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1、2019/4/5,第十六章 分子发光分析法,一、基本原理 principle 二、化学发光分析的特点 characteristics 三 装置与技术 instrument and technology,第三节 化学发光分析法,molecular luminescence analysis,chemiluminescence analysis,2019/4/5,一、基本原理 principle,1. 化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合
2、物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,2019/4/5,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,2019/4/5,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。 定性依据： （1）在一定条件下，
3、峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,2019/4/5,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,2019/4/5,O3 O2 + O （1000 C石英管中进行）
4、 NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与CO的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3；,氧原子与NO的发光反应：,2019/4/5,c. 乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,2019/4/5,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮 NO + H
5、HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：690nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；,2019/4/5,b.硫化物,挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：394nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,2019/4/5,（3）液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中
6、应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,2019/4/5,5. 化学与生物发光分析的应用,（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可检测
7、低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样,氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,2019/4/5,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,2019/4/5,生物发光分析应用 1,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AM
8、P)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+,pH7 - 8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O 氧化荧光素* 氧化荧光素 + h 最大发射波长562nm；,2019/4/5,生物发光分析应用 2,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：,NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2 + RCHO + O2 FMN
9、+ RCOOH + H2O + h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,2019/4/5,二、特点 characteristics,1. 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 3. 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,2019/4/5,2019/4/5,2019/4/5,三、装置与技术 instrument and t
10、echnology,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,2019/4/5,内容选择：,第一节 分子荧光和磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 第二节 分子荧光和磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 第三节 分子发光分析 chemiluminescence analysis,结束,