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1、第五章 黄连不同炮制品中主要生物碱体内分布研究黄连为毛茛科多年生草本植物黄连CoptischinensisFranch的根茎1,其活性成分为黄连生物碱。石柱黄连(味连)含小檗碱50%左右,而小檗碱、药根碱、巴马汀和黄连碱等4个生物碱之和占总生物碱的90%左右2。有关小檗碱的药代动力学研究较多3-4,其他黄连生物碱的药代动力学研究相对较少5。中药成分在动物体内的代谢与作用网络具有/网通虹势规律6-7:中药材成分群往往是同一母核的多种衍生物,药理作用相似;同一母核的有效成分衍生物群在动物内可以相互抑制、加速及转化,其代谢网络相容相通;动物内存在巨大的与自然界类似的以CYP450酶为主导的代谢酶网络
2、系统,按CYP450进化树的关系对中药及复方成分组群进行代谢和产生药效。黄连生物碱的结构类似,均是异喹啉类生物碱的衍生物。这些生物碱之间在动物体内是否存在相互之间的转化。黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）、三角叶黄连（Coptis deltoidea C.Y.Chenget Hsiao）、或云连（Coptis teeta Wall.）的干燥根茎。具有清热燥湿、泻火解毒功效，始载于神农本草经，列为上品1（1魏吴晋等述.神农本草经.清孙星衍，孙冯翼辑.北京：人民卫生出版社，1982.26）。也称味连、鸡爪连、川连，目前主要产地为湖北省利川市、重庆市石柱县。其性
3、味苦，寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。根茎含多种异喹啉类生物碱，其主要活性成分为小檗碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱、巴马汀、非洲防己碱、Groenlandicine等生物碱。有文献报道，总生物碱的含量高达10%以上，盐酸小檗碱、药根碱、表小檗碱、巴马汀、黄连碱五种生物碱占据黄连总生物碱含量的98%以上。其中以小檗碱含量最高为50%以上2（ 2 钟国跃,黄小平,马开森,等.我国黄连(味连)质量评价研究J.中国中药杂志,2005,30(7): 5941）现代药理研究表明，黄连具有抗菌、消炎、止痛、解毒、退热、驱风、健胃、利胆、降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤、扩张血管，以及治疗腹泻、痢疾等功效，临床
4、主要用于肠胃湿热和痛肿疗毒等症的治疗。目前有关小檗碱的药代动力学及体内分布研究较多3-4（ 3 吴晓霞,彭娟,范斌,等1.LC-MS-MS测定黄连解毒汤中3种生物碱在大鼠血清的含量及其药代动力学研究J.中国中药杂志,2009, 34(10): 12761. 4 赵玉男,邢东明.解热药YL2000中小檗碱在正常和发热大鼠体内的药物动力学比较J.中国药理学通报. 2003,19(10): 1170），其他黄连生物碱的药代动力学及体内分布研究相对较少5 (李亚梅,叶小利,李雪梅,等.助剂对小鼠吸收黄连总生物碱的影响及药代动力学的研究J.中国中药杂志, 2009,34(3):3441)。本研究以黄酒为
5、辅料，经炒制、蒸制炮制方法处理后，黄连不同炮制品所含主要生物碱在体内不同组织脏器的分布情况，力图从体内分布角度揭示“三焦”理论。1 材料1.1 动物 SD小鼠,体重(18-20 g),雌雄各半,由南京中医药大学动物中心提供,合格证号SCXK(渝)2007-0001。1.2 仪器与试剂 （1）仪器： 液质联用系统： SHIMADZU UFLC XR超快速液相色谱仪 （日本岛津公司， 包括LC-20AD型输液单元，STL-20A XR 型自动进样器，CTO-20AC 型柱温箱）；AB SCIEX QTRAP 5500 型质谱仪（美国 AB SCIEX 公司），Analyst 1.5 软件；KQ52
6、00DA型数控超声波清洗器； TG16-W微量高速离心机,组织匀浆器。（2）试剂：盐酸药根碱（纯度98%，批号960383-96-4;表小檗碱（纯度98%，批号MUST-11022503）；黄连碱（纯度98%，批号3486-66-6）；盐酸巴马汀（纯度98%，批号10605-02-4）；盐酸小檗碱（纯度98%，批号633-65-8）；四氢巴马汀（ ）等均购自成都曼思特生物科技有限公司,含量98%以上；其他试剂均为分析纯或色谱纯。1.3 药材及炮制方法 黄连采挖自湖北省恩施州利川市佛宝山官康彬农户五年生黄连，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为毛茛科植物黄连（CoptischinensisFranc
7、h.），习称“味连”、“鸡爪连”。黄连生品：黄连药材经产地加工，火燎去须根和泥沙，干燥，撞去残留须根，强水抢洗，切片，干燥后即得。（南京海源中药饮片公司，批号 ）黄连酒炒品：取上述生黄连生饮片适量，加黄酒拌匀，闷透，置铁锅内，用文火慢慢炒制，炒至色泽加深，略带酒香气时取出，干燥后即得。黄连每1kg,用黄酒 kg。 （南京海源中药饮片公司，生产批号： ）黄连酒蒸品：取上述生黄连饮片，加黄酒拌匀，闷透，置蒸制容器内，用黄酒蒸汽加热，至色泽变深，带有酒香气时取出，干燥后即得。黄连每1kg,用黄酒 kg。（南京海源中药饮片公司，生产批号： ）1.4样品液制备黄连生品供试液的制备：取生黄连饮片适量，煎煮
8、提取二次，第一次加水10倍煎煮提取1h，过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至0.9g生药/ml，4储存备用。黄连酒炒品供试液的制备：取酒炒黄连饮片适量，煎煮提取二次，第一次加水10倍煎煮提取1h，过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至0.9g生药/ml，4储存备用。黄连酒蒸品供试液的制备：取酒蒸黄连饮片适量，煎煮提取二次，第一次加水10倍煎煮提取1h，过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩至0.9g生药/ml，4储存备用。2 方法2.1色谱条件色谱条件ACQUITY UPLC T3 C18色谱柱( 2. 1mm 100 mm，
9、1. 8 m，Waters 公司) ; 柱温40 ; 流动相0. 2% 甲酸水( A) -0. 2% 甲酸乙腈( B) ，等度洗脱2min，流速0. 4 mLmin 1 ; 进样量2 L。质谱条件：采用 AB 5500 UFLC QTRAP MS，ESI源, 检测方式为选择离子监测模式（MRM），正离子检测方式，喷雾电压5500 eV，离子源温度(TEM) 为550 ，气帘气( CUR N2) 为35 Pa，雾化气 ( GS1 N2)为50 Pa，辅助气 ( GS1 N2)为50 Pa，去簇电压( DP)为 70eV; 检测电压1.6KV。2.2溶液配制（1）内标物溶液配制：称取四氢巴马汀对照
10、品适量，用甲醇配制成浓度为200ng/mL。（2）对照品溶液配制： 非洲防己碱对照品溶液配制：称取非洲防己碱约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为202g/mL。黄连碱对照品溶液配制：称取黄连碱约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为182g/mL。盐酸药根碱对照品溶液配制：称取盐酸药根碱约2mg，精密称定，置50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为42g/mL。盐酸巴马汀对照品溶液配制：称取盐酸巴马汀约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为222g/mL。盐酸小檗碱对照品溶液配制：称取盐酸小檗碱约2m
11、g，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为235g/mL。表小檗碱对照品溶液配制：称取盐表小檗碱约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为211g/mL。木兰花碱对照品溶液配制：称取木兰花碱约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为226g/mL。（3）混合对照品溶液配制：从上述对照品溶液中，分别精密移取非洲防己碱对照品溶液800L、黄连碱对照品溶液800L、盐酸药根碱对照品溶液240L、盐酸巴马汀对照品溶液800L、盐酸小檗碱对照品溶液800L、表小檗碱对照品溶液800L、木兰花碱对照品溶液800L置100mL容量瓶中，
12、甲醇定容至刻度。精密移取上述混合对照品溶液3mL，置50mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，使其浓度分别为非洲防己碱96.96ng/mL、黄连碱87.36ng/mL、盐酸药根碱60.48 ng/mL、盐酸巴马汀106.56 ng/mL、盐酸小檗碱112.8 ng/mL、表小檗碱101.28 ng/mL、木兰花碱108.48 ng/mL。2.3组织样品预处理：称取组织样品（心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠）各0.1g，精密称定，置50mL具塞离心塑料试管中，精密移入甲醇与盐酸混合液（100:1）20mL,加入内标溶液5mL，精密称定，进行组织匀浆，超声提取30min，补足重量，以3000r/min转
13、速离心5min，取上清液1 mL，以10000r/min转速离心5min，微孔滤膜过滤。取上清液进行HPLC-MS/MS分析。2.4 动物分组 SD小鼠，平衡喂养3d后，随机分成空白对照组、生品组、酒炒品组、酒蒸品组，每组10只，雌雄各半。2.5方法学考察2.5.1 方法专属性2.5.2 标准曲线和线性范围 精密移取上述混合对照品溶液5L、10L、20L、40L、80L、100L置EP管中，分别加入浓度为200ng/mL内标溶液50L，混匀置70烘箱挥干溶剂，加精密加入100L甲醇复溶，涡旋1min，转移至套管中，进行HPLC-MS/MS分析，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的
14、峰面积比值为纵坐标，进行线性回归，结果如下表 表 各生物碱线性关系化合物回归方程相关系数slopeinterceptr黄连碱212-580.9910小檗碱209-1880.9728表小檗碱902-5910.9778药根碱30.44.960.9941非洲防己碱27642.40.9941木兰花碱4332.80.9864巴马汀466-1520.9903 图 黄连碱工作曲线 图 小檗碱工作曲线 图 表小檗碱工作曲线 图 药根碱工作曲线 图 非洲防己碱工作曲线 图 木兰花碱工作曲线图 巴马汀工作曲线2.5.3提取回收率2.5.4精密度与准确度2.5.5 稳定性2.5.6 反复冻融样品的稳定性3.黄连生品
15、及酒炒品、酒蒸品在小鼠体内的组织分布情况3.1给药途径和方式给药途径：灌胃给药方式：多剂量（连续给药7天）给药剂量：以3.25g生药量/Kg的剂量对小鼠灌胃，连续给药7天。3.2样品采集与处理空白对照组、生品组、酒炒品组、酒蒸品组分别按照体重灌胃样品液。连续灌胃7天，于第八天灌胃后4 h,宰杀小鼠, ,分取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、血液。脏器用生理盐水冲洗表面血迹和内容物，滤纸吸干,称重，-20冷冻保存，待测。3.3 黄连生品、酒炙品及酒蒸品在小鼠体内的组织分布情况：按“3.2”项分别进行黄连生品、酒炙品及酒蒸品的组织采集，按“2.3”项的处理方法和“2.1”项的色谱条件进行分析，结
16、果见表表 黄连生品、酒炒品、酒蒸品中主要生物碱在小鼠体内组织分布（n=10）种类组织小檗碱（g/g）巴马汀（g/g）表小檗碱（g/g）药根碱（g/g）木兰花碱（g/g）非洲防己碱（g/g）黄连碱（g/g）生品心59.914815.11853.77963.64543.32113.34423.1099脑4.3455 2.4103 1.2053 1.2032 0.8828 1.2031 1.2932肝150.351242.571410.642910.508710.184410.20759.9732脾104.207327.27296.81826.6846.35976.38286.1485肺87.372
17、425.00846.25216.11795.79365.81675.5824肾55.232115.86193.96553.83133.5073.53013.2958酒炒品心42.34569.60442.74412.61962.53072.60892.6265脑5.66762.79281.55551.63551.63051.55531.6315肝137.350032.57259.30649.18199.09309.17129.1888脾116.485526.52467.57857.4547.36517.44337.4609肺283.115268.330719.523119.398619.3097
18、19.387919.4055肾167.704030.77188.79198.66748.57858.65678.6743酒蒸品心42.34564.60391.31541.44061.20331.28331.2828脑4.56412.50991.57431.69951.43221. 22541.5417肝123.564126.50997.57437.69957.46227.54227.5417脾96.795716.58504.73864.86384.62654.70654.7060肺222.804846.675113.335713.460913.223613.303613.3031肾126.095717.41864.97675.10194.86464.94464.9441 图 小檗碱在小鼠不同组织的分布 图 药根碱在小鼠体内不同组织的分布图 木兰花碱在小鼠体内不同组织的分布图 巴马汀在小鼠体内不同组织的分布 图 表小檗碱在小鼠体内不同组织的分布图 非洲防己碱在小鼠体内不同组织的分布图 黄连碱在小鼠体内不同组织的分布4.小结4.1 黄连及其炮制品中主要生物碱的分布具有组织部位特异性