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1、West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,1,第三篇 基因信息的传递,DNA的生物合成(复制) RNA的生物合成(转录) 蛋白质的生物合成(翻译) 基因表达的调空 基因重组与基因工程,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,2,概 述,基因(gene) 基因是为生物活性物质编码的DNA功能片段，这些产物是蛋白质或是各种RNA
2、。,中心法则,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,3,DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication 四川大学华西基础医学与法医学院 高秀峰,第十章,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,4,掌握的内容 第一节 DNA复制的基本规律:半保留复制的概念；复制的半不连续性 第二节 D
3、NA复制的酶学和拓扑学变化 1. DNA聚合酶：真核生物和原核生物的DNA聚合酶 2. 复制保真性的酶学依据：核酸外切酶活性、校读、碱基选择 3. 复制的解链和DNA分子的拓扑学变化：解螺旋酶、引物酶和单链 DNA结合蛋白；拓扑异构酶；DNA连接酶 第三节 DNA生物合成的过程 1. 原核生物的DNA合成：复制的起始：解链，引物和引发体，复制的延长，复制的终止。 2. 端粒和端粒酶的结构和作用机制 第四节 逆转录的概念、逆转录酶,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Fen
4、g Gao,5,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,6,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一节,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,7,* 复制的基本规律 半保留复制(semi
5、-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 复制具有高保真性 (high fidelity),West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,8,一、半保留复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)，按碱基互补配对规律合成子链。子代细胞的DNA，一条链从亲代完整地接受过来，另一
6、条链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,* 概念,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,10,密度梯度实验,半保留复制的实验依据,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,密度梯度离心结果,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng
7、Gao,11,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列完全一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,12,生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,West China School of Preclinical and Forensic Med
8、icine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,13,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),ori,A,B,原核生物是单复制子复制，称为复制体。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,14,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu
9、 Feng Gao,15,真核生物每个染色体有多个起始点，把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子 (replicon) 。 复制子是独立完成复制的功能单位。 真核生物是多复制子的复制。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,16,三、复制的半不连续性,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichu
10、an University, Xiu Feng Gao,17,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,18,DNA复制的反应体系,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP（dNTP） 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(pr
11、imer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其它的酶和蛋白质因子：拓扑异构酶，解旋酶，引物酶，连接酶和单链DNA结合蛋白和其它复制蛋白。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,19,一、复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,20,聚
12、合反应的特点,DNA新链生成需引物和模板； 新链的延长沿53方向进行； 底物是脱氧三磷酸核苷，结合上的是脱氧一磷酸核苷； DNA聚合酶根据模板选择碱基; 碱基配对形成氢键;AT C G 核苷酸之间生成3-5磷酸二酯键.,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,21,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性(exonu
13、lease),3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,切除突变的 DNA片段，引物,能辨认错配的碱基，并将其水解，具有即时校读的功能。,核酸外切酶活性,目 录,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,23,E. Coli中的DNA聚合酶,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,24,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中
14、出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,25,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,F,G,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichu
15、an University, Xiu Feng Gao,26,核心酶功能: 35外切酶活性和53聚合酶活性, 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol(250kD) 不对称二聚体,组成: :核心酶 :固定模板 -复合物:协助全酶组装,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,27,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,West China School of Prec
16、linical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,28,（二）真核生物的DNA聚合酶,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链的主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,低保,真度,的复,制,起始引,发，引,物酶活,性,功 能,+,+,+,-,-,高,高,高,？,中,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA-pol,-,5 聚合酶活性, 5外切酶活性,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sic
17、huan University, Xiu Feng Gao,29,1.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 2.严格的遵守碱基配对规律； 3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,三、复制保真性的酶学依据,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,30,四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双链内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,E. Coli 基因图,West China School of Preclinical
18、and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,31,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,32,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,33,解链过程中正超螺旋的形成,West China Sc
19、hool of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,34,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口。反应不需ATP。,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,分类和作用机制,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶,拓扑异构酶,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University,
20、Xiu Feng Gao,35,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,37,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,特点： 连接碱基互补基础上的DNA双链
21、中的单链缺口。DNA双链都有单链缺口,只要缺口前后的碱基互补也可连接.,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,38,DNA复制的反应体系,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP（dNTP） 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其它的酶和蛋白质因子：解旋酶，
22、引物酶，拓扑异构酶，连接酶和单链DNA结合蛋白和其它复制蛋白。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,39,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,40,（一）复制的起始,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-
23、OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,形成引发体,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,41,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,42,3,5,Dna A,Dna B、 Dna C,引物酶,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发
24、体。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,43,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,44,复制起始的步骤,DnaA 辨认并结合到起始点,DnaC DnaB结合并解链,SSB与单链结合,引物酶进入,引发体形成,合成RNA引物,DnaA,West
25、China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,45,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,46,OH 3,3,领头链的合成,目 录,随从链的合成,目 录,目 录,复制过程简图,目 录,West
26、China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,51,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止：切除引物、填补空缺和 连接切口,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,52,随从链上不连续性片段的连接,West China School of Preclinical and Forens
27、ic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,53,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,54,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,二、真核生物的DNA生物合成,W
28、est China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,55,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,West China School of Prec
29、linical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,56,DNA-pol和pol分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol催化合成。然后由PCNA协同，pol置换pol ，继续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, X
30、iu Feng Gao,57,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长：,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,58,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段和复制子之间可以连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）端粒和端粒酶,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,West China School of Preclini
31、cal and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,60,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,功能, 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,结构特点, 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,61,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telo
32、merase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,62,端粒酶催化作用的爬行模型,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,West China School of Precli
33、nical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,65,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,66,RNA病毒分类,1.正链RNA病毒: 如脊髓灰质炎病毒和Q噬菌体 它们先合成()RNA，再以之作为合成子代(+)RNA的模板。 2.负链RNA病毒:
34、如狂犬病病毒和疱疹性口炎病毒； 其病毒(一)RNA是(+)mRNA合成的模板。 3.双连RNA病毒:如呼肠孤病毒 其病毒()RNA指导(+)mRNA的不对称合成。 4.逆转录病毒: 如Rous肉瘤病毒和艾滋病毒 通过DNA表达病毒(+)RNA的遗传信息。 这个DNA中间物是(+)RNA合成的模板。 逆转录病毒的信息流是从RNA到DNA，再返回RNA。,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,67,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录
35、(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,68,单链RNA病毒,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,69,人类免疫缺陷病毒(HIV) （human Immunodeficiency virus ）,单链RNA病毒,West China School
36、 of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,70,逆转录过程,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA 法。,cDNA,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,71,滚环复制(rolling circle replication),二、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,5,3,3,5,滚环复制,5,目 录,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Xiu Feng Gao,73,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,