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1、1,第34章 DNA的复制和修复,3,分子生物学的中心法则(central dogma) DNA RNA 蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,4,一、DNA复制 （一）半保留复制（semiconservative replication）,模板 原则 特点,亲代DNA双链，每股链都可作为模板 按碱基配对原则指导新链合成 合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样 一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链,5,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新链,6,Old strand,New strand,The hypothesis of semiconservative r
2、eplication proposed by Watson and Crick in 1953.,Radioisotope labeling and density gradient centrifugation clearly distinguishes replications of semiconservative from conservative. （1958）,8,9,10,11,A electron micrograph of the replication intermediate of a plasmid DNA: -shaped structures were observ
3、ed; no single stranded DNA is visible.,No complete unwinding of the two parental strands occurred before the daughter strands are synthesized,12,（二）半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶 2、 前导链与随从链（岗崎片段）,13,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,14,前导链（leading strand）： DNA复制时
4、，一股以3 5方向的母链作为模板，新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致）,15,随从链（lagging strand): DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。 （复制方向与解链方向相反),岗崎片段（Okazaki）,岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链,16,DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5 3方向合成许多不连续的片段（岗崎片段） 这种复制方式称之为半不连续复制。,17,（三）RNA引物,DNA聚合酶 不能催化两
5、个游离dNTP在DNA模板上聚合 需要具3-OH的引物 引物最后被DNA聚合酶除去、补满，再由连接酶连接,RNA聚合酶 能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合,减少突变，提高DNA复制的真实性,18,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,19,严格的碱基配对规律 RNA引物 聚合酶的选择作用 复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能 DNA损伤的修复机制,（四）复制的真实性,20,(五）参与DNA复制的酶类和蛋白质,dNTP Mg+ 3-OH引物 DNA模板 酶和蛋白质因子,DNA链合成的条件：,21,DNA聚合酶/ 解旋酶 单链结合蛋白(SSB） 拓
6、扑异构酶/ 引发体 DNA连接酶,酶和蛋白质因子,22,23,24,1、DNA的聚合反应,25,26,2、大肠杆菌DNA聚合酶（原核生物）,3,5-磷酸二酯键,3,5,图12-4,包括5种DNA聚合酶: pol、,27,DNA聚合酶 多功能酶 5 3外切酶 3 5外切酶 5 3聚合酶 单链多肽（Zn2+） 大小二个片段 切除RNA引物 填补空缺 损伤后修复,DNA聚合酶 多功能酶 5 3聚合酶 3 5外切酶 不对称二聚体 单体1-前导链/单体2-随从链 DNA复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性,28,29,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3 外切酶,小片段 35KD
7、,大片段（ klenow片段） 68KD,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,（1）、DNA聚合酶（DNA Polymerase） Kornberg酶、DNA指导的DNA聚合酶 （DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）,聚合功能,30,Large（Klenow）fragment of DNA pol ,31,32,33,DNA pol 合成速度太慢 持续合成能力低 影响DNA复制的基因突变与DNA pol 无关,仅参与局部修复，不是真正的复制酶,（2）、DNA聚合酶全酶 （DNA Polymerase holoenzyme）,10种亚基组成，含锌
8、 2 (4个) DNA聚合酶全酶,核心聚合酶 连接两个核心聚合酶 夹钳装置复合体 星环状,容纳DNA双链,Sliding clamp subunits,聚合酶活性,聚合酶活性,3 5 外切活性, 复合物， 促进亚基结合于DNA,DNA pol III （复制酶）,无5-3 外切酶活性 组成核心酶,促进核心酶 形成二聚体,组装,2 ,36,37,38,真核细胞的DNA聚合酶,五种 DNA 聚合酶 DNA聚合酶和PCNA DNA聚合酶 DNA聚合酶、,引物的合成 前导链、随从链合成 参与线粒体DNA的合成 参与DNA的修复,增殖细胞核抗原（ 类似于亚基）,39,（3）、DNA聚合酶、,DNA聚合酶
9、 5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 DNA聚合酶和(1999年以后发现） DNA受严重损伤时诱导产生 跨越受损部位 使复制缺乏准确性,（修复酶）,40,3、DNA解旋酶及SSB,DNA解旋酶（helicase） 单链结合蛋白 (SSB）,解开DNA双链 每对碱基消耗2个ATP 维持单链状态 使其不受核酸酶水解 避免单链DNA自身发夹螺旋形成 使前端螺旋易解开,大肠杆菌SSB与DNA结合具有协同效应,41,4、DNA拓扑异构酶,Linking number,两条链的互绕数,42,43,44,45,47,48,49,50,含拓扑异构酶（及H1） 与DNA复制及转录有关,51,拓扑异构酶/ （to
10、poisomerase） 拓扑异构酶/ 旋转酶 （gyrase）,切断DNA双螺旋中一股，张力下降后封闭 消除负超螺旋 不需能量 切断DNA双链 引入负超螺旋 需ATP供能,（1）、大肠杆菌的拓扑异构酶,52,磷酸二酯键的转移,53,54,55,56,拓扑异构酶 拓扑异构酶 类型 ：切断DNA双螺 旋中一股；不需能量 拓扑异构酶/,消除正/负超螺旋 消除负超螺旋 消除正/负超螺旋 不能导入负超螺旋,（2）、真核细胞的拓扑异构酶,57,5、引物酶和引发体,DNA聚合酶只能在模板链的指令下，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，没有从头合成活力； 引物酶合成一小段RNA，作为DNA合成的引
11、物； 必须与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物的活性。 如：DnaA、DnaB、DnaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等,59,6、DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,3 OH,5,5,3,O O- P O O-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,O O P O O-,5,3,缺口封闭,60,哺乳动物：ATP供能， 大肠杆菌：NAD供能， 都需要Mg2+,61,62,63,缺口填补: 连接双股DNA分子中一链的切口 双链DNA分子中双链的切口 不能连接二分子单链DNA,64,（1）岗崎片段之间的连接 （2）DNA损伤修复中的连接 （
12、3）一种重要的工具酶: 限制性内切酶切割后形成的粘性末端 或平头末端的连接,应用:,65,66,（三）DNA复制的过程(起始、延伸、终止）,确定复制的起始点 解开双链DNA,提供单链DNA模板 形成复制叉 DNA合成的起始和延长 形成带有新合成的DNA片段的复制泡 复制的终止,67,原核生物 双向复制 （型复制） 特定起始点：oriC,真核生物 多个复制单位（复制泡） （复制起始点+复制叉） 多个起始点,1、复制的起始,68,大肠杆菌复制起始点oriC的结构,（1）9个核苷酸的重复序列4个,（2）13个核苷酸的重复序列3个,69,形成起始复合物,类组蛋白,70,DNA的甲基化与复制的发动有关,
13、Oric中含11个GATC Dam甲基化酶使A上N6甲基化（亲代） 半甲基化的Oric可与细胞膜结合,71,原核生物双向复制（型复制）,72,真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）,74,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成3，5磷酸二酯键,解旋酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解旋酶,拓扑异构酶,75,（1）.DNA聚合酶的作用 （2）.前导链合成1000-2000个核苷酸后， （3）.随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌） （4）.Po
14、l为不对称二聚体： 一个作用于前导链 另一个作用于随从链(loop),2、复制的延伸,后滞链中引物不断被合成,3,85,3、复制的终止,去除RNA引物 补充空缺 连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶 DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶 DNA连接酶,86,3,5,5,3,89,（七）真核细胞端粒DNA的复制,真核生物的线性染色体DNA 每复制一次，子链5有缺失 末端有特殊序列-端粒 特征: 由数百个串联重复的6核苷酸组成 人:5-AGGGTTAGGGTT-3 端粒能稳定染色体,1.端粒(telomere),90,二十世纪三十年代，遗传学家Barbava McClintock和
15、Hermann J.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。 如缺少染色体间会互相粘连、出现结构变化或其它错误行为，以致影响染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。,“端粒” （telomere）,希腊语末端“telos”和部分“meros” 端粒 telomere,端粒帽 染色体 端粒帽,1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：,端粒 染色体DNA 端粒,人端粒的分子组成：,93,线形DNA复制末端问题,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒 染色体DNA 端粒,95,组成 蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板) 唯一携带RNA模板的逆转录
16、酶 人端粒酶: 模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5 合成(DNA): 5-AGGGTT-3 端粒酶和衰老、肿瘤有关,2.端粒酶（telomerase),3、端粒酶的作用机制,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,末端补齐机制：,5,GGGGTT,（GGGGTT）n,端粒酶,5,3,5,DNA聚合酶,99,100,101,以延长的DNA单链为模板, 3-OH为引物合成富含C的 互补链,端粒帽 染色体DNA
17、端粒帽,n（CCCCAA） （TTGGGG）n,n（GGGGTT） （AACCCC）n,3,5,端粒结合蛋白,保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用 一般是紧密的非共价键结合,104,哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构, 环状DNA+蛋白质 保护染色体末端的稳定,端粒的环状结构,端粒酶与细胞存亡,端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,染色体DNA,端粒,端粒,108,DNA修复的基础： 一条链有损伤 修复酶切除 以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列,
18、二、DNA的损伤修复,109,110,（一）造成损伤的原因,自发因素 物理因素 化学因素,紫外线损伤（共轭双键） 电离辐射损伤（X线/线） 亚硝酸盐 C U 5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂 羟胺 C- A,G,G,羟胺,DNA复制时碱基的错误配对 罕见态碱基引起T-G、A-C错配,N H N,N H N,N,N,N,N,N,N,N,N,O H O,O H NH,O H O,O H NH,CH3,CH3,烯醇式T,酮式G,酮式T,烯醇式G,T-G错配,DNA自发损伤,C-A错配,NH N,N H N,HN HNH,HNH NH,N,N,N,N,N,N,N,N,O,O,亚氨基式C,亚氨
19、基式A,氨基式A,氨基式C,环出效应引起碱基错配,新合成链 TGGC TGGCA TGGCAATG 模板链 ACCGATAG ACCGTAG ACCGATAG,A,l l l l l l l l l l l l l l l l l,环出效应引起碱基缺失或插入 新合成链 TTTT TTTT TTTTGAC 模板链 AAAAACTG AAAACTG AAAACTG,l l l l l l l l l l l l l l l,A,A,新合成链 TTTT TTT TTTTTGAC 模板链 AAAAACTG AAAACTG AAAAACTG,T,T,l l l l l l l l l l l l l l
20、 l,114,115,116,117,118,119,羟胺（hydroxylamine，HA） 使C的化学成分发生改变，不能与G配对，而与A互补。经两次复制后，C-G对变换成T-A对。,120,（二）修复机制,1、光修复 （低等生物） 不需光复活酶 需光复活酶,（photoreactivation repair） 嘧啶单体 嘧啶二聚体 嘧啶单体 嘧啶二聚体 光复活酶（+） 蓝光,280nm,239nm,121,光复活/光修复 光复活酶识别TT 与之形成复合物 吸收光能 使TT解开成为单体 酶从复合物中释放 仅作用于UV形成的产物,O6甲基鸟嘌呤直接被修复,123,1949年A.凯尔纳偶然发现灰
21、色链丝菌等微生物经紫外线(UV)照射后如果立即暴露在可见光下则可减少死亡。此后在大量的微生物实验中都发现了这种现象，并证明这是许多种微生物固有的DNA损伤修复功能,并把这一修复功能称为光复活。1958年R.L.希尔证明即使不经可见光的照射，大肠杆菌也能修复它的由紫外线所造成的DNA损伤，而后又证明其他微生物也有这种功能,当时就把这种修复功能称为暗复活或暗修复。此后发现暗修复普遍地存在于原核生物、低等真核生物、高等真核生物的两栖类乃至哺乳动物中，并证实暗修复包括切除修复和复制后修复两种。 1968年美国学者J.E.克利弗首先发现人类中的常染色体隐性遗传的光化癌变疾病着色性干皮病(XP)是由基因突
22、变造成的 DNA损伤切除修复功能的缺陷引起的。这一发现为恶性肿瘤的发生机理提供了一个重要的分子生物学证据,也使DNA损伤修复的研究进入了医学领域。,124,光复活酶已在细菌、酵母菌、原生动物、藻类、蛙、鸟类、哺乳动物中的有袋类和高等哺乳类及人类的淋巴细胞和皮肤成纤维细胞中发现。这种修复功能虽然普遍存在，但主要是低等生物的一种修复方式，随着生物的进化，它所起的作用也随之削弱。,125,（1） 特异核酸内切酶切除 DNA聚合酶填补、修复 DNA连接酶连接 （2） 人体重要的修复方式 （3）缺乏UV特异核酸内切酶 着色性干皮病,2、切除修复（excision repair）,切除修复发生在复制之前,
23、核苷酸切除修复,127,dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP 胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U 尿嘧啶-N-糖苷酶,腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤 次黄嘌呤-N-糖苷酶 烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去,AP位点（apurinic/apyrimidinic site）,聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力不高,128,碱基切除修复,DNA糖苷酶识别切除改变的碱基 核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接,129,DNA糖苷酶具特异性 识别-DNA中的异常碱基 水解-异常碱基与脱氧核糖间糖苷键 使其脱落,130,131,DNA碱基的组成为何是“T” ？ （1）DNA中的C容易突变
24、成U （2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U （3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U DNA中T的存在增加遗传信息的稳定性 RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,133,134,着色性干皮病患者的皮肤部位缺乏核酸内切酶，不能修复被紫外线损伤的皮肤的DNA，因此在日光照射后皮肤容易被紫外线损伤，先是出现皮肤炎症，继而可发生皮肤癌。另外，患者还可能同时伴有眼睛和神经的症状。 着色性干皮病首先表现为对日光的高度敏感，这个症状在出生后不到一岁就可能出现，也就是说患者经轻度日晒后就会皮肤发红，出现雀斑样损害，甚至出现水疱，继而出现皮肤萎缩、变薄、毛细血管扩张、色素沉着和色素脱失、皮肤干燥、脱屑
25、等，日久可引发皮肤的良性或恶性肿瘤，包括皮肤的基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、角化棘皮瘤、血管瘤和血管肉瘤等。肿瘤一般在10岁内出现，大多数患者在20岁前就发展为肿瘤期。,135,耗能的过程,3、错配修复,DNA错配修复的模型,4、重组修复（recombinational repair）,141,二聚体后起始途径复制继续 子链缺口经重组由母链相应片段填补 RecA 蛋白具有交换DNA链活力 母链缺口再合成 二聚体未被去除而是逐渐被稀释,复制后修复,142,5、易错修复,DNA受到损伤或复制系统受到抑制 SOS反应 诱导修复系统： 避免差错的修复（error free repair） 易错修复
26、（error prone repair）,143,SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApol、 引起校对系统的松懈 RecA基因产物 LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活） SOS系统开放：修复系统的酶表达,LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转,144,SOS反应,紫外线,与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质,Lex A阻遏蛋白,DNA,145,147,（一）突变的类型,点突变 类型 结果,转换-同型碱基 颠换-异型碱基 启动子/剪接信号 影响整个基因功能 编码序列 蛋白质功能改变 中性变化 AA变化，功能不变 静止突变 碱基变，AA不变,三、DNA突变,148,缺失 插入 倒位,一个碱
27、基/一段核苷酸/整个基因 一段原来没有的碱基/核苷酸序列 DNA链内部重组，一段方向颠倒,150,（二）诱发基因突变的因素,根据突变发生的原因可将突变分为: 自然条件下未经人工处理而发生的 自发突变（spontaneous mutation） 经人工处理而发生的突变 诱发突变（induced mutaion） 诱发突变的各种内外因素统称为： 诱变剂（mutagen）,H N,NH,O,Br,o,N,NH,O,Br,OH,HN,NH,O,O,CH3,酮式5-BU 烯醇式5-BU 胸腺嘧啶,1、碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU),与G配对,与A配对,化学因素,烯醇式 5- BU与G的配对,N,N
28、,O,Br,O-H,H-N,H-N,H,N,O,N,N,5-BU引起的 A-T G-C 转换,A-T,第一次复制,A-T,A-BU,（酮式）,第二次复制,A-BU（酮式）,G-BU （烯醇式）,第三次复制,A-BU,G-BU,G-C突变,A-T,154,2、碱基修饰剂,脱氨剂：诱导碱基脱氨、点突变 亚硝酸钠、亚硫酸氢钠 羟胺 烷化剂,A,I与C配对,脱氨,C,G,U与A配对,X仍与C配对,脱氨,脱氨,芳基化剂引起的DNA损伤 可与DNA形成共价化合物,OH,HO,HO,G NH,苯并芘,苯并芘二羟环氧化物 与鸟嘌呤加合物,156,3、嵌入染料诱发的突变 一类较强的诱变剂,N,NH2,H2N,原
29、黄素的结构 原黄素插入母链两个碱基之间，结果多一个核苷酸；插入子链两个碱基之间，正常碱基不能插入，结果少一个核苷酸 后果：引起移码突变,157,4、紫外线和电离辐射,紫外辐射：产生相邻碱基二聚体，T=T最常见 电离辐射：直接作用于DNA分子 间接作用（辐射产生的活性氧） 碱基损伤、糖环断裂、DNA链断裂或交联 生物因素：可移动基因成分 插入或切断基因、病毒、转座子,物理因素,生物因素,158,159,20下列关于大肠杆菌DNA连接酶的叙述哪些是正确的： A催化DNA双螺旋结构之断开的DNA链间形成磷酸二酯键 B催化两条游离的单链DNA分子间形成磷酸二酯键 C产物中不含AMP D需要ATP作能源
30、,160,16插入或缺失碱基对会引起移码突变，下列哪种化合物最容易造成这种突变： A口丫啶衍生物 B5-溴尿嘧啶 C氮杂丝氨酸 D乙基乙磺酸 E咪唑硫嘌呤 17在对细菌DNA复制机制的研究中，常常用到胸腺嘧啶的类似物5-溴尿嘧啶，其目的在于： A引起特异性移码突变以作为顺序研究用 B在胸腺嘧啶参入部位中止DNA合成 C在DNA亲和载体中提供一个反应基 D合成一种密度较高的DNA以便用离心分离法予以鉴别 E在DNA中造成一个能被温和化学方法裂解的特异部位,161,13下列哪种突变最可能是致死的： A腺嘌呤取代胞嘧啶 B胞嘧啶取代鸟嘌呤 C甲基胞嘧啶取代胞嘧啶 D缺失三个核苷酸 E插入一个核苷酸
31、10大肠杆菌DNA连接酶需要下列哪一种辅助因子？ AFAD作为电子受体 BNADP+作为磷酸供体 CNAD+形成活性腺苷酰酶 DNAD+作为电子受体 E以上都不是 8从正在进行DNA复制的细胞分离出的短链核酸冈崎片段，具有下列哪项特性： A它们是双链的 B它们是一组短的单链DNA片段 C它们是DNARNA杂化双链 D它们被核酸酶活性切除 E它们产生于亲代DNA链的糖-磷酸骨架的缺口处,162,4下列关于DNA复制特点的叙述哪一项错误的： ARNA与DNA链共价相连 B新生DNA链沿53方向合成 CDNA链的合成是不连续的 D复制总是定点双向进行的 EDNA在一条母链上沿53方向合成，而在另一条
32、母链上则沿35方向合成 1DNA按半保留方式复制。如果一个完全放射标记的双链DNA分子，放在不含有放射标记物的溶液中，进行两轮复制，所产生的四个DNA分子的放射活性将会怎样： A半数分子没有放射性 B所有分子均有放射性 C半数分子的两条链均有放射性 D一个分子的两条链均有放射性 E四个分子均无放射性,163,（ ）1中心法则概括了DNA在信息代谢中的主导作用。 （ ）2原核细胞DNA复制是在特定部位起始的，真核细胞则在多个位点同时起始进行复制。 （ ）4因为DNA两条链是反向平行的，在双向复制中一条链按53的方向合成，另一条链按35的方向合成。 （ ）6重组修复可把DNA损伤部位彻底修复。,164,165,前导链合成中只需要一个引物,(DnaB),166,167,5、引物酶和引发体,蛋白质 DnaA DnaB 引物合成酶,结合到DNA双链复制起始部位(需ATP) 解链酶的作用 合成RNA引物,DNA聚合酶只能在模板链的指令下，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，没有从头合成活力； 引物酶合成一小段RNA，作为DNA合成的引物； 必须与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物的活性。 如：DnaA、DnaB、DonaT、PriA、PriB等,168,169,170,171,172,