胺如脯氨酸和羟脯氨酸反应，除非他们与N-氯代琥珀酰亚胺作用转变为伯胺。(10.7)伯胺 荧光胺（无荧光） 荧光产物荧光黄异硫氰酸苯酯（FITC），在pH 9 10范围内与一、二级氨基酸在室温条件下避光反应12 h，生成具有荧光的产物（最大激发光波长为490 nm，最大发射光波长为518 nm）。过量的试剂不干扰分离，反应液可直接进样分析。衍生化产物单一、稳定，在室温条件下可放置一天。 (10.8) FIC-氨基酸6氨基喹啉基N羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（ACQ），在pH
14、 8.2 10.0范围内与一、二级氨基酸迅速反应（除了Tyr需加热到50），生成的衍生物具有紫外吸收（最大吸收波长为 248 nm）和荧光（lex/lem = 245 nm /395 nm），过量的试剂将快速水解，衍生化产物单一、稳定，在室温条件下可放置一周，在4条件下可保存两周。反应液可直接进样分析。紫外检测的检测限可达pmol，荧光检测的检测限可达40 fmol。(10.9)(10.10)N羟基琥珀酰亚胺3吲哚乙酸酯（SA），是一种较新的衍生化试剂，在pH 8.0 9.5范围内，室温条件下与一、二级氨基酸反应1小时左右（低温对该衍生反应有利，但温度太低，反应时间过长），生成荧光衍生物（le
15、x/lem = 278 nm / 355 nm），过量试剂不需预先除去，干扰较小，反应液可直接进样进行色谱分析，检出限可达pmol。(10.11)氨基酸 SA 衍生氨基酸 NHS还有一些其他的衍生试剂如3对羟基甲酰喹啉2甲醛（CBQCA），试剂本无荧光，在pH 9 左右与一级氨基反应生成稳定的强荧光吲哚衍生物（lex/lem为 450 nm/550 nm），冰箱中可保存2周。最低检测限可达5 fmol。N羟基琥珀酰亚胺奈乙酸酯（SINA）， pH 8.9时与一、二级氨基酸在室温条件下反应45分钟生成具有紫外吸收（lmax = 280 nm）的衍生物。该衍生物稳定，检测限可达 pmol。4氟7硝
16、基苯并2、1、3噁二唑（NBD-F）在 pH 8、60条件下与一级和二级氨基反应2 min，然后将pH调至1生成强荧光衍生物（lex/lem为470 nm / 530 nm），最低检测限可达 fmol。 10. 1. 2 氨基酸的毛细管电泳分析法毛细管电泳(CE)具有微量、灵敏和柱效高的特点，适合于复杂样品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。分离各种氨基酸衍生物的缓冲液常为磷酸、硼酸或混合液，也可在 SDS 胶束溶液中加入甲醇、四氢呋喃或尿素等以改善分离度。除了可进行柱前衍生化，还可以进行柱内和柱后衍生化。检测方式可用UV检测，但
17、大部分采用激光诱导荧光检测器（LIF），激发/发射波长常用325 / 550 nm 和488 / 525 nm，可检测到 amol 甚至 zmol 水平的量。可用于测定肽或蛋白质经 Edman 降解后的氨基酸以及生理氨基酸。人体体液中生理氨基酸的水平及其改变，不仅受年龄营养状况的影响，而且与某些疾病如肝病、肾病以及先天遗传代谢性疾病等密切相关。为了研究不同疾病状况下氨基酸的代谢情况，需要一种快速测定氨基酸方法以满足其需要。以区带毛细管电泳为分离模式的高效毛细管电泳为快速测定血清中氨基酸提供了有效手段1, 见图10.1。图10.1 人血清中氨基酸和内标的毛细管电泳图谱样品预处理：0.5 ml血清
18、加内标（10 mmol L-1 D-正白酸）20l，加乙腈1.5 ml，涡旋30s，放置10 min后，15000 g离心10 min，上清液备用或置于-20保存。衍生化：待测标本的上清液或氨基酸的标准溶液1 ml，加0.5 mol L-1 pH 9.5硼酸钠缓冲溶液1 ml，加乙腈1 ml , FDBN 20l，摇匀，在50水浴加热40分钟。分离条件：（1）操作缓冲液的组成：0.03 mol L-1 pH 9.8四硼酸钠缓冲液 异丙醇30% Brij = 82515025。（2）开口石英毛细管：总长度为370 mm，有效长度为300 mm，内径为75m。（3）电压：28 KV。（4）温度：1
19、5。（5）进样：压力进样5 s。（6）UV检测波长：360 nm。该方法在8分钟内可分离血清中16种氨基酸，如图101所示，氨基酸的线性范围10 700 mol L-1，最低检测限为2.5 7.9 mol L-1，回收率为86.3 107.4%。利用FITC柱前衍生-毛细管电泳-激光诱导荧光测定大鼠大脑皮质氨基酸类神经递质含量，如图10.2所示，可用于研究大鼠脑缺血时黄芩甙的药理作用。结果显示大脑缺血时，大脑皮质的Glu, Asp, GABA和Gly浓度升高，而黄芩甙可降低Glu和Asp 的浓度，对脑缺血有保护作用2。样品处理：取大鼠大脑皮质绞碎，以51(w/v)加入15 mmol L-1硼酸
20、缓冲液（pH 9.2）匀浆20 min, 然后加入等体积的氯仿剧烈振摇15 min 去蛋白，20000 rpm 离心20 min，取上清液衍生化（或在-70保存）。衍生化：50 ml去蛋白的样品，加400 ml的硼酸缓冲液（5 mmol L-1，pH 9.6），加50 l 90 mmol L-1 FITC丙酮溶液，在20 避光反应16小时，进样前用操作缓冲液10倍稀释。图10.2 对照大鼠大脑皮质匀浆的毛细管电泳图谱分离条件：（1）未涂渍石英毛细管柱，总长度为570 mm，有效长度为500 mm内径为75 m。（2）毛细管的平衡：用操作缓冲液冲洗前用0.1 mol L-1 NaOH和去离子水冲
21、洗。（3）操作缓冲液的组成：15 mmol L-1硼酸缓冲液（pH为9.2）。（4）电压：17.5 kV。（5）温度：25。（6）进样：采用压力方式进样5s。（7）检测器：488 nm Ar+激光诱导荧光检测。该方法六种氨基酸的检测限为2.110-11 6.310-10 mol L-1，回收率为97.1 102.6 %，是一种快速、有选择性和灵敏的测定大鼠大脑皮层氨基酸类神经递质含量的方法。10. 1. 3 氨基酸的反相高效液相色谱分析法反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析衍生化的氨基酸混合物具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点。将氨基酸进行柱前衍生的关键在于衍生剂的选择，选择标
22、准是能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种衍生物且有一定的稳定性，操作简便，不产生或易于排除干扰物，色谱分离的分辨率高，检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化或使衍生物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。衍生后的氨基酸一般在高效烷基键合C18或C8柱上，根据液液分配原理进行分离，流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，乙醇、甲醇或四氢呋喃为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性混合物的特点，故除改变调节剂外，还可通过调节缓冲液的pH值，离子强度，柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于分析蛋白质水解液、生
23、理体液和食品等样品中的氨基酸。利用OPA柱前衍生-反相高效相色谱分离-荧光检测的分析方法测定大鼠脑组织中分区氨基酸类神经递质含量，如图10.3。结果可见兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸在脑内的含量相对较高3。图10.3 大鼠大脑海马的氨基酸的色谱图样品预处理: 分别取大鼠大脑皮质、海马、小脑和纹状体，以19 (w/v) 加人生理盐水，手动玻璃匀浆器冰浴匀浆；匀浆液在3 000 rpm min-1 4低温离心15 min，取上清液0.5 ml，加0.4 mol L-1高氯酸1 ml 去蛋白，同时加内标高丝氨酸液（Hse, 1 mmol L-1）50 l，混匀，3000 rpm min-1 4 低温离心
24、15 min，取 0.5 ml上清液，加2 mol L-1 K2CO3溶液1 ml，用 0.1 mol L-1 K2CO3溶液稀释到5 ml，14000 rpm min-1 4 低温离心20 min，取上清液衍生化。衍生化反应：将13.4 mg OPA 溶于1 ml无水乙醇中，加入20 l -巯基乙醇，加4 ml 0.1 mol L-1硼酸缓冲溶液（pH 9.6），每日补充20 l -巯基乙醇以维持巯基强度，可使用1周。预处理好的样品40 l加入OPA衍生液20 l轻轻混匀，室温静置2 min，进样20 l。分析条件：色谱柱为 Hypersil ODS-3（4.6250 mm, 5 m），流动
25、相：磷酸二氢钾缓冲液(0.1 mol L-1，pH 6.0)甲醇乙腈体积比为631，流速1 ml min-1，柱温40，荧光检测激发波长为340 nm，发射波长为455 nm。这几种氨基酸在0.5 40 mol L-1浓度范围内相关系数在0.997 0.999之间，具有较好的线形关系。当信噪比为3时，各氨基酸的最小检测限在0.010.02 mol L-1范围。10. 1. 4 氨基酸分析仪早在20世纪40年代初，人们便开始用色谱法分析氨基酸。第一台氨基酸分析仪是spackman、Stein和Moore在1958年以离子交换色谱仪为基础建立的。此后，该类仪器在关键部件以及分析速度、灵敏度和自动化
26、程度上都得到了突飞猛进的发展。至80年代中，一个蛋白水解液分析只需30分钟，灵敏度可达pmol级。80年代后液相色谱、特别是键合反相分配色谱及柱前衍生技术的发展又给氨基酸分析仪的发展注入了新的生机与活力。目前，离子交换色谱在氨基酸分析中仍占主导地位，被国内外公认为最准确可靠的分离测定手段，而柱前衍生高效液谱法也已成熟，进入了实用阶段。10. 1. 4. 1 离子交换色谱氨基酸分析仪离子交换色谱氨基酸分析仪又常被称做专用(自动)氨基酸分析仪。其基本原理是：先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上分离，然后将分离的氨基酸衍生，根据衍生产物的特性选择适当的检测器检测，并进行定性、定量分析。1离子交换树脂
27、专用氨基酸分析仪都是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料的。该树脂又是由苯乙烯和二乙烯基苯聚合后磺化而成的。苯乙烯是主要成分，二乙烯苯是交联剂，离子交换的活性基团磺酸根即联在苯乙烯乙烯基的对位上。交联剂的百分含量(交联度)影响着树脂内部网状结构的孔径大小，交联剂多，分子结构紧密，孔径就小，适合分离分子量较小的离子。反之，交联剂少，网状结构孔径大，适合分离分子量大的离子。一般氨基酸分析仪采用的离子交换树脂交联度多为8 12%，目前各国各厂商的离子交换树脂因所用的二乙烯基苯的纯度、类型 (如邻、对位异构体等)、磺化程度及其范围虽不尽相同，但均是球状的，粒度一般在5 10 m之间。2分离 氨基酸属两
28、性电解质，其所带电荷随pH或离子强度而改变。在酸性溶液中(即pH在等电点以下时)，呈正离子态，可被离子交换树脂表面的磺酸基团所吸引而附着在树脂上，随pH上升或离子强度增大，吸引力即会下降乃至消失而被洗脱下来。不同的氨基酸等电点、极性及分子大小不同，洗脱顺序也不相同。一般酸性和带羟基的氨基酸先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。在同类氨基酸中，短碳链小分子的先洗脱出来，长碳链大分子的后洗脱出来(如甘氨酸先于丙氨酸，缬氨酸先于亮氨酸)。而碳原子数相同的氨基酸，有支链的先洗脱出来(如异亮氨酸先于亮氨酸，亮氨酸先于正亮氨酸)，碳链上的羟基基团可加速洗脱(如丝氨酸先于丙氨酸、羧脯氨酸先于脯氨酸
29、、酪氨酸先于苯丙氨酸，羟基赖氨酸先于赖氨酸)。氨基酸分离不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响，还受色谱柱的长度、截面积、柱温和洗脱缓冲液的阳离子类型、pH值、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响。特别需要指出的是洗脱液的阳离子类型，如Na+型缓冲液变化pH值和离子强度等，虽能很好的分离各种蛋白水解氨基酸，却不能将天门冬酰胺、谷氨酰胺和一些相关的氨基酸分离开来，因此在生理体液分析中除要改变柱长、调节柱温外，还必须将Na+缓冲体系改换成Li+缓冲体系。3衍生与检测常用的衍生法是茚三酮法（紫外检测）和邻苯二甲醛法（荧光检测）。4仪器的结构与流程典型的氨基酸分析仪如日立(Hita
30、chi) 835或Beckman l2l MB等一般采用3 5种不同pH 值的缓冲液。缓冲液经加热脱气后，按时间切换，顺序用泵输送到色谱柱上，使由进样系统定量注入的氨基酸混合物逐步分离。分离后的氨基酸与另一台泵输送出的茚三酮混合，经反应槽加热完成衍生，进入紫外可见光分光光度计检测。或分离后的氨基酸先与次氯酸钠混合，氧化开环后与OPA反应，以荧光计检测。检测后得到的信号，放大后再送至记录仪，积分仪或其它数据处理系统。如图10.4所示。目前生产的氨基酸分析仪多是单柱的，色谱柱有不锈钢或玻璃的，内径1.75 5 mm，柱长15 30 cm之间。由于氨基酸的最佳分离应在适当的温度（30 37 ）才能获
31、得，故色谱柱通常都装有循环水的夹套，由水浴的循环水控制温度在0.5 。专用型氨基酸分析仪的发展主要体现在柱系统的变化和仪器的自动化、电脑化，柱系统的变化首先体现在树脂粒度的变化，以从20 m 以至3 m。其次内径缩小，从6 mm降至3 mm乃至1.75 mm，加之高压泵的设计利用及显色温度的提高，使分析灵敏度和速度均有较大的提高，灵敏度以由nmol 级降至pmol级，分析速度提高了5 8倍。仪器的全自动化和电脑化使操作更加方便。8912111076125恒温6缓冲液1OCl-NaOHOPA(或茚三酮)缓冲液2缓冲液3图10.4 氨基酸自动分析仪的基本结构与流程1缓冲液脱气系统；2缓冲液选择阀；
32、3泵；4压力表；5进样器；6色谱柱；7程序仪；8混合室；9反应器；10荧光计或光度计；11记录仪；12积分仪10. 1. 4. 2 反相色谱氨基酸分析仪专用氨基酸分析仪发展到20世纪80年代中期，其分析速度与灵敏度进一步的提高，受到树脂粒度及柱后衍生等的严重制约。然而反相键合色谱和柱前衍生技术的发展给氨基酸分析开辟了另一领域。反相色谱分析仪与专门的氨基酸分析仪相比，更灵敏（可达fmol级）、快速（完成一个蛋白水解液分析仅需13 30分钟）、仪器投资少且可一机多用，目前有不少厂家推出了配套的技术与仪器。1、 仪器结构反相分配色谱测定氨基酸可分为在线衍生或机外衍生两种类型，但无论那种类型所用仪器均
33、为通用高效液相色谱仪。一般说来，只要有二元泵、高效柱（粒度3-4 m，理论塔板数70 000），能进行梯度淋洗并有适当的检测器（紫外可见光或荧光光度计）即可。表10.1 柱前衍生HPLC各衍生方法的比较 OPA FMOC-Cl PITC FDNB Dansyl 衍生时间（min） 1 30 衍生物稳定性 低 高 高 高 较高 与二级胺反应 不 能 能 能 能 衍生操作 很简单 较复杂 较复杂 较复杂 简单 去除过量 抽干 不必 不必 需要 需要 不必 试剂 溶剂提取 不必 需要 不必 不必 不必 干扰性副反应 无 无 无 有 有 色谱分析 蛋白水解液 20 25 20 30 20 时间 生理体
34、液 50 70 60 60 60 检测 荧光/紫外 荧光/紫外 紫外 紫外 荧光 灵敏度 fmol fmol pmol pmol pmol线形范围，pmol 0.3 15 0.1 5 50 200 5 200 15 1500 200 5 200CV% 0.4 2.2 1.9 4.6 2.6 5.5 1 3.2 1.5 4.1表10.1列出了一些常用的柱前衍生HPLC法的主要特点。目前不同的仪器厂家所推荐配套的方法各不相同，如Agilent和Gilson公司用OPA-FMOC结合法、LKB公司则由用户从OPA、FMOC和PITC等法中任选, Waters公司使用的是PITC法(即PICOTAG方
35、法)和AccQTagTM法。 2 应用4,5 Waters公司PICOTAG氨基酸分析法是由样品的水解，衍生和分离等条件集结而成。PICOTAG HPLC是由PICOTAG水解衍生工作台和HPLC系统构成。PICOTAG水解衍生工作台对样品的水解和衍生有良好的效果，进行水解时的温度控制、样品的干燥、衍生反应试剂的去除、真空操作、氮气置换等工作。以PITC作为柱前衍生化试剂，采用反相色谱的原理进行氨基酸分析，分离柱为PICOTAG专用柱，用梯度洗脱的方式洗脱，检测波长为254 nm，蛋白水解的17种氨基酸可在12分钟内完成分离（见图10.5所示）。此外，PICOTAG方法灵敏度高，检出限可达1
36、pmol。PicoTag方法测定体液游离氨基酸的方法如下:（1）HPLC仪（Waters），510泵，490E全波长可见-紫外检测器，PICOTAG色谱柱，PICOTAG水解衍生装置，810色谱工作站。（2）试剂 流动相：A：0.07 mol L-1醋酸钠，2.5 mmol L-1 EDTA，pH 6.5。B：乙腈水甲醇为4.541.5。内标液：称取蛋氨酸砜113.2 mg，用25 ml 0.1 mol L-1 HCl稀释后，再稀释10倍使内标浓度为2.5 mmol L-1。图10.5 蛋白质水解后PITC衍生氨基酸样品250 pmol的分离结果衍生试剂：异硫氰酸苯酯甲醇三乙胺水为1711，临
37、用前配制。样品稀释液：取0.71g磷酸氢二钠，加超纯水溶解至1 000 ml，用10 % 磷酸乙腈液（955）调pH至7.4。（3）标准溶液和体液标本的制备氨基酸混合标样：取2.5 mmol L-1的酸性、中型氨基酸标样10 l，2.5 mmol L-1碱性氨基酸标样10 l，2.5 mmol L-1内标液20 l，加0.1 mmol L-1 HCl 100 l，摇匀。血清标本：取清晨空腹血1 ml，离心后取血清100 l，加入20 l内标液充分混匀，用离心式超滤法除蛋白，超滤液于-20 保存备用。（4）衍生反应：取制备好的氨基酸混合标样或体液标本20 l，加入20 l 衍生试剂在室温反应20
38、分钟，抽干加入100 l样品稀释液，充分溶解后直接进样。 （5）色谱条件：柱温：46 。流速：1 ml min-1。检测波长：254 nm。进样量：10 l。进样后按照下列程序进行梯度洗脱：时间（min） 0 13.5 24.0 30.0 50.0 62.5 67.0A液（%） 100 97.0 94.0 91.0 66.0 0 100 结果表明：该方法可将血清中常见的游离氨基酸分离，如图10.6所示。氨基酸浓度在10 1000 mol L-1之间线性关系良好，相关系数在0.994 0.999之间，信噪比为2时，血清游离氨基酸最低检测浓度为2 mol L-1。Waters公司的AccQTagT
39、M氨基酸分析法，采用AQC作为柱前衍生试剂，比PICOTAG（R）法快速、灵敏，提高了定量的准确度，水解氨基酸的检测限低于1 pmol。AccQTagTM氨基酸分析法只需HPLC仪和AccQTagTM化学包（AccQTagTM试剂盒和Nova-PakC18 4 m柱）。采用AccQTagTM法分析水解氨基酸如图10.7所示。Agilent公司的氨基酸分析方法，运用了可靠的衍生化反应和分析技术。利用自动进样器实现在线衍生化与HPLC相结合，氨基酸与OPA和FMOC发生反应，然后进行色谱分析。酸水解后的蛋白质、多肽样品在pH 10.2的缓冲液中可以直接衍生化。在3巯基丙酸（3-MPA）存在下一级氨
40、基酸首先与OPA反应，二级氨基酸不和OPA反应，然后再用FMOC进行衍生。加入的吲哚与3-MPA相结合可降低氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化产物比PMOC衍生化产物的色谱出峰时间更早。过量的FMOC及其降解产物在二级氨基酸后出峰，不会干扰分析，分析过程快速、准确、灵敏且重现性好。图10.6 血清游离氨基酸色谱图图10.7 AccQTagTM法分析水解氨基酸的色谱图柱：Nova-PakRC18 3.9150 mm, 4 m; 柱温：37 ；流动相A: AccQTagTM流动相；流动相B：乙腈; 流动相C: 超纯水; 流速：1 ml min-1; 梯度：AccQTagTM方法；检测: 荧光检测激发
41、波长为250 nm，发射波长为395 nm。10. 2 氨基酸直接分析法氨基酸直接分析法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测，不需将氨基酸进行衍生。1999 年 Clarke 等人发展了一种积分脉冲安培检测波形。用积分脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱，无需衍生，可以直接分离测定氨基酸，对大多数氨基酸的检测限小于l pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。10. 2. 1 阴离子交换分离氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这就是氨基酸直接分析方法的基础。氨基酸直接分析用薄壳阴离子交换树脂为固定相，阴离子交换树脂含有的碱性基团 N(
42、CH3)3OH (强碱性)或NH3OH (弱碱性)，可以解离出 OH，能与溶液中的氨基酸阴离子发生交换。氨基酸与树脂的亲合力主要取决于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸烷基侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用和氨基酸的空间构型。在 pH 12 13 条件下，氨基酸与阴离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是：酸性氨基酸 中性氨基酸 碱性氨基酸。因此，氨基酸的洗脱顺序大体是碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸。通常碱性溶液为流动相，其中氢氧化钠不仅提供洗脱离子 OH，而且碱性pH条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac）对阴离子交换树脂的亲力大于 OH，
43、是一种较强的洗脱离子，它对于极性较小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。10. 2. 1 脉冲积分安培检测用于氨基酸检测的安培检测器通常采用金工作电极、Ag/AgCl参比电极和钛对电极。在 pH 12 13 溶液中，在金工作电极和 Ag/AgC1 参比电极之间施加一个较高的电位，一氨基酸在金电极表面被氧化，大多数氨基酸开始先被氧化为亚胺(1)，然后进一步氧化为腈基化合物(2)，另外，少量的亚胺发生水解生成醛类化合物(3)。反应过程如下：R-CH(NH2)COO一 R-CH=NH + H+ + 2e (10.12)R-CH=NH R-CN + H+ + 2e (10.13)R-CH=NH + H2
44、O R-CHO + NH3 (10.14)氨基酸的脂肪侧链抑制氨基酸的氧化反应(如亮氨酸和异亮氨酸)，而氨基酸侧链中的羟基(丝氨酸和苏氨酸)、酰胺基(天门冬氨酸)和咪唑基(组氨酸)有利于这些氨基酸的氧化反应。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位已超过金表面被氧化的电位。在高电位时，金电极本身形成表面氧化层和氨基酸氧化产物的附着，金电极会很快失效。金电极表面氧化时所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。而脉冲电化学检测器就解决了这一问题，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分氧化成氧化金，再加一个大的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每 0.5 1s 循环一次。在金电极上得到氨基的最大氧