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1、第三章 分子发光分析法,第一节 荧光分析法 第二节 磷光分析法 第三节 化学发光分析法,第一节 荧光分析法（Fluorescence）,一 概述,(一)、分子发射光谱与分子能级结构,振动弛豫,内部转换,(二)、分子吸收光谱与分子荧光光谱,吸光,荧光,250 300 350 400 450,蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱,相对强度,300 400 500,相对强度,荧光光谱与吸收光谱镜像对称 荧光光谱较吸收光谱简单,硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱,(三)、荧光量子产率（荧光效率）,发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量,荧光效率（f）=,发出光子数
2、吸收光子数,如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。,化合物 荧光效率 溶剂 荧光素 0.92 （0.1MNaOH） 曙红 0.19 （ 0.1MNaOH） 罗丹明B 0.97 （乙醇） 蒽 0.31 （己烷） 核黄素 0.26 （水，pH7） 菲 0.10 （乙醇） 萘 0.12 （乙醇） 酚 0.22 （水） 叶绿素 0.32 （苯）,某些化合物的荧光效率,(四)、量子产率与分子结构,荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的-电子共轭体系分子中，任何有利于提高-电子共轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。,化合物 荧光效率 平均波长 苯 0.0
3、7 283 联苯 0.18 316 对联三苯 0.93 342,化合物 荧光效率 平均波长 苯 0.07 283 萘 0.23 334 蒽 0.36 402 苯 0.07 283 甲苯 0.17 285 乙苯 0.18 286,(五)、荧光分析的特点 1、灵敏度高 2、选择性好 3、仪器简单 4、应用范围广,二 荧光定量分析基础,If = fIa= f ( Io-I ),If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率,(一)、荧光强度与浓度,将指数展开：,如果吸光度A 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：,f I0, b,由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光
4、强度与浓度成正比,即：,(二)、荧光熄灭,If,C,0,1、内滤效应 发射的荧光在溶液中通过时被基态分子所吸收而使荧光强度下降的现象。,2、淬灭效应 碰撞淬灭： 荧光分子之间或荧光分子与熄灭剂分子之间碰撞引起的荧光熄灭效应,M + h M* (吸光） M* M + h （发生荧光） M* + Q 熄灭,例如：芳香烃的荧光可以被溶解 O2 所淬灭,转入三线态的淬灭,含溴化物、碘化物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物及某些杂环化合物容易转变为三重态，因而易使荧光淬灭,三 荧光分析的仪器,光源,单色器,液槽,检测器,记录器,单色器,I0,If,1、光源 汞 弧灯 山 弧灯 激光光源,气,荧光光源强
5、度 紫外-可见吸收光谱光源,激光诱导荧光 Laser Induced fluorescence,低压汞灯：254 nm,2、单色器 滤光片 棱镜 光栅,400 500 600,nm,Relative FL Intensity,EX,EM,Wavelength /,Stocks 位移,标准1,样品2,Wavelength /,If,荧光光谱,If1 1A1 If2 2A2,=,量子产率的测定,1 A1 If1 2 A2 If2,=,奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。,荧光分析的缺点散射光影响,磷光分析的仪器,光源,检测器,贝克勒耳圆盘,低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护
6、流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析,磷光分析的缺点仪器复杂，需要固体基质或保护,化学发光分析的仪器,记录器,四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）,(一)、理论基础 1、分子发射光谱与分子能级结构,振动弛豫,（1）分子吸收光谱与分子荧光光谱,吸光,荧光,250 300 350 400 450,蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱,相对强度,300 400 500,相对强度,荧光光谱与吸收光谱镜像对称 荧光光谱较吸收光谱简单,硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱,（2）荧光量子产率（荧
7、光效率）,发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量,荧光效率（f）=,发出光子数 吸收光子数,如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。,化合物 荧光效率 溶剂 荧光素 0.92 （0.1MNaOH） 曙红 0.19 （ 0.1MNaOH） 罗丹明B 0.97 （乙醇） 蒽 0.31 （己烷） 核黄素 0.26 （水，pH7） 菲 0.10 （乙醇） 萘 0.12 （乙醇） 酚 0.22 （水） 叶绿素 0.32 （苯）,某些化合物的荧光效率,（3）量子产率与分子结构,荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的-电子共轭体系分子中，任何有利
8、于提高-电子共轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。,化合物 荧光效率 平均波长 苯 0.07 283 联苯 0.18 316 对联三苯 0.93 342,化合物 荧光效率 平均波长 苯 0.07 283 萘 0.23 334 蒽 0.36 402 苯 0.07 283 甲苯 0.17 285 乙苯 0.18 286,2、 荧光定量分析基础,If = fIa= f ( Io-I ),If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率,（1）荧光强度与浓度,将指数展开：,如果吸光度A 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：,K =,f I0
9、, b,由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：,（2）荧光熄灭,If,C,0,内滤效应 发射的荧光在溶液中通过时被基态分子所吸收而使荧光强度下降的现象。,淬灭效应 碰撞淬灭： 荧光分子之间或荧光分子与熄灭剂分子之间碰撞引起的荧光熄灭效应,M + h M* (吸光） M* M + h （发生荧光） M* + Q 熄灭,例如：芳香烃的荧光可以被溶解 O2 所淬灭,转入三线态的淬灭,含溴化物、碘化物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物及某些杂环化合物容易转变为三重态，因而易使荧光淬灭,(二)、 荧光分析的仪器,光源,单色器,液槽,检测器,记录器,单色器,I0,If,1、光源
10、汞 弧灯 山 弧灯 激光光源,气,荧光光源强度 紫外-可见吸收光谱光源强度,激光诱导荧光 Laser Induced fluorescence,低压汞灯：254 nm,2、单色器 滤光片 棱镜 光栅,400 500 600,nm,Relative FL Intensity,EX,EM,Wavelength /,Stocks 位移,标准1,样品2,Wavelength /,If,荧光光谱,If1 1A1 If2 2A2,=,量子产率的测定,1 A1 If1 2 A2 If2,=,奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。,荧光分析的缺点散射光影响,（3）荧光分析的特点 灵敏度高 选择
11、性好 仪器简单 应用范围广,第二节 磷光分析法,低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析,一 低温磷光分析法,低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，在液氮（温度77K）条件下形成刚性玻璃状物后，测量磷光.这样，可减小分子间的碰撞，防止磷光猝灭.所用的溶剂应具备下列条件： 易于制备和提纯；能很好的溶解被分析物质；在77K温度下应有足够的粘度并能形成明净的刚性玻璃体；在所研究的光谱区背景要低，没有明显的光吸收和光发射现象.表3.2列出了部分低温磷光分析常用试剂.,低温磷光分析常用试剂,二 室温磷光分析,低温磷光需要适当的低温条件，限制了它的应用及发展.室温磷光
12、分析避免了低温条件，将试样固定在滤纸、硅胶、氧化铝、玻璃纤维、淀粉、溴化钾等基体上，以增加其刚性，减少三重态的碰撞猝灭，增强磷光相对强度.,磷光分析的仪器,光源,检测器,贝克勒耳圆盘,第三节 化学发光分析法,化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射称为化学发光，根据化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来确定物质含量的方法称为化学发光分析法。,一 化学发光分析的基本理论,(一)化学发光反应的基本要求： (1).化学反应必须提供足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态.如果在760nm280nm的可见紫外光区产生化学发光，则要求化学反应提供160420
13、KJ.mol-1之间的能量，具有过氧化物中间产物的氧化还原反应一般能满足这种要求.因此，化学发光反应大多数是有H2O2、O3等参加的高能氧化还原反应. （2）.吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态时，能以光的形式释放出能量，或把能量转移到一个合适的接受体上，该接受体能以光的形式释放能量，产生敏化化学发光(sensitzed chemiluminescence).,化学发光效率CL,化学发光效率等于激发态分子的产率Ce和激发态分子的发光效率em之乘积.,化学发光的强度与反应物浓度间的关系,根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，
14、在5秒之内峰值衰减90，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.,灵敏度和检出限,化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.,二 化学发光分析的主要类型,(一)液相化学发光 1.鲁米诺(Luminol) 体系 2.光泽精（lucigenin）体系 3.过氧草酰（peroxyoxalate）体系 (二)气相化学发光,分立取样式液相化发光仪,化学发光分析的仪器,记录器,Chemiluminescence Sensors based on Enhanced emission on Rare-earth doped nanoparticles,Zhenyu Zhang, et al, submitted to Anal. Chem.,