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1、叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和定量测定,制作人：刘洪庆 单 位： 植物生理学教研室,一、实验目的,掌握叶绿素的理化性质及其定量测定方法，加深学生对光合色素的理性、感性认识。 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法,二、实验原理,1. 叶绿体色素提取、分离及理化性质 提取：叶绿体色素不易溶于水而溶于有机溶剂特性 -丙酮等有机溶剂提取。 色素分离：纸层析法分离。 荧光现象：观察荧光。 取代反应： 叶绿素中镁可被H+取代而形成褐色去镁叶绿素。 去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。 皂化反应： 叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水-分开叶绿素与类胡萝卜素。,2.
2、 定量测定,根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） Cb=22.88D645 - 4.67D663 （2） 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（3） 或： CT=(D6521000)/34.5 (4),三、实验材料,新鲜的菠菜,四、 实验步骤,1. 提取叶绿素,研磨法提取光合色素,材料剪碎,研磨法,加入有机溶剂,研磨、匀浆,过滤,提取液,（2）纸层析分离现象观察 （3）叶绿素荧光现象观察 （4）H+
3、和Cu2+对叶绿素 中Mg2+的取代作用 （5）皂化反应现象观察,绿黄色素分层现象,去镁叶绿素,铜代叶绿素,荧光现象,五、定量测定,（1）定量用叶绿素提取液制备 （2）分光光度计测定 （3）实验数据及其处理,分光光度计测定,六、实验结果观察及计算,（1）实验结果观察描述 （2）计算组织中叶绿体色素含量 （用mg/g鲜重或干重表示） 公式,叶绿体色素含量=,七、思考题,（1）叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？ （2）用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？ （3）研磨提取叶绿素时加入CaCO3. 石英砂各有什么作用？,