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1、分光光度法,董雷鸣,定义： 根据被测物质对各种不同波长光的吸收能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的特性鉴定物质的方法 属光谱分析法,、光谱分析(Spectral analysis),1、定义： 根据物质具有对光进行吸收、发射或散射的特征而建立起来的分析方法,微粒性(E=hv) 波粒二象性 波动性(=c/v) E=hv =hc/ -光的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比,2、光的基本性质-高速传播的电磁波,3、物质对光吸收的基本原理： 能量转移 -当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子、原子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为
2、激发,选择吸收 -组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱,能量释放 -处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱,E1,E0,吸收光谱,发射光谱,激发态,基态,E1 E0,（1）根据产生光谱的物质结构 原子光谱 (atomic spectrum) 分子光谱 (molecular spectrum),4. 分类,（2）根据光谱获得的方式不同 吸收光谱（Absorption spectrum）分析法： 根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后所形成的特
3、征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法 紫外-可见分光光度法 (ultraviolet and visible spectrophotometry) 原子吸收光谱法 (atomic absorption spectrophotometry) 红外光谱法 (infrared spectrometry), 发射光谱(emission spectrum)分析法： 根据物质受到热能或电能等的激发后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法 原子发射光谱法 (atomic emission photometry) 分子发光分析法,II. 可见-紫外分光光度法,一、概述 1、定义： 利用物质的分子或离
4、子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性、定量及结构分析的方法 可见光： 400700nm,有色物质溶液 紫外光： 200400nm,无色物质,2、特点： 仪器设备和操作简单 费用少分析速度快 灵敏度高(10-410-7g/ml) 选择性好 精确度和准确度高,3、影响因素： （1）温度 （2）溶剂 （3）pH值 （4）溶液浓度 （5）狭缝宽度 （6）背景吸收,4、应用：,（1）定性分析 定性鉴定 纯度鉴定 结构分析,（2）定量分析,二、光吸收的基本定律 1、定律： 单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系,（1）Lambert定律： 说明吸收与溶液液层厚度间的关系,L
5、1,L2,入射光,透过光,入射光,透过光,L2 L1 ，I1 I2,I0,I1,I0,I2,（2）Beer定律： 说明吸收与溶液浓度间的关系,C1,C2,入射光,透过光,入射光,透过光,C1 C2， I2 I1,I0,I1,I0,I2,2、表达式： -lgIt/Io=-lgT=abc A=-lgT= abc It/Io为透光率(Transmittance, T) A为吸光度(Absorbance) a为吸光系数(absorptivity) b为液层厚度 c为溶液浓度(concentration),三、比色法(colorimetry) 1、定义： 用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有
6、色物质浓度的方法,2、基本原理： 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系,3、所用仪器： 分光光度计(spectrophotometer),（1）主要部件：,光源,检测器,单色器,信号显示系统,吸收池,（2）使用：,1开电源开关，打开箱盖，预热10min,2将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁,3选定波长,4打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空白管调T=0,5. 盖上箱盖(光路开关自
7、动打开)，再用空白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关),8全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关,7逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A,6将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否则调节“消光零”旋钮调至0,4、比色法的定量方法： 标准曲线法: 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度,AX,CX,A（吸光度）,C（浓度）,对比法： 将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度：,As = abCs；Ax = abCx,Cx=Cs Ax / As,由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度：,III. 实验内容,1.可见光分光光度计波长校正,2红蛋白及衍生物吸收光谱测定(见书),