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1、第二章 制备色谱基础,Preparative Chromatography Lujiang Yuan,制备色谱,任何一种分离方式均可用于制备目的，色谱和电泳也不例外（注意实际效果！）。 制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。 制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。制备色谱的出现，使色谱技术与经济利益建立了联系。制备量大小和成本高低是制备色谱的两个重要指标。 气相制备色谱主要用于石油化工产品和挥发性天然产物的色谱纯样品制备。,仪器分析所需纯样品量,思考：这三个指标是相互制约达的，不同分离目的有不同要求。请具体分析： 1）分离分
2、析 2）制备分离,评价制备色谱效率的主要指标是单位时间内分离纯物质的量，以纯组分量和该组分保留时间之比表示，定义为产率。另一指标是最大允许分离样品体积，它决定于固定相的负荷和色谱柱尺寸。,制备色谱和分析色谱的比较,液相色谱制备纯物质的目的：结构鉴定，生物和毒理试验，以及某些珍贵或难分离单组分物质的生产。,Introduction,一、线性色谱 组分在固定相和流动相中的平衡浓度呈正比例关系，也即吸附分配等温线为一条直线。 分析色谱进样量小，样品在固定相流动相中的分配关系大多为直线，因此分析色谱大多为线性色谱，其色谱峰符合高斯分布。,二、非线性色谱,图 三种吸附等温线和对应的色谱峰形状,流动相,C
3、S,Cm,Cm,Cm,CS,CS,1、色谱峰不对称,2、保留时间随样品量大小而变,3、色谱峰高度与样品量不成正比例关系,此时，如果用峰高来定量是不准确的,制备色谱,二、制备分离的目标和策略,1、目标 A 样品的性质:组成，基体，理化性质，相态，浓度，价值； B 产品的纯度：要求达到的纯度，浓度很低的天然产物达70，核磁和红外95，化学分析标品95；生物制品可用活力来表示； C 制备量： D 时间 E 成本：制备分离成本很高，有时占整个成本的80,2、分离策略,A 分离因子：两组分质量分配比之比； B 柱效：N=L/H, Van Deemter 方程； C 容量因子：调整保留时间与死时间之比；
4、D 条件优化：用液相或薄层色谱在分析型规模下优化，然后放大到制备规模；,分离因子,分离因子是两种物资质量分配比之比，一般由两物资调整保留时间之比而求得，也可由两物质容量因子之比来计算。 分离因子越大，两组分峰的距离越远。当样品固定时，分离因子取决于固定相和流动相的性质。 因此，选择固定相流动相是获得大的分离因子的关键。 How?,固定相的选择,首先考虑样品的性质 疏水样品选择反相固定相 亲水样品选择正相固定相 大分子选择离子交换色谱固定相 碳水化合物选择疏水色谱固定相 无几离子选离子色谱固定相 合成聚合物选凝胶色谱固定相 立体异构样品选环糊精固定相 外消旋样品选手性固定相,更多的数据可以从色谱
5、分析手册上查到,固定相选择的原则,相似性原则 极性化合物：极性固定液，极性小的先出峰； 非极性化合物：非极性固定液，沸点低的先出峰； 非极性混合物：极性固定液，非极性先出峰； 能成氢键的样品（醇、酚、胺）：极性固定液或氢键固定液如PEG20M;,确定了固定相的类别后，还有必要对固定相的具体种类进行筛选，如常规的反相色谱固定相就多达10多种。,具体的结果只有通过实验来确证。 甚至还可以考虑使用混合固定相。 流动相的选择 选择流动相必须根据确定的固定相来决定 反相固定相：极性有机溶剂水 正相 ： 非极性溶剂极性溶剂,流动相的性质要求,流动相应不改变填料的任何性质：碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性
6、流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。离子交换树脂排阻色谱遇到某些有机溶剂会膨胀或收缩，从而改变柱床的性质。 纯度。 必须与检测器匹配。 粘度要低（应2cp）。沸点100以下最好。 对样品的溶解度要适宜。 样品易于回收。应选用挥发性溶剂。,流动相的pH值,采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7）或弱碱（7pKa8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。 对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在； 对弱碱，情况相反。 分析弱酸样品时，通常在流动相中加入
7、少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。,洗脱能力,在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈
8、、四氢呋喃等 。 乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的67倍。,在通常情况下，首先要考虑的是溶剂的极性。但是对于缺乏经验的新手不防用下面的方法来的快：,1由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试 验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 2 三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 3 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规
9、则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。,如果做液相色谱分析还要注意!,水：超纯水电阻率（Mcm），25，最小 10.0 -18.0 硅酸盐（mg/L），最大 0.05 -0.003 微粒（microm）滤器 0.22 -0.2 流动相脱气过滤o.2uM或0.45uM 流动相要现配现用。 样品要过滤: 样品用流动相溶解：,柱效,样品对柱效的影响 为了最大效率地得到目标产物，制备色谱总是在过载的情况下操作，严重的过载会使N很快下降，一学者建议控制在组分峰的容量因子下降10左右。 样品的理化性质，浓度大小，分配比，扩散系数及容量因子等都有影响。,H=L/N,固定相对柱效的影响,颗粒大小，分
10、配范围； 形状，孔径大小； 表面积或比表面积； 表面化学性质；,流动相的影响,包括流动相的化学性质； 组成； 黏度： 扩散性质以及线速度；,色谱柱的影响,柱结构是否合理； 填充是否合理：有否很大的死体积，填充是否均匀，紧密度是否适中等；,容量因子,（tR-tM)/tM =tR/tM 如右可见，当容量因子达到一定值后，对分离 度的影响并不是很大。因此，在制备分离过程 中我们不是无限制地增加K值，因为K值的增加 是以时间和大量的溶剂为代价的。除非收集的 物质是很昂贵的物质。 k:1-5 比较合适； 2 分离容易； 21.5 能进行制备分离 1.51.3 分离困难 1.3 制备分离非常困难,条件优化
11、一般步骤,选择最佳薄层色谱或HPLC分离条件,在分析的条件下进行制备分离,放大到制备规模进行制备分离,收集,分析纯度,如不和要求,重新在分析设备上改进分离条件,合并相同组分,如果需要可进一步提纯产品,目标物质,制备色谱过程,制备色谱过程,第三章 制备薄层色谱,1938年，NA.lzmailov and MS.Schraiber在显微镜的玻片上涂上氧化铝分离酊剂，但没有多大进展； 1949年，JE.Meinhard and NF. Hall 用淀粉为黏合剂制成了氧化铝及硅藻土板，分离无机离子； 1956年，E.Stahl 对吸附硅胶的规格，性能，厚度进行了系统研究，于1965年出版了薄层色谱手册
12、；,Definition of TLC,A technique that uses a sorbent applied to a planar support, called a plate, for separation. The sample is applied to the sorbent that is contained in a sealed container called a developing tank. The solvent moves up the support through capillary action and causes the analytes to
13、 migrate up the sorbent based in the differential affinity between the solvent and the sorbent. Standard TLC uses a sorbent that is prepared from 10- to 60-um particles that is applied to the plate in a thickness of 250um. The standard plate dimensions are in the 10cm 10cm to 20cm 20 cm range.,Inter
14、pretation,Calculating the Rf value,Calculating the Rf value,Calculate Rf Value,Rf Value,The Rf value needs to be between 0.0 and 1.0 If the value is over 1.0 or less than 0.0, the calculation is wrong If the Rf value is greater than 0.8 or lower than 0.2 the values are hard to interpret, thus creati
15、ng a larger error The best Rf values are 0.3 to 0.6,Rf Value,What affects the Rf value? Temperature Solvent Thickness and amount of spot Other compounds,第一节 实验材料与装置,一、薄层板,10x20cm, 50片/包,F254 10x10cm 25片/包,F254 10x20cm 50片/包,薄层层析的支持剂,薄层层析的支持剂较常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺及DEAE纤维素。 无机类支持剂的颗粒以150200目(直径为00701
16、mm)、薄层厚度为0251mm较合适。有机吸附剂如纤维素等的颗粒为70140目(直径0102mm)、薄层厚度为12mm最恰当。,自制薄层板,玻板：5x20， 10x20， 20x20， 20x40， 20x100cm 硅胶：表面积300500m2/g, 孔径100nm,粒度10-40um,高效薄层用510um. 商品硅胶字母的意义： H 表示不含黏合剂； F 表示含荧光物质； G 表示含锻石膏黏合剂； F254表示在紫外254nm照射下发荧光； F365表示用365nm激发； P 表示制备用硅胶；,板的大小,板宽可增加制备量； 长度不宜太长，太长展开慢，且由于扩散的原因，太长对分离没有多大改进
17、，长度一般20厘米； 制备板的方法有干法湿法两种，但湿法用的更广泛些。,干法制板,干法制备薄板可达7mm，不需要黏合剂.制备方法也简单： 在长方形的金属或玻璃浅盘中松散地装上吸附剂就可以了，可以用玻棒或相应的工具把表面刮平。,湿法制板,湿法制板可分为平铺法涂铺法。 平铺法：待铺玻璃板两边用玻璃做边框，将调配好的吸附剂倒在玻璃板上，然后用玻璃棒刮平，去掉边框即可。 涂铺法：一般用涂铺器涂铺的方法。 常用的黏合剂：1015的锻石膏，0.2-10%的羧甲基纤维素钠，5聚丙烯酸或5的淀粉。,铺板器,TDII型全自动薄层铺板机,薄层板干燥架,薄层色谱玻璃板,CAMAG 手动铺板器,自动铺板器,TLC薄层
18、板存储盒,板的厚度,分析薄板：0.25mm; 制备薄板：0.5-3mm; 由此可计算制备1mm厚，20x20mm的板需要2025g 硅胶。 也有人用高比例的黏合剂制备510mm 厚的板，但分离能力差，一般用于初步分离；,常见的三种薄层斑点图,薄层色谱理论踏板数：N=16（d / w) D为原定到斑点中心距离，w 斑点宽度。,二、展开槽,第二节 实验方法,制备好的薄板在自然条件下干燥1224h,然后在120度活化30min-4h,活化好的板应保存在干燥器中。 活化温度超过130度，有可能使石膏脱水。,上样前对薄板预展开,目的：除去吸附剂中的杂质。 方法：用氯仿甲醇（ 1：1）或者乙醚（含1氨水或
19、1乙酸，根据后面的展开剂含酸或碱来选择）在展开槽中展开，然后取出真空干燥备用。,样品配制,样品尽可能溶解在挥发性大的溶剂中，溶剂的极性要尽量小； 样品的浓度控制在上样厚能均匀铺开，而不在吸附剂表面结晶，制备薄层色谱上样浓度一般为210；,铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：23，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。,一、上样,上样量：薄板的容量与薄板的厚度的平方根成正比，如2.5mm厚的板的上样量是 1mm 厚的两倍。 实验表明： 20x20cm分析板 5mg 1mm厚20x20cm制备板 5-25mg
20、 判断是否过载：看斑点有无拖尾或伸舌或变形。 实验前，反复实验某类薄板对具体样品的容量。,上样位置距离薄板一端约2.5cm，3-5mm条形，条的长度以两边距离板的边缘1-3mm,上样时可以重复上，但需溶剂挥发干再上。,用强极性溶剂（如甲醇）展开1-2cm可压缩条带，然后取出挥发干； 上样不能破坏薄板表面； 可在上样的地方挖一V型槽，槽的上端1-2mm 宽，深度为吸附剂的一半； 上样处的吸附剂挖去，用拌有样品的吸附剂填平；,点样仪,二、展开,找合适溶剂的方法 微量源盘技术寻找合适的溶剂： 将试样点于薄层板上干燥使其成一圆点，在圆点上滴溶剂，如果被试物留在圆点不动，需增加溶剂的极性或增大洗脱量；如
21、被试物随溶剂跑德太快甚至达到前沿，则需用更低极性的溶剂。 微型薄板：实验室常用显微镜的载玻片来制薄板，手工涂铺，一次分离只有几分钟。,Stahl E. Thin Layer Chromatography.2nd Ed,Springer Verlag/Academic press.1969,被分离物质为非极性：用非极性展开剂，吸附剂的活性要高。 被分离物质为强极性：用强极性展开剂，选择强极性吸附剂，此时吸附剂的活性较低。 被分离物质为中等极性：选中等极性展开剂，用中等活性的吸附剂。 选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析 物的溶解性，以及被分析物的结构。,展开剂,展开剂,吸附剂,
22、被分离组分,非极性,极性,非极性,极性,I 级,V 级,展开剂、吸附剂和被分离组分关系示意图,混合溶剂展开,展开方法,上行法：最常用的方法 多次展开：由极性小到极性大的顺序（每次要挥干后才换第二种展开剂）； 收集后，再次点样，展开。 注意：A 展开溶剂要求分析纯； B 展开槽中溶剂不够，可以添加， 但不能搅动展开槽里的溶剂（小心）；,三、检测,有色化合物的检测： 具有荧光的化合物的检测：254nm,365nm 薄板有荧光：254nm,365nm下样品为黑斑或带； 其它化合物则需要显色： 显色剂 碘蒸汽，物理吸附，不破坏样品. 水，样品为不透明的暗斑或带 如果上面两种显色剂不起作用的话，只能按照
23、分析薄层的显色方法了，方法见后；,扫描仪,四、收集,用刀片将需要的斑点或条带刮下，装入玻砂漏斗种，然后用溶剂适当溶剂将收集组分从吸附剂上洗脱下来。 操作要小心，不要将非收集组分混入。 洗脱的溶剂一般为丙酮、乙醇、氯仿一些好的展开剂系统；一般不用水甲醇，水的沸点高，而甲醇洗脱能力太强。 洗脱体积（1Rf) x 10 x 刮下的吸附剂体积,产品鉴定,减压蒸馏得产品 鉴定是否是你的目标产品（定性），纯度是否符合要求？如否，可执行下面步骤： 重结晶技术 再次用薄层色谱纯化,第三节、离心薄层色谱,对于复杂混合体系如天然产物或有机合成反应产物，可使用制备高压液相色谱进行分离，但费用很高。而使用制备薄层色谱
24、中，不足之处是需将被分开的化合物从薄板刮下，而且分离时间较长。为克服这些缺点，人们发明了离心薄层色谱，使用离心力强迫流动相流动，起到加压色谱的效果，有突出的优点。,离心薄层色谱原理,样品,吸附剂,旋转方向,主要特点,（1）分离速度快，一般少于30分钟，敏感物质的氧化少 （2）操作简单，占用空间小，性能稳定 （3）使用溶剂少，经济环保 （4）色谱板可以反复得用，不需刮离吸附剂 （5）可进行梯度洗脱，条件更优化 （6）进样量大，一次分离量100mg到2g,KH-CTLC型制备离心薄层色谱仪,主机、专用紫外灯、制板器、离心薄层板,主机转速为4001400转/分,速度可调,紫外灯波长为254nm或36
25、5nm,薄板吸附剂厚度有1、2、4、6、8mm,薄层层析法的近代发展,高效薄层层析法(high performance thinlayer chromatography，HPTLC)，也称现代薄层层析法(modern TLC)。 亲水性固定相，多数用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇和不同相对分子质量的聚乙二醇或不同种类的盐溶液浸渍 亲脂性固定相，一般作反向层析用，多数用液体石蜡、十一烷、十四烷、矿物油、硅酮油或乙基油酸盐等浸渍。也有利用与浸渍剂形成络合物或加成物得以分离的，如经三硝基苯或苦味酸浸渍的，可利用络合反应分离多环化合物。用NaHSO2浸渍，可与含有羰基化合物生成加成物而得以分离。,思考题,1. 如何利用Rf值来鉴定化合物? 2. 在混合物薄层色谱中,如何判定各组分在薄层上的位置?能不能定量？ 3. 展开剂的高度若超过了点样线,对薄层色谱有何影响? 4. 薄层色谱属于吸附色谱还是分配色谱?举例说明。 5.制备薄层色谱和分析薄层色谱的区别？,