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1、抗体的精制,免疫球蛋白的分离纯化的含义,以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。 通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。 因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。,球蛋白（ IgG ）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的 75 ，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化 IgG 。,免疫球蛋白的主要成分,对免疫球蛋白的分离纯化有两方面的含义： 一是从理化性质上提取均质的免疫球蛋白部分，去除
2、杂质蛋白、提高免疫球蛋白的含量。 二是从免疫学角度上提取对某种特定抗原的特异性抗体，这种特异性抗体可以是几类免疫球蛋白 (IgG ， IgM，Ig E) 的混合物。,免疫球蛋白的分离纯化的含义,抗体分离纯化的方法,在血清中的抗体活性是相对稳定的，因此要根据实验的要求，减少不必要的纯化过程，保证抗体的活性和避免抗体绝对量的损失。 中性盐沉淀法是抗体分离和纯化的首选方法，但利用盐析法提取的免疫球蛋白，不能得到纯净的免疫球蛋白。 欲获得较纯净产品，还需要结合其他方法，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析、区带电泳等进行进一步分离纯化。,盐析法 (中性盐沉淀法),盐析的原理,溶液中高浓度的中性盐离子有很强的
3、水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。 不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。,免疫球蛋白的盐析条件,许多中性盐都能使蛋白质盐析，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常用的为硫酸铵，因它具有溶解度高且受温度影响较小的优点，在室温或冰箱 (4 ) 内均可进行。 一般认为在 pH7.0 时， 50 硫酸铵饱和度可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。 33 饱和度时，大部分 IgG 可沉淀出来。 40 饱和度时，沉淀物的得率最高，但含 IgM，IgA 等球蛋白部分增多。,注意事项,温度
4、：抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室温可以使抗体失活，因此提取免疫球蛋白最好在 2-4 条件下进行。 等电点：蛋白质在等电点时的溶解度最低，兔 IgG 的等电点为 pI 8.0 ，操作时应该避开使用等电点附近的缓冲溶液。 蛋白质的浓度：蛋白质的浓度过高时，会出现欲分离的蛋白与其它蛋白质一起共沉的现象因此蛋白质浓度应在 2.5-3% 为宜。浓度过高时应用 PBS 稀释。,离子交换法,离子交换的原理,同等电聚焦电泳一样，离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷相结合，蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。 余下的蛋白质均结合在树脂上，由于其蛋白质表面电荷性质的不同，
5、与树脂的亲和力也各不相同。 利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。,阴阳离子交换,标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链，和不溶性的树脂结合而成。 DEAE 等阴离子交换树脂侧链电荷为正。 CM 等阳离子交换树脂侧链电荷为负。 若蛋白质所带净电荷为负，则需用阴离子交换树脂进行纯化，反之则使用阳离子交换树脂。,免疫球蛋白的离子交换,采用 DEAE-纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的 Ig 的纯化，效果尤为显著。 IgG 的等电点为 pI=8.0 ， IgM ， IgA 的等电点为 pI 7.0 ， 7.4 ，在 pH 8.0 时 IgG 带正电荷，不能被 DE
6、AE-纤维素吸附而被洗脱下来。 被 DEAE-纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中 离子浓度的方法将其逐一洗脱，或降低 pH 使之洗脱出来。,利用DEAE-cellulose 52离子交换层析分离抗体,DEAE-cellulose 52 chromatography of anti-serum specific to a characteristic protein component of GR,注意事项,进行离子交换层析的最佳溶液 pH 值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位，这可使蛋白质的净电荷量即可保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或 pH 值相
7、差悬殊的苛刻洗脱条件。 离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以碱酸碱的顺序进行处理，阳离子交换树脂以酸碱酸的顺序进行处理和再生。 装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象，加样蛋白浓度低于 20 毫克/毫升，上样体积小于柱体积的 1/3 ，流速控制在 0.2-0.5 毫升/分钟。,亲和层析法,亲和层析法的原理,亲和层析是利用生物分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术如抗原和抗体，蛋白质A与一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。 当把可结合的一对分子的一方 (称配体) 结合在
8、惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。,载体的选择,使配体固相化的不溶性化合物称为载体，用于亲和层析的理想载体应该具备下述持性：。 高度亲水：使固相配易于同水溶液中的相应结合物接近； 惰性载体：使载体的非专一性吸附尽可能小； 具有相当量可供活化的化学基团：并在温和条件下能与较大量配体连接； 有较好的物理化学稳定性：不易受周围条件的影响。(如PH ，离子强度，温度，变性剂和去污剂等),具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度； 有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好是均
9、一的珠状颗粒。,琼脂糖凝胶,抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶颗粒，球状琼脂糖凝胶获水能力很强，物理和化学性质比较稳定。它具有疏松的网状结构，可让分子量上百万的大分子产物自由通过。 因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不但可以较长期的反复使用，而且可以采用蛋白变性剂作为洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液 缺点是琼脂糖经不起有机溶剂处理，也不能进行干燥 (包括冷冻干燥) 。,常用的配体,抗体纯化中常用的配体是抗原。根据抗原和抗体能形成抗原-抗体复合物的特性，发展了免疫吸附技术。 将可溶性抗原用化学方法偶联到不溶性载体上，使之固相化，将相应的抗血清按层析法加入柱中，抗血清中相应的抗体就与
10、抗原特异结合，其它蛋白成分随洗液流出。再改变缓冲液的 PH 和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体上的抗原分开而被洗脱下来，从而得到纯净的抗体。 抗体纯化中常用的配体还有蛋白A和蛋白 G 。,蛋白A,蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白抗原成分，它是单一的多肽链分子量为42,000分为5个片段，从N末端开始的4个由58-62个氨基酸残基组成的高度同源的片段。 每个片段都具有和IgG的Fc段结合的活性，但就整个蛋白A分子而言，只能与2个Fc段结合，这种结合是一种疏水结合，可在一定条件下，将IgG从蛋白A解脱下来。 蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反复处理的性能，大多数抗体都能耐受短暂的低pH处
11、理。,蛋白G,蛋白G是链球菌表面的一种蛋白，分子量为30,00035,000，它对免疫球蛋白的吸附机制与蛋白A相似。 蛋白G对各种免疫球蛋白的吸附能力与蛋白A不同，故在抗体的纯化上可与蛋白A互补。当某些抗体对蛋白A没有吸附能力时，它们往往会对蛋白G有吸附作用 。,蛋白A/G对来自不同种属抗体的亲和性,种属 蛋白A亲和性 蛋白G亲和性 人 + + 马 + + 牛 + + 绵羊 +/- + 山羊 - + 家兔 + + 鸡 - + 豚鼠 + + 大鼠 +/- + 小鼠 + +,层析条件的选择,亲和层析一般采用柱层析法，在亲和吸附时，亲和柱使用的平衡缓冲液的组分， pH 和离子强度都应选择亲和双方作用
12、最强，最有利于形成复合物的条件。 根据生物大分子的特点，一般选取接近中性 PH 作为亲和吸附条件，上柱时样品液一般应与亲和柱平衡缓冲液一致，通常是上柱前样品先对平衡缓冲液进行充分透析。 上柱流速尽可能缓慢，对流出液需进行定量测定，以判断亲和吸附效率。,样品的洗脱,样品通过亲和柱后，用大量的平衡缓冲液洗去杂质，直至流出液中不含蛋白。 然后再用洗脱液洗脱，洗脱液能减弱配体和亲和物之间的亲和力，使该结合物完全解离。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在时为止。 再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，加入防腐剂，存放于冰箱 (4 ) 中，以备下次再用。,凝胶过滤,凝胶过滤也用于 IgG 和 IgM 类单克隆抗体的分离纯化。 常用 Sephadex G200 作分离介质，可以回收到 3 个峰，最高峰为 IgM ，另外两个为 IgG ，抗体回收率达到 50-80% ，能除去微量的杂蛋白，抗体的纯度可以达到 95% 以上。,