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1、学 科医学科学领域编号6-05-07安 徽 省 自 然 科 学 基 金 项 目申 请 书项目类型 B面上基金 申请年度 2010年1月-2012年12月 项目名称 丙谷胺协同化疗药诱导大肠癌细胞凋亡中神经酰胺的作用及调控 申 请 者 吴 佩 所在单位 皖南医学院 邮政编码 241002 通讯地址 芜湖市高教园区纬六路10号 联系电话 0553-5739558 传 真 E - mail 安徽省自然科学基金委员会18目 录一、信息表格（一）基本信息表（二）项目组主要参与者（三）经费申请表二、报告正文（一）立项依据与研究内容（二）研究基础与工作条件（三）经费申请说明（四）其他附件清单一、项目基本信
2、息表（一）基本信息申请人信息姓名吴佩性别男出生年月57年8月民族汉学位学士职称正教授每年工作时间（月）12月电话13705532142电子邮箱传真所在地区芜湖市E个人通讯地址芜湖市弋矶山医院胃肠二科工作单位皖南医学院弋矶山医院主要研究领域胃肠激素与消化道肿瘤现从事专业胃肠外科授予院校国别所学专业授予时间导师姓名硕士学位博士学位依托单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称丙谷胺协同化疗药诱导大肠癌细胞凋亡中神经酰胺的作用及调控申请类型B面上基金申请金额5万研究年限2010年 01 月 2012 年12月项目内容摘要（限字400）本课题通过转染胃泌素受体大
3、肠癌细胞株HT29的培养，应用MTT、RT-PCR、TUNEL 、Western blot等检测技术，从分子信号水平来探讨胃泌素受体拮抗剂丙谷胺协同化疗药5-FU诱导大肠癌细胞凋亡中神经酰胺及其下游的信号传导通路的作用，进一步证实胃泌素受体拮抗剂与5-FU的协同效应，以及它们是通过影响神经酰胺下游的何种信号传导途径来实现对大肠癌细胞凋亡的调控。通过本课题的研究必将进一步完善胃泌素对大肠癌生长的调控机制，并为大肠癌的内分泌靶向治疗提供更充分的理论依据，同时力求为激素依赖性大肠癌术后的综合治疗寻找到一个新的切入途径。关键词（用分号分开，最多5个）胃泌素；丙谷胺；5-FU；神经酰胺；大肠癌（二）项目
4、组主要参与者编号姓 名出生年月性别职 称学位单位名称电 话电子邮箱项目分工每年工作时间（月）1茆家定1971.02男主治医师硕士皖南医学院弋矶山医院13966032416M具体实施及指导42武建1961.07男主任医师学士皖南医学院弋矶山医院13956154966W具体实施及管理23陈贤军1963.09男主任医师学士皖南医学院弋矶山医院13855360016C具体实施及指导24吕坤1979.06.男主管检验师博士皖南医学院弋矶山医院13855351033L实验指导指标检测45汪建国1973.11男主治医师博士皖南医学院弋矶山医院om细胞培养指标检测26梁林虎1972.10男主治医师硕士皖南医学
5、院弋矶山医院细胞培养指标检测27黄鹤1971.04男副主任医师硕士皖南医学院弋矶山医院13909630052H细胞培养指标检测28洪书剑1978.01男主治医师硕士皖南医学院弋矶山医院细胞培养指标检测29徐洪海1985.5男在读研究生学士皖南医学院弋矶山医院13721207989W细胞培养指标检测8总人数高级中级初级博士后博士生硕士生10541024（三）经费申请表金额单位：万元科 目申请经费备注（计算依据与说明）1、人员费030实验室仪器的保管、卫生等劳务费2、设备费050主要用于使用外单位仪器设备损耗费3、能源材料费250细胞培养、试剂购买、实验耗材等4、实验外协费060特殊实验院外实施费
6、5、差旅费020特殊实验院外实施住宿费、车费6、会议费030学术交流、外出开会等费用7、管理费025按资助金额的5计算8、其他相关费用035资料检索、复印、打印、论文发表、版面、审稿费合 计500补充说明二 、报告正文参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）1、项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）大肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率有逐年上升的趋势。大肠癌的发生受到遗传和内
7、外环境因素的作用，其发病是涉及到多个因素、多个步骤、多个阶段的综合复杂的病理过程1-3。近年来研究已证实部分大肠癌的发生与胃泌素表达异常有关，这一类大肠癌有学者把它们称为激素依赖性肿瘤，其促进大肠癌细胞生长的机制可能是通过自主性地产生和分泌胃泌素并作用于自身细胞膜上的受体，从而发挥生物学效应，但其作用能被胃泌素受体拮抗剂所抑制4-6。丙谷胺是广谱的胃泌素受体拮抗剂，能够与胃泌素受体结合竞争地抑制胃泌素促增殖效应诱导肿瘤细胞的凋亡，已在临床上进行实验性研究，结果发现丙谷胺协同化疗药能够减低中晚期大肠癌的局部复发和远处转移率7。我们自1992年以来一直从事胃肠激素与消化道肿瘤的研究，其系列课题分别
8、获国家自然科学基金、省自然科学基金等多项基金资助。多年的研究结果表明胃泌素能够促进大肠癌细胞增殖抑制凋亡，并与多种蛋白异常表达有关8-14。这与国外文献报道一致15-17。而在我国大肠癌就诊病人中约有1/4-1/3已属于中晚期，尽管大部分病人手术后都进行了以化疗为主的综合性治疗，但仍有50左右的病人在术后5年内出现局部复发或转移。目前对于大肠癌综合治疗方案的选择往往出于临床经验的累积，缺乏有力的分子生物学依据，这也是疗效不理想的原因所在。正是由于大肠癌的发生是多种细胞因子作用的结果，并非单一因素所致，所以如何从分子水平寻求一个合理的、个体化的、综合的治疗方案来减低大肠癌的复发和转移率是目前肿瘤
9、研究的一个热门课题。神经酰胺(ceramide)属于鞘脂类一族，其特征是有鞘氨基骨架和特异性的N端序列。作为细胞内脂质第二信使，广泛存在于真核生物中，是信号传导途径中的枢纽，在细胞增殖、分化、生长抑制和凋亡等多种细胞活动中发挥调节作用18，特别是在诱导细胞凋亡的过程中起着重要的作用，是新近研究凋亡的热点，已得到人们的广泛关注。研究发现许多细胞外信号和受体，如肿瘤坏死因子a、激素、化疗药物和电离辐射等均可以激活ceramide19，如外源性化疗药物作用于肿瘤细胞后，可短时间内引起细胞内神经酰胺水平升高，同时伴有鞘磷脂水平的下降。外源加入可通透细胞膜的神经酰胺类似物C2-神经酰胺可引起同样的反应。
10、但有实验表明，细胞内升高的神经酰胺不是来源于鞘磷脂的水解，而是来自鞘氨醇的合成，神经酰胺合成酶抑制剂烟曲霉素B1(fumonisin B1, FB1）可完全抑制神经酰胺水平的升高，但不影响外源性的神经酰胺的作用。激活的ceramide再通过激活下游的效应分子，从而启动级联信号通路，将细胞外信息传递到细胞内引起凋亡20。其可能的途径有21-24：激活p53使其发挥转录调节作用，抑制Bcl-2的表达；启动Bax、p21waft，GADD45等p53下游基因的表达，促使凋亡力量增加；可以抑制鼠双微基因2的表达，减轻它对p53的负反馈抑制作用，从而抑制细胞增生，促进凋亡；兴奋c-Jun JNK，活化c
11、-Jun而诱导凋亡；抑制细胞内增生信号，特别是抑制丝裂原激活蛋白激酶增生信号系统，减弱细胞生存力量；可以释放细胞色素C和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)9，使线粒体膜电势减少。同时，线粒体可以形成ceramide平台，释放促凋亡的胞浆蛋白，活化caspase家族和DNA酶，共同诱导凋亡。近年来研究发现部分化疗药物能够通过细胞内脂质第二信使神经酰胺激活caspase-3促进大肠癌细胞的凋亡25。胃泌素及丙谷胺与神经酰胺相关性研究国内外尚未见报导。因此，了解神经酰胺在众种细胞因子促进肿瘤细胞凋亡中的作用将进一步完善细胞凋亡的调控机制，同时，针对肿瘤细胞凋亡的失衡如对其细胞凋亡信号转导途
12、径进行干预性调节可能为肿瘤治疗寻找到一个新的切入途径。众所周知5-FU是治疗大肠癌常用有效的化疗药，能够抑制大肠癌细胞的增殖诱导凋亡26，但其有效率仅有20左右，所以如何提高化疗药物的抗肿瘤功效也是目前肿瘤治疗研究的热点。Melen-Mucha等27研究发现胃泌素受体拮抗剂如丙谷胺与5-FU之间存在协同效应，能明显促进大肠癌细胞的凋亡。何渝军等7研究发现丙谷胺结合术后化疗对延长大肠癌患者术后生存期及降低术后复发转移率有一定的作用,特别是中晚期患者可试行丙谷胺辅助治疗。可见，胃泌素受体拮抗剂与5-FU联合应用对抑制大肠癌细胞增殖促进细胞凋亡存在协同效应，然而其具体分子机制仍处于探索阶段,亟待进一
13、步深入的研究。目前，对于鞘磷脂/神经酰胺信使途径在血液系肿瘤、神经系肿瘤及纤维细胞中的作用研究较多，而有关胃泌素、化疗药与神经酰胺信号传导途径在大肠癌中的研究报道甚少。本课题在既往研究的基础上，通过转染胃泌素受体大肠癌细胞株HT29的培养从分子信号水平来探讨胃泌素受体拮抗剂丙谷胺协同化疗药5-FU诱导大肠癌细胞凋亡中神经酰胺及其下游的信号传导通路的作用，进一步证实胃泌素受体拮抗剂与5-FU的协同效应，以及它们是通过影响神经酰胺下游的何种信号传导途径来实现对大肠癌细胞凋亡的调控。通过本课题的研究必将进一步完善胃泌素对大肠癌生长的调控机制，并为大肠癌的内分泌靶向治疗提供更充分的理论依据，同时力求为
14、激素依赖性大肠癌术后的综合治疗寻找到一个新的切入途径。参考文献：1. Kim YJ, Yoon SY, Kim JT, et al. NDRG2 expression decreases with tumor stages and regulates TCF/beta-catenin signaling in human colon carcinoma, Carcinogenesis., 2009;30(4):598-605. 2. Hoeft B, Linseisen J, Beckmann L, et al.Polymorphisms in fatty-acid-metabolism-re
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16、l. Targeting the epidermal growth factor receptor in colorectal cancer: a potential therapeutic role for gastrin-releasing peptide receptor antagonists.Oncology, 2007;72(3-4):160-161. 5. Gilliam AD, Watson SA.G17DT: an antigastrin immunogen for the treatment of gastrointestinal malignancy.Expert Opi
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18、关性研究.中华普通外科杂志,2004;19(4):222-224.10. WuP,et al.Correlation between the expression of Gastrin, somatostatin and cyclin and cyclin-depend kinase in colorectal cancer.World Journal of Gastroenterology.2005;11(45):7211- 7217.11. Mao JD, Wu P, et al. Correlation between expression of gastrin somatotatin
19、and cell apoptosis regulation gene bcl-2/bas in large intestine carcinoma. World Journal of Gastroenterol 2005;11(5):721-725. 12. 吴佩，茆家定，梁林虎，等. 大肠癌胃泌素、生长抑素的表达及比势与p16INK4a、p21CIP1、CDK2、CDK4的相关性研究. 中华实验外科杂志,2008;25(6):803.13. Mao JD, Wu P, et al. Relationship between expression of gastrin, somatostati
20、n,Fas/FasL and caspases in large intestinal carcinoma. World Journal of Gastroenterology. 2008; 14(18): 2802-2809.14. 吴佩，茆家定，等.胃泌素促大肠癌细胞增殖与STAT3信号转导通路的关系. 国际外科学杂志, 2010;37(4):243-247. 15. Kim YJ, Lee JS, Hong KS, et al. Novel application of proton pump inhibitor for the prevention of colitis-induced
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25、onductance and Cl- secretion in intestinal epithelia.FASEB J, 2009;23(1):259-270. 22. Gangoiti P, Granado MH, Wang SW, et al. Ceramide 1-phosphate stimulates macrophage proliferation through activation of the PI3-kinase/PKB, JNK and ERK1/2 pathways.Cell Signal,2008;20(4):726-736.23. Nica AF, Tsao CC
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28、-Mucha, Lawnicka H, Mucha S. The combine effects of proglumide and fluorouracil on the growth of murine Colon 38 cancer cells in vitro. Endokrynol Pol, 2005;56(6):933-938. 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）研究内容:选择有代表性已转染了胃泌素受体（CCK-B受体）的大肠癌细胞株HT-29为研究对象，共分为以下几组：A组：为对照组，仅为无血清培养基，不含其它物质。B组：无血清培养基
29、中加入胃泌素。C组：无血清培养基中加入丙谷胺。D组：无血清培养基中依次加入丙谷胺后及入胃泌素。E组: 无血清培养基中依次FB1及胃泌素（FB1为神经酰胺合成酶抑制剂烟曲霉素B1）F组：无血清培养基中加入5-氟尿嘧啶（5-FU）。G组：无血清培养基中依次加入FB1及5-FU。H组: 无血清培养基中依次加入胃泌素及5-FU。I组：无血清培养基中依次加入丙谷胺、胃泌素及5-FU。J组：无血清培养基中依次加入丙谷胺、FB1、胃泌素及5-FU。应用MTT、RT-PCR、TUNEL 、Western blot等检测技术，对以上各组进行检测，了解各组的:（1）细胞凋亡及细胞增殖抑制情况，并计算出凋亡指数（a
30、poptosis index,AI）及细胞增殖抑制率。AI = 10个高倍视野的凋亡阳性细胞总数/1000100细胞增殖抑制率（对照组a实验组a）/对照组a100（2）神经酰胺mRNA及蛋白表达（3）神经酰胺信号传导通路中p53、Bcl-2、Bax、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、应激激活的蛋白激酶（JNK）、p38以及Caspase（Caspase-9、 Caspase-3）mRNA及蛋白表达情况。 mRNA表达的相对强度（RI）= mRNA条带灰度值/-actin条带灰度值根据检测的结果进行以下分析：（1）证实胃泌素对大肠癌细胞株HT-29是否有促进增殖抑制其凋亡的作用。（2）胃泌素受体
31、拮抗剂丙谷胺阻断胃泌素与其受体结合后，对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响。 （3）证实胃泌素对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否通过调节神经酰胺及其下游的信号传导通路来实现的。 （4）化疗药物5-氟尿嘧啶对大肠癌细胞株HT-29凋亡及增殖的影响。 （5）5-FU对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否通过调节神经酰胺及其下游的信号传导通路来实现的。 （6）胃泌素受体拮抗剂丙谷胺与5-FU是否有协同效应，这种促进凋亡抑制增殖的效应是否通过调节神经酰胺及其下游的信号传导通路来实现的。研究目标:阐明胃泌素受体拮抗剂与化疗药诱导大肠癌细胞凋亡的分子机制，进一步证实胃泌素受体拮抗剂与5-FU的协同效应，以及神经酰胺及
32、其信号传导通路在丙谷胺与5-FU诱导大肠癌细胞株HT-29凋亡过程中所起的作用。从而进一步完善胃泌素对大肠癌生长的调控机制，并为大肠癌的内分泌靶向治疗提供更充分的理论依据，同时力求为激素依赖性大肠癌术后的综合治疗寻找到一个新的切入途径。拟解决的关键问题:在理论上欲解决的关键问题是探索胃泌素受体拮抗剂协同化疗药诱导大肠癌细胞凋亡的分子机制，即：胃泌素受体拮抗剂协同化疗药物是通过影响神经酰胺下游的何种信号传导途径来实现对大肠癌细胞凋亡的调控。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）拟采取的研究方法、技术路线 将已转染了胃泌素受体（CCK-B受体）的大肠
33、癌细胞株HT-29培养在含有10%胎牛血清、青霉素G浓度为100KU/L、卡那霉素为0.1g/L的RPMI-1640培养基中,保持温度在37，CO2含量为5恒温培养箱，隔天换液，细胞培养至对数生长期时接种在培养瓶中继续培养，于倒置显微镜下观察，选择适时实验。胃泌素为胃泌素-5肽（G-5），胃泌素受体拮抗剂为丙谷胺，化疗药为5-氟尿嘧啶（5-FU）。用含5小牛血清的RPMI-1640液将胃泌素浓度配为25ug/ml，丙谷胺浓度为32 ug/ml，5-FU浓度为25ug/ml，FB1浓度为10mol/L.（1）胃泌素、丙谷胺、5-FU对大肠癌细胞株HT-29凋亡的影响及增殖抑制情况的检测方法与技术
34、路线A组中细胞凋亡和细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。 选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入RPMI-1640培养基100l培养48小时后观察细胞增殖情况，用流式细胞仪及DNA原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况，并计算出凋亡指数（AI）。用MTT法检测细胞增殖抑制情况。B组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入25ug/ml GAS的RPMI-1640培养基100l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同A组（对照组）。根据检测的数据与A组进行比较分析。 凋亡指数（A）的比较。
35、 二组间细胞增殖抑制率的比较。通过分析进一步了解胃泌素对大肠癌细胞株HT-29是否有促进增殖抑制其凋亡的作用。C组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入32 ug/ml 丙谷胺的RPMI-1640培养基100l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同A组。比较指标同B组。通过分析进一步了解丙谷胺对大肠癌细胞株HT-29是否本身就存在促进凋亡及抑制增殖的作用。D组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入32 ug/ml丙谷胺的RPMI-1640培养
36、基50l预处理0.5h后加入25ug/ml GAS的RPMI-1640培养基50l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同对照组。根据检测的数据与B组进行比较分析，比较指标同B组。通过分析进一步了解胃泌素受体拮抗剂丙谷胺阻断胃泌素与其受体结合后，能否抑制其增殖，促进细胞凋亡。E组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入10mol/L FB1的RPMI-1640培养基各50l预处理0.5h后加入25ug/ml GAS的RPMI-1640培养基50l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同
37、A组。根据检测的数据与B组进行比较分析，比较指标同B组。通过分析进一步了解胃泌素对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否通过调节神经酰胺信号传导通路来实现的。F组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入25ug/ml 5-FU的RPMI-1640培养基各100l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同对照组。根据检测的数据与A组进行比较分析。比较指标同B组。通过分析进一步了解5-FU对大肠癌细胞株HT-29抑制增殖及促进凋亡的作用。G组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.
38、25胰蛋白酶消化，加入10mol/L FB1的RPMI-1640培养基50l预处理0.5h后加入25ug/ml 5-FU的RPMI-1640培养基共50l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同对照组。根据检测的数据与F组进行比较分析。比较指标同B组。通过分析进一步了解5-FU对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否通过调节神经酰胺信号传导通路来实现的。 H组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入25ug/ml 5-FU及25ug/ml GAS的RPMI-1640培养基各50l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖
39、抑制情况。检测的方法和指标同对照组。根据检测的数据与B及F组进行比较分析，比较指标同B组。通过分析进一步了解5-FU及GAS对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否存在拮抗作用。I组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入32 ug/ml丙谷胺的RPMI-1640培养基33.3l预处理0.5h后加入25ug/ml GAS及25ug/ml 5-FU的RPMI-1640培养基各33.3l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同对照组。根据检测的数据与D及H组进行比较分析，比较指标同B组。通过分析进一步了解5-FU及丙谷
40、胺对大肠癌细胞凋亡及增殖的影响，是否存在协同作用。J组中细胞凋亡及细胞增殖抑制情况的观察方法与技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入32 ug/ml丙谷胺及10mol/L FB1的RPMI-1640培养基各25l预处理0.5h后加入25ug/ml GAS及25ug/ml 5-FU的RPMI-1640培养基各25l培养48小时后观察细胞凋亡及细胞增殖抑制情况。检测的方法和指标同A组。根据检测的数据与E、G及I组进行比较分析，比较指标同B组。通过分析进一步了解胃泌素受体拮抗剂丙谷胺与5-FU的协同效应是否通过调节神经酰胺信号传导通路来实现的。（2）胃泌素、丙谷胺及5-FU对
41、大肠癌细胞株HT-29凋亡中神经酰胺及其下游的信号传导通路的基因蛋白表达影响的检测方法与技术路线A组：神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3 mRNA及蛋白表达检测及技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入RPMI-1640培养基100l培养48小时后，应用RT-PCR技术、Western blot法分别检测神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3 mRNA及蛋白表达情况，用酶标仪测定吸光度A值。B组：神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、
42、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3 mRNA及蛋白表达检测及技术路线。选择对数生长期的细胞，并用0.25胰蛋白酶消化，加入25ug/ml GAS的RPMI-1640培养基100l培养48小时后，进行mRNA及蛋白表达检测，方法及检测指标同A组。根据检测的数据与A组进行比较分析： 神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3 mRNA指数（RI）进行比较。 神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3蛋白表达阳性细胞的吸光度进行比较。 用图像分析仪对Weste
43、rn blot法检测的阳性条带的面积和灰度进行比较。其他各组的细胞培养、预处理方式与检测细胞凋亡及增殖抑制情况中的细胞培养、预处理方式相同。神经酰胺、p53、Bcl-2、Bax、ERK、JNK、p38、Caspase-9、 Caspase-3 mRNA及蛋白表达检测方法及检测指标同A组，组间比较同第一部分，比较指标同B组。可行性分析：该课题是项目组成员多年从事大肠癌研究的深入，具有较坚实的前期研究作基础。曾先后获得国家自然科学基金（39270769）、安徽省自然科学基金（03043704）、安徽省教育厅自然科学基金（96JL0118、2000JL244、2002Kj307、2006Kj115c
44、、KJ2010B242）、芜湖市科技计划重点项目（2008704、2009卫生类-2-4）等多项资助，在国家级专业期刊上发表论文三十余篇。2003年获安徽省科技进步三等奖。项目组成员已熟练掌握细胞培养、TUNEL、Western blot、RT-PCR及MMT检测技术，并已开展有关内容的研究，实验条件基本具备。转染胃泌素受体（CCK-B受体）的大肠癌细胞株HT-29、mRNA引物及实验试剂在市场上均能买到。根据国内及Medline等文献检索尚未发现类似报道，本课题将率先通过细胞培养从分子信号水平来探讨胃泌素受体拮抗剂丙谷胺协同化疗药5-FU诱导大肠癌细胞凋亡中神经酰胺及其下游的信号传导通路的作用，故具有较强的创新性和新颖性。4、本项目的特色与创新之处。根据文献检索，胃泌素受体拮抗协同化疗药对大肠癌细胞凋亡神经酰胺及其下游的信号传导通路的研究尚未见报道。本课题在既往研究的基础上，通过细胞培养从分子信号水平来探讨丙谷胺协同化疗药5-FU诱导大肠癌细胞凋亡的分子机制，故具有较强的创新性和新颖性。通过本项研究力求为激素依赖性大肠癌术后的综合治疗寻找到一个新的切入途径，并为大肠癌的内分泌靶向治疗提供更充分的理论依据。5、年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）年度研究计划：