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1、E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒对乳腺癌干细胞的作用 作者： 马越, 徐迎春 导师：张凤春 教授 上海交通大学附属仁济医院肿瘤科,肿瘤干细胞,肿瘤组织及肿瘤细胞系中有一部分的肿瘤细胞充当干细胞的角色，在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用。 特点：自我更新，高致瘤性，多向分化 肿瘤干细胞来源于组织正常干细胞的突变或进一步分化的短暂增生的祖细胞的突变,Tumor cell,肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的重要细胞，目前的治 疗方法可以杀死分化的肿瘤细胞，但对于肿瘤干细 胞却无效，造成肿瘤的复发和转移。,the drug-resistant cells,溶瘤腺病毒,溶瘤治疗原理:通过对自然界存在的一些致病
2、力较弱的病毒进行基因改造制成特殊的溶瘤病毒利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。,Ramon Alemany。Cancer selective adenovirusesJ.Molecular Aspects of Medicine, 2007,28(1):42-58.,由于目前没有有效的针对肿瘤干细胞的靶向治疗，所以我们利用溶瘤腺病毒能选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞的特性，研究其对乳腺癌干细胞的作用，找寻根除乳腺癌干细胞的方法。,MCF-7 细胞,病毒转染,CD44，CD24流式细胞分析 微球体培养,技术路线图：,对
3、照组,CD44，CD24流式细胞分析,微球体形态、大小、MFE的测定,Wnt Hotch HH CXCR4等通路,正在进行中,CD44+CD24-细胞,CD44+CD24-细胞,方法,病毒构建 病毒感染 微球体培养 CD44+CD24-细胞表型流式(FCM)分析,Ramon Alemany。Cancer selective adenovirusesJ.Molecular Aspects of Medicine, 2007,28(1):42-58.,微球体培养,在无血清的含bFGF、EGF的培养液下培养，形成细胞微球体。这种微球体富含CD44CD24-/low细胞，不表达分化腔上皮、肌上皮等分化
4、标志物，在分化条件下培养具有多系分化的能力，致瘤性也明显提高，通过微球体培养成功的分离出了乳腺癌干细胞，并成为乳腺癌干细胞体外培养的一种方法乳腺癌干细胞的富集方法。 Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell propertiesJ. Cancer Res,2005, 65(13):5506-5511. Phillips TM, McBride WH, Pajonk F. T
5、he response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiationJ. J Natl Cancer Inst, 2006, 98(24):1777-1785.,微球体培养方法,储存液：2 终浓度 EGF（表皮生长因子） 40ng/ml b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子) 20ng/ml B27 0.8 胰岛素 10ug/ml 工作液既1，用时对半稀释，但不要加血清维持PH值：7.27.4。,结果,病毒对乳腺癌细胞效应,病毒感染MCF-7细胞第5天，显微镜下观察 见大约30%细胞折光率好，细胞保持原有形 态
6、；而70%细胞萎缩，无折光率，呈悬浮状 态,表示死亡。 对照组细胞培养第5天，细胞生长良好。 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒具有较强的杀 伤MCF-7细胞作用,病毒对乳腺癌干细胞溶瘤效应,MCF-7细胞加入病毒5天后CD24+细胞的比例：56.10%,MCF-7细胞培养5天后CD24+细胞的比例：93.26%,MCF-7细胞加入病毒5天后CD44+细胞的比例：63.26%,MCF-7细胞培养5天后CD44+细胞的比例：88.30%,用E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞后，与正常MCF-7细胞相比，CD44+CD24-细胞比例增大。,MCF-7细胞加入病毒5天后CD44+CD24-细胞的比
7、例：22.19%,MCF-7细胞培养5天后CD44+CD24-细胞的比例：2.30%,病毒对乳腺癌干细胞微球体影响 定义60um的球体为微球体 第4天时，才有微球体形成,感染病毒的MCF-7细胞微球体培养 40 210195um,MCF-7细胞微球体培养 40 155150um,d2 d4 d5 d7 d10,mammosphere-forming efficiency,MFE,MCF-7细胞微球体培养13天后球体计数及MFE 微球体数=1800 MFE= 0.9%,加入病毒五天后的MCF-7细胞微球体培养13天后球体计数及MFE 微球体数=2520 MFE= 1.26%,E1B蛋白缺陷型溶瘤
8、腺病毒感染MCF-7后进行微球体培养，成球时间早于对照组，且球体体积比对照组大。MFE大于对照组。 对微球体中CD44+CD24-细胞的影响？,微球体培养后，两组细胞CD24+的比例 红色：加入病毒组的CD24+比例：37.28% 蓝色：对照组（MCF-7细胞）CD24+比例：72.1%,E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞微球体CD44+CD24-干细胞表型的细胞的比例高于对照细胞.,MCF-7细胞微球体培养13天后 CD44+CD24-细胞比例：23.35%,加入病毒五天后的MCF-7细胞微球体培养13天后CD44+CD24-细胞比例 38.08%,结论,E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒
9、具有较强的杀伤MCF-7细胞作用。 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞第5天有30%细胞存活，并且CD44+CD24- 干细胞表型的细胞比例是对照细胞的9.65倍，微球体形成数量和MFE值亦明显高于对照细胞，表明 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒杀伤MCF-7细胞作用主要是杀伤乳腺癌分化细胞，而对乳腺癌干细胞没杀伤作用。,E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞微球体CD44+CD24-干细胞表型的细胞的比例高于对照细胞1.6倍,成球时间早于对照细胞，且微球体体积比对照细胞大，提示E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒可能对乳腺癌干细胞有促进作用，加快其自我更新和分化速率。,展望,我们将进一步深入研究E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒在乳腺癌干细胞的信号转导通路（Wnt Hotch HH CXCR4）上的作用，并进行体内成瘤试验。 以本研究为基础，构建新型肿瘤干细胞特异靶向的溶瘤病毒。 本研究为以肿瘤干细胞为靶点的有效的溶瘤病毒、基因药物或化学药物筛选提供了重要方法。,致谢,导师张凤春教授 （上海仁济医院肿瘤科主任） 徐迎春博士（上海仁济医院肿瘤科医生） 张雁云教授（中国科学院上海生命科学院健康科学中心免疫学联合实验室） 黄明主，林叔成师兄； 肿瘤科的全体医护人员，研究生,谢谢,