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1、拟南芥TDNA 插入 突变体的鉴定 1、反向遗传学 经典遗传学：由表及里，即通过杂交等手段观察表型性 状的变化而推知遗传基因的存在与变化。 表型基因 反向遗传学：由里及表，即通过DNA重组等技术有目 的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这 些变化对表型性状的直接影响。 基因表型 研究基因功能的方法 1、转基因技术 2、基因敲除 3、基因敲入 4、基因诱导超表达 5、基因诱捕技术 6、 RNAi干扰 7、生物信息学分析 8、反义技术 1、反向遗传学 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 T-DNA插入突变技术，通过插入已知序列的T-DNA，破坏 目标基因的结构使之沉默；将目的基
2、因插入到Ti质粒的T- DNA上，通过农杆菌的转化作用，将目的基因整合到植物细 胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表 达 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感 染能力。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA) ，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。 Ti质粒 已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，而外基 因就是整合到T-DNA上的。 农杆菌质粒 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技
3、术 During tumour induction, Agrobacterium attaches onto plant cells and then transfers part of its DNA to some of these cells. The transferred DNA (T-DNA) which is found on a large Ti (tumour inducing) plasmid ，is modified within the bacterium and is transferred to the plant where it becomes integrat
4、ed into the plant genome. the mechanism of T-DNA insertion Proteins which are encoded by the virulence (vir) region of the Ti plasmid regulate the T-DNA modification and transfer. Phenolic compounds that are derived from a wounded plant cell induce expression of the vir region genes. Virulence prote
5、ins recognise the border sequences (LB、RB)that define the T-DNA. In the presence of VirD1 protein, VirD2 cleaves the border sequence. A single-stranded T-DNA is produced when the nicked DNA is released from the plasmid. 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 the mechanism of T-DNA insertion 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术
6、 In the plant cell, the T-DNA is coated with the single-stranded DNA-binding protein, VirE2. The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome. the mechanism of T-DNA insertion 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 转 化 过 程 示
7、意 图 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 来源：arabidopsis.info/students/paaras/t_dna.htm 3、反向遗传学方法研究赤霉素糖苷转移酶基因 （1）研究背景 （2）模式生物拟南芥 （3）筛选纯合突变体 （4）表型鉴定 （1）研究背景 赤霉素可促进叶和芽的生长，用于农业生 产，在某些方面有较好的效果。赤霉素的 生物合成和代谢对赤霉素活性的调控作用 已了解的比较清楚。 植物界广泛存在的赤霉素糖基化修饰对赤 霉素活性的作用，以及糖基化修饰能否调 控以及如何调控赤霉素的活性并进而影响 植物的生长发育的问题尚未解决。 拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植
8、物遗传学、发育 生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物 。 植物特点： (1) 生长周期短, 6周内完成; (2) 基因组小, 仅有5 条染色体,113 亿个碱基对,但是它的大多数基因与 其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性， (3) 具有双子叶植物的所有特性 (4) 有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源; (5) 在有限的空间内可大量种植，体形小, 占地少 (6) 收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000 粒种子； (7) 生活力强，用普通培养基就可作人工培养。 （2）模式生物拟南芥 Arabidopsis thaliana 目前已经完成测序的植物有三种
9、：拟南芥 、水稻、毛果杨(Populus trichocarpa)。 美国NCBI下面的植物基因组数据库资料： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLAN TS/PlantList.html 拟南芥的基因敲除文库的建立 实验方案设计 1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具 有赤霉素糖基转移酶的基因。 2.获得种子 进入如下网站http:/arabidopsis.org/index.jsp，输入 种子基因型号。 （3）筛选纯和突变体 1、实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 点击进入基因序列信息网页 实验方案设计 （3）筛选纯和突变体 实验
10、方案设计 （3）筛选纯合突变体 输入种子基因型号 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 点击进入基因序列网页 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 基因序列网页 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 查找突变体及引物设计 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 输入基因型号 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 查看含有相关基因的种子信息 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 引物设计 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 中间引物的设计 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 两侧引物的设计 实验方案设计 （3）筛选纯合突变体 2、实验材料 赤霉素糖基转移酶基因的T-DNA插入突变种子： SALK_064481
11、.43.20.x LP（左引物）： GCTGGAGTCCACAACTTGAAG Len 21 TM 59.90 GC 52.38 RP（右引物）： AACTCCTCCTCAAAGGCTCAG Len 21 TM 60.00 GC 52.38 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现 象仪 （3）筛选纯合突变体 实验原理 （3）筛选纯和突变体 三引物法 3、突变体鉴定原理 （3）筛选纯和突变体 “三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。 野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即 从LP到RP的长
12、度） 纯合突变体植株（HM）目的基因的两条染色体上均发生T- DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻 抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB 与RP（或LP，根据T-DNA在基因上插入的方向选择）为引物 进行扩增的产物，分子量约410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段，长度为300+N bp，再加上从LB到T-DNA载 体左边界的片段，长度为110bp）； 杂合突变体植株（HZ）只在目的基因的一条染色体上发生了 T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和片段大小 为基因的长度bp两种产物。电泳结果差异明显，能有效区
13、分 不同基因型的植株。 双引物法 与“三引物法” 本质相同。 实验原理 （3）筛选纯和突变体 首先以基因组 D N A作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增 目的基因片段，野生型和突变杂合体均一条带，纯合突变体 没有条带;然后再以基因组DNA 为模板，由T-DNA 片段的特异 引物(LB)与LP 或RP 组成一对引物，扩增目的基因T-DNA 插入 片,野生型没有条带，杂合体和纯合体一条410+N。 不足之处是完成最终鉴定需进行两轮P C R 扩增。 4.3 电泳并观察结果 配制琼脂糖凝胶，将扩增后的样品加入凝胶 孔电泳，电泳后观察结果。 5.结果分析 使用三引物法PCR检测，若电泳图上出现
14、 一大一小两条带，则为突变杂合体；出现一 条小带，则为突变纯和体；出现一条大带， 则为野生型。 （3）筛选纯和突变体 （4）表型鉴定 反向遗传学 用PCR筛选出突变纯合体后，便可以利用反 向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列 的基因功能的研究。基因敲除所产生的突 变表型，是该基因缺失后的表型，因而直 接表明了该基因的功能与表型的关系，人 们由此可以直接快速的检测得到基因的功 能。 然而，有很多基因敲除突变体没有很明显 的表型作用。 （4）表型鉴定 表型不明显的原因 由于重复基因的存在，一个基因成员的突变导致的功能丧 失会被另一个重复基因所弥补。 有些突变个体只有在特定的环境下、特定生长时期、特
15、定 生理状态下才表现突变性状，这类基因若在非表达阶段被 突变，则不会产生明显的表型突变 一些基因控制生物的代谢过程，并没有表型的改变 在多个生长阶段发挥作用的基因，其突变可能导致早期胚 致死效应，因而也无法鉴定。 瞬间表达的基因、低水平表达的基因，以及在少数细胞中 表达的基因，都很难用基因敲除突变体鉴定。 （Patrick J. Krysan et al，1999 ） （赵霞，周波等，2009） （4）表型鉴定 表型鉴定应对策略 Knock-knock 突变体 环境胁迫 基因捕获载体和激活标签载体。 （4）表型鉴定 Knock-knock 突变体 （Patrick J. Krysan et a
16、l，1999 ） （4）表型鉴定 突变-表型 One can easily determine the precise genotype of large numbers of individual plants by using the T-DNA insertion as a PCR marker for the mutant locus. Such analysis, however, does not prove that the PCR- identified, T-DNAinduced mutation is responsible for the phenotype rather
17、 than a closely linked, unrelated mutation. （4）表型鉴定 方法 l isolate additional mutant alleles for the locus l complement the mutation by introducing a wild-type copy of the gene into mutant plants （Patrick J. Krysan et al，1999 ） 表型鉴定的 一般思路 （4）表型鉴定 4、T-DNA的研究方向与价值 近年来，借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T-DNA插入 技术已被广泛应用于拟南
18、芥等模式植物的突变体库构建中 。 在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用，广泛应用于 大规模植物基因功能分析，是分离新基因、研究基因功能 的有效工具。 构建突变体库，是反向遗传学的突破性技术 之一 局限性： 利用T-DNA插入突变体研究新基因，要求 创建饱和突变体库，需要进行大规模的转 基因工作，因此实验材料需要具有完善的 遗传转化体系（水稻、拟南芥等模式生物 ）。 T-DNA转移和整合机制尚不清楚，有时会 出现多拷贝插入，且容易产生直接的串联 、反向重复和边界缺失等。 4、T-DNA的研究方向与价值 Our team 拟南芥幼苗的移植 用镊子小心地将幼苗从培养基中取出，移入土 ，此过程中注意
19、保护幼苗的根部。 用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制， 以保证营养及透气性。之前用高温杀菌以杀死 土中的害虫。 在不伤根的情况下用镊子尾部将幼苗小心插入 挖好的小洞中，用土掩埋幼苗根部。掩埋过程 中注意保持土质疏松。 一般直径为8cm的小花盆中种植1-2株即可。 移植后幼苗的培养 幼苗移植后将花盆用塑料薄膜覆盖，置于21 ，6300（300）lx光照强度下，前4-6天，每隔 两天浇一次营养液以保持土质湿润。 当植株叶子出现明显伸长，茎开始发育时去掉 薄膜。此后为使植株更好的生长和诱导开花， 可将光照时间延长至14-16h。注意保持土质湿 润。 出现花芽时，一定保持水分供应，以促进果实 发
20、育。 结有豆荚后，减少水分供应至每周一次，以促 进种子成熟。 CTAB法提取拟南芥DNA CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷 基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度 溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶 液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合 物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白， 多糖，酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即可使核酸分离出 来。 CTAB法原理 (1) 将10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，置于60C水浴 中预热。 (2) 称取1.5g叶片，置于预冷
21、的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片 研碎。 (3) 取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之 混匀。 (4) 样品于65保温30分钟。 (5) 加等体积（10mL）的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀 (6) 室温下4000rpm离心10分钟。 (7) 用滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积 的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。 （有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或 者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置 数小时甚至过夜）。 CTAB法提取拟南芥DNA 操作方法 CTAB法提取拟南芥DNA 操作方法 CTAB法提取拟
22、南芥DNA CTAB分离缓冲液 2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris-HCL(pH8.0), 0.2%巯 基乙醇 -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 注意：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料 之前必须预热，且离心时温度不要低于15 CTAB法提取拟南芥DNA EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，因DNase作用需要金属离子作为辅基，所以可抑制DNase活 性； Tris-HCl (pH8.0) （1）提供一个缓冲环境，DNA 在此条件下较稳定。 （2）在中性或碱
23、性条件下，RNA 比DNA更易游离到水相，可 以获得RNA 含量较少的DNA样品。 NaCl提供一个高盐环境，破坏使蛋白质稳定的因素，使蛋白质与DNA分离并沉淀；盐的 阳离子与DNA结合，形成DNA-阳离子盐溶于溶液中；使大量多糖存在溶液中。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。可以降低表面张力，从而减少气泡产 生。 有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶 剂相维持稳定。 氯仿：使蛋白质变性，加速有机相与水相分层。且酚易溶于氯仿中。 异丙醇：夺取DNA周围的水分，使DNA能够聚集沉淀；优点是速度快，所需容积小，缺点是 容易使盐类和DNA共沉淀，在DNA沉
24、淀中难以挥发除去。 70%乙醇：在70%乙醇中，DNA是不溶的，而盐离子却可溶，可以洗去DNA表面的盐；除去 异丙醇。 苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白 与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于 酚相，而DNA溶于水相。 (8) 用下述方法收集DNA： 如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10- 20mL，涤缓冲液中。 如果DNA呈云雾状，可在2000rpm离心1-2分钟，小心地倒 掉上清液，在松散的沉淀上加10-20mL洗涤缓冲液，轻轻 转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。 (9) 洗涤至少20分钟。
25、 (10) 按照（8）法重新收集核酸，并按照（9）法二次洗涤。 (11) 用玻璃棒搅出沉淀或2000rpm离心10分钟。小心倒去上 清液，在室温下使DNA沉淀干燥。 (12) 将DNA沉淀溶于11.5mL TE中，20保存备用。 方法二 Edwards buffer 200mM Tris-HCl ; 200mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5%SDS SDS：一种离子型表面活性剂 作用：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 （4）能抑制核糖核酸酶的作用。 方法二 （1）
26、 取新鲜的拟南芥叶片23片加入1.5ml的离心管中，加入 400l Edwards buffer，用玻璃棒研碎。 （2）振荡器上振荡5秒，室温下16000rpm/min 离心2分钟。 （3）将300 l 离心后的上清液转移到干净的离心管里。 （4）加入300 l 异丙醇，混匀后室温放置2分钟。 （4）室温16000 rpm 离心5分钟。 （5）去上清后用300 l 的70%乙醇洗沉淀，16000 rpm 离心5分 钟，室温下干燥沉淀。 （6）用100l 1X TE (pH8.0)溶解DNA，温和振荡几秒钟，放置- 20C 条件下保存。 4.2 T-DNA插入突变纯合检测（PCR鉴定） 编号成分加入体积 1无菌水16L 210 PCR反应缓冲液2.5L 3Mg2+2L 4dNTP0.5L 5引物F0.5L 6引物R0.5L 7中间引物0.5L 8植物基因组DNA样品2L 9Taq DNA 聚合酶 0.5L 反应条件：94（3min）；30循环（94/1min，5/1min ，72/1min）；72延伸10min。 电泳检测 PCR反应过程中，准备0.8%的琼脂糖凝胶板。 将完成PCR反应的管取出，取5 l PCR扩增反 应物与上样缓冲液混合，点样，恒压100V电 泳约30至45min。