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1、 ca2+浓度对罗氏沼虾Gq蛋白亚基亚细胞定位的影响摘要：采用免疫胶体金电镜技术研究光暗适应条件下不同浓度对罗氏沼虾（macrobrachium rosenbergi）感光细胞中蛋白亚基亚细胞定位的影响。结果表明，对于光适应组，在高溶液、生理溶液和低溶液中细胞质与感杆束中胶体金密度的比值是、和。对于暗适应组，在高溶液、生理溶液和低溶液中细胞质与感杆束中胶体金密度的比值是、和。这些表明了罗氏沼虾感光细胞中蛋白亚基在暗适应条件下同时分配在感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内浓度适度升高的条件下，膜结合的蛋白亚基进而转化为可溶性的蛋白亚基。关键词：罗氏沼虾（macrobrachium rosenber
2、gi）；感光细胞；蛋白；免疫胶体金电镜： ， ， ， ， ， ， ， ， ， p ： ； ； ； 免疫胶体金电镜是研究生物大分子在亚细胞水平的定位、进一步探讨大分子功能的最重要技术之一，具有双价性，它的一臂可结合到事先包被有抗原的胶体金上，也可以把抗体分子包被在胶体金上对细胞内的抗原进行定位。该技术首先用胶体金颗粒对抗原的抗体进行标记，然后用标记抗体对组织超薄切片进行免疫反应，有抗原存在的细胞结构即被胶体金颗粒标记，在电镜下根据胶体金颗粒的分布情况及密度即可确定抗原的亚细胞分布及相对含量。近年来胶体金探针己成为定位和分析多种蛋白质、多肽、多糖的有力工具，特别是在抗原酶及激素等物质的细胞免疫化学
3、定位中更加显示了其独特的作用。罗氏沼虾（macrobrachium rosenbergi）感光细胞中蛋白亚基有可溶性和膜结合两种形式，蛋白亚基在光感觉生理中的作用不仅取决于不同形式蛋白亚基含量的变化，而且与其在细胞内的分布密切相关。采用生理生化的方法能测定不同形式蛋白亚基的含量，而采用免疫定位可以反映其细胞及亚细胞分布变化。采用免疫胶体金电镜技术研究光暗适应条件下不同浓度对罗氏沼虾感光细胞中蛋白亚基的影响，以期从亚细胞水平揭示与蛋白亚基之间的关系，为阐明蛋白亚基的作用机制及在光感觉生理中的作用打下基础。 材料与方法 材料罗氏沼虾购买于上海市漕河泾农贸市场，试剂、药品均为进口分装或国产分析纯。兔
4、抗蛋白亚基的抗血清端序列（）购买于美国公司。 方法 样品的处理 将购买来的只罗氏沼虾随机平均分成组饲养在河水中，一组于自然光下饲养 后在自然光下解剖复眼，另一组于全暗的环境中饲养 后在微弱的红光下解剖复眼。获取视网膜并放入孵育杯待用。将活的视网膜分别放入配制的生理溶液、高溶液和低溶液中。将两组样品（暗处理组的样品用遮光纸包住）都放在 下孵育 。 样品的超薄切片 取视紫红质部分迅速放入固定液（ 多聚甲醛和体积分数为的戊二醛）中，于 过夜。另一组在微弱的红光下取视紫红质部分迅速放入固定液中，于 过夜。用磷酸盐缓冲液和含有 甘氨酸的磷酸盐缓冲液分别清洗样品，然后用乙醇和丙酮脱水。用树脂包埋、聚合后，
5、再把切好的超薄切片收集在镍铬网面上。 样品的免疫标记和电镜观察 将镍铬网面向下漂浮在含体积分数为1 的磷酸盐缓冲液液滴上孵育 ，转移镍铬网到封闭液液滴表面上孵育 ，转移镍铬网到一抗液滴表面上，于 孵育过夜，用磷酸盐缓冲液轻洗镍铬网面次，每次 ，转移镍铬网到交联胶体金颗粒的二抗液滴表面上孵育 。用磷酸盐缓冲液轻洗镍铬网面次，每次 ，在室温下转移镍铬网到含体积分数为戊二醛的磷酸盐缓冲液液滴上固定 ，用磷酸盐缓冲液清洗镍铬网面次，每次 ，用去离子水清洗镍铬网面次，每次 。用醋酸铀及柠檬酸铅染色，于 下用透射电镜观察、拍照。 结果与分析由表可知，对于光适应组，在高溶液、生理溶液和低溶液中细胞质与感杆束
6、中胶体金颗粒密度的比值是、和。对于暗适应组，在高溶液、生理溶液和低溶液中细胞质与感杆束中胶体金颗粒密度的比值是、和。由图1和表1可知，罗氏沼虾感光细胞中蛋白亚基在暗适应条件下同时分配到感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内浓度适度升高的条件下，膜结合的蛋白亚基进而转化为可溶性的蛋白亚基。 小结与讨论罗氏沼虾感光细胞中蛋白亚基在暗适应条件下同时分配到感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内浓度适度升高的条件下，膜结合的蛋白亚基进而转化为可溶性的蛋白亚基。蛋白亚基亚细胞定位的变化是去十六酞化物的作用所导致的。免疫胶体金电镜技术现己在免疫化学和组织化学研究中得到了广泛应用，胶体金颗粒之所以能成为电镜下较为理想
7、的免疫标记物，是因为它主要有如下优势：胶体金颗粒在电镜下具有很高的电子密度，大小颗粒清晰可辨，且不影响对原有超微结构的观察。通过计量被检部分的胶体金颗粒，可以对被检抗原或抗体进行免疫定量研究。有一些关于异源三聚体蛋白十六酞化物位点和亚细胞定位之间相冲突的关系的报道，研究认为从坚持亚基的膜定位到坚持从膜到细胞溶质的活化依赖移位是去十六酞化物的作用导致。对无脊椎动物感光器中蛋白的定位研究较少，用免疫组织化学的方法在鲎侧眼的冰冻切片中观察免疫反应发现，荧光集中在小眼的视杆部位，在小眼的视网膜细胞或其他细胞的胞质中几乎没有免疫反应。在超微结构定位上，用免疫胶体金标记了感光器中的蛋白亚基，光敏感的微绒毛
8、部位的金粒密度是胞质部位的倍以上。在鳌虾的感光器中，用同样的方法观察蛋白亚基，在光照条件下蛋白亚基从视杆微绒毛膜上移位至胞质中，在黑暗中又移回到视杆微绒毛膜上。蛋白亚基在光适应与暗适应时的定位模式与蛋白亚基非常相似，这表明它们定位的变化是同步的，。在多毛纲动物感光器中，免疫胶体金电镜技术表明蛋白亚基主要分布在视杆微绒毛的膜上。十六酞化和去十六酞化对蛋白亚基的脂类修饰很可能是造成其形式转变的原因。己发现乌贼的蛋白亚基的第、位点上的半胱氨酸残基是潜在的十六酞化的位点。用巯基乙醇处理乌贼感光器时，蛋白亚基及、亚基从膜上分离出来，这表明一种不稳定的脂类修饰对蛋白锚定到膜上起重要作用。巯基乙醇可以解离蛋
9、白亚基，且偶氮胂也可以解离鳌虾中蛋白亚基，已知高浓度的偶氮胂可以裂解硫脂或酯型脂肪酸键，用偶氮胂处理乌贼的感光器膜，发现膜结合的蛋白亚基从膜上解离出来，表明硫脂的裂解产生了溶解性的蛋白亚基。因此推测可溶性的蛋白亚基的增加是由于脂肪酸从膜结合的蛋白亚基上移走，使得膜结合的蛋白亚基转变为无活性的可溶性的蛋白亚基。罗氏沼虾感光细胞中蛋白亚基的形式转变机制还有待进一步的研究。参考文献： 冯志国，谢素霞，刘慧娟 钙离子对光暗适应罗氏沼虾感光细胞中膜结合蛋白亚基的影响 信阳师范学院学报（自然科学版），（）： 冯志国，章 骏，袁维佳，等 钙离子浓度对光暗适应时罗氏沼虾感光细胞中可溶性蛋白亚基的影响 动物学研究，（）： 章 骏，袁维佳，许 燕 几种甲壳动物感光器中的蛋白亚基的研究 上海师范大学学报（自然科学版），（增刊）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， （）： 许 燕，袁维佳，赵云龙，等红螯螯虾感光器中蛋白的鉴定及光波长对其含量的影响 动物学研究，（）： 袁维佳钙离子浓度对鲎腹神经感光器中自动碰击的影响 华东师范大学学报（自然科学版），（增刊）： 袁维佳，陈 蕾，潘晓震，等 钙离子浓度对暗适应时的中华绒螯蟹光感受器超微结构的影响 动物学研究，（）：