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1、项目名称：重要病毒持续性感染形成和维持的分子机制研究首席科学家：袁正宏 复旦大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部 上海市科委 卫生部一、关键科学问题及研究内容本项目以HBV和HIV为主要研究对象，并在部分环节上以疱疹病毒的成熟研究体系为参照，从靶细胞和机体两个水平探索病毒持续性感染形成和维持的机制。靶细胞水平选择的关键环节包括病毒入侵细胞、病毒复制的调控和病毒拮抗细胞凋亡；机体水平选择的关键环节为病毒诱导的免疫耐受和免疫功能损伤。这些环节基本上是所有持续性感染的病毒在形成和维持持续性感染过程中所必须经历的。通过深入研究，在揭示这些病毒形成和维持持续性感染的特性的同时，争取发
2、现它们之间的共性，为HBV和HIV等病毒持续性感染的防治提供特异性和广谱性的干预靶点。主要研究内容:针对上述关键科学问题，拟开展以下研究：（一） HBV和HIV等与靶细胞相互作用形成和维持持续性感染的机制1. HBV和HIV入侵靶细胞的机制：1) 利用感染细胞模型与原代肝细胞培养体系，研究HBV吸附肝细胞过程中病毒表面蛋白与细胞表面分子相互作用及介导病毒入侵的机制；2) 利用病毒内吞和膜融合的细胞模型，研究影响HBV和HIV表面蛋白介导的病毒内吞和膜融合的因素，探寻参与病毒内吞过程的细胞分子并研究它们与病毒表面蛋白的相互作用；3) 利用肠道粘膜活组织模型，探索HIV跨越粘膜屏障及在细胞间传递（
3、感染突触）的机制，研究感染微环境中各种因素（如病毒的存在形式、趋化因子等）对感染过程的影响。2. 持续性感染中病毒复制的调控机制：1) 研究HBV表面蛋白调控cccDNA形成的分子机理，研究临床常见HBV准种的表面蛋白在调控cccDNA形成中的功能差异及与临床疾病进展的关系；2) 研究HIV-1感染靶细胞后，病毒蛋白或基因通过与宿主细胞内元件的相互作用，抑制免疫信号传递的分子机制；3) 研究HBV影响细胞自噬的分子机理及对病毒复制的影响；4) 比较HBV和疱疹病毒在调控自噬作用机制上的异同，发现共同的关键节点分子。3. 持续性感染病毒拮抗细胞凋亡的机制：1) 研究和确定HBV和疱疹病毒抑制细胞
4、凋亡的主要通路（如死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路或细胞周期检验点等）；2) 鉴定抑制细胞凋亡的病毒因子，分析其抑制机制及相互作用的关键宿主蛋白；3) 比较不同病毒在持续性感染状态下拮抗细胞凋亡的共性。（二） HBV和HIV等与免疫系统相互作用形成和维持持续性感染的机制4. 病毒持续性感染诱导免疫耐受的机制及逆转策略1) 研究HBV及其病毒成分抑制天然免疫系统（包括肝细胞、树突状细胞及NK细胞等）的识别能力、细胞活化及其免疫网络调节功能等，阐述HBV诱导天然免疫耐受的分子机制；2) 研究HBV和HIV在微环境中分别在Kuffer细胞和DC细胞的介导下诱导Treg导致获得性免疫耐受的机制。3
5、) 利用基因敲除、RNAi等技术及调控天然免疫的新型制剂等手段达到抑制病毒复制、切断耐受相关通路、调节Treg等目标，并评估上述手段对免疫功能的影响，探索可能的免疫耐受逆转策略。5. 病毒持续性感染诱导免疫功能损伤的机制及修复策略：1）固有免疫细胞功能损伤的分子机制：利用HBV与HIV-1感染者标本，研究APC细胞与NK细胞的表面活化与抑制受体表达、细胞因子分泌、T细胞活化与调节等功能的变化。利用细胞模型与转基因动物模型观察APC免疫功能的损伤及损伤对获得性免疫细胞的影响。2） T细胞功能损伤的分子机制：利用感染患者，系统观察不同病程来源T免疫细胞的功能损伤情况，包括T细胞功能减少或缺陷、抑制
6、T细胞功能的负向调控与激活调控严重失衡等。3). 病毒感染免疫功能损伤的修复策略研究。利用细胞模型与转基因动物等模型再现病毒感染引起的免疫功能损伤，并利用基因敲除或RNAi技术，探索利用基因敲除、RNAi或抗体阻断技术，探讨修复损伤的可能机制与修复策略。同时探索抑制免疫系统过度激活降低免疫损伤的策略，观察降低病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对免疫细胞功能与亚群恢复的可能性。二、预期目标总体目标：本项目根据国家重大传染病防治中基础研究的战略需求和国际研究前沿，聚焦于病毒持续性感染形成和维持的关键环节与共性科学问题，选择HBV、HIV为主要研究对象，部分参照疱疹病毒的成熟研究体系，运用前
7、沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等先进技术，深入研究和揭示病毒形成和维持持续性感染过程中病毒入侵靶细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡及逃避免疫清除等关键环节的分子机制，为研究阻断HBV和HIV等病毒持续性感染的策略，防治相关重大传染病提供科学依据和技术支撑。通过项目的实施，将培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干，形成具有较强国际竞争力的研究团队，推动我国在病毒持续性感染领域的研究达到国际先进水平。五年预期目标：1. 揭示HBV和HIV表面蛋白与细胞分子相互作用所介导的受体特异性与非特异性病毒进入靶细胞的机制。初步阐明HIV跨越粘膜屏障及在首感细胞与终末靶细胞之间传
8、递的机制。2. 揭示HBVcccDNA形成机制及表面蛋白调控病毒复制的机理及HIV-1感染宿主细胞后如何逃避免疫系统监视而导致持续性感染的分子机制。阐明HBV和疱疹病毒调控细胞自噬以利于病毒复制的分子机制，发现共性的关键分子。3. 阐明HBV等病毒持续性感染过程中病毒因子与宿主蛋白相互作用，协同调控宿主细胞凋亡的分子机制，发现关键的共性信号通路和分子。4. 阐明HBV基因组中所含的ODN和病毒蛋白因子诱导固有免疫耐受的机制；揭示HBV和HIV蛋白分别通过枯否氏细胞和DC细胞诱导Treg产生的机制。5. 揭示HBV和HIV持续性感染中固有免疫系统、T细胞免疫功能损伤的机制；力争获得1-2个具有应
9、用潜力的修复策略，为乙型肝炎与艾滋病的免疫干预与治疗性疫苗的研制奠定理论基础。6. 培养1-3名在病毒学研究领域具有较高国际声望的创新型拔尖人才，培养20人以上中青年学术骨干，形成具有较强国际竞争力的病毒持续性感染研究团队，争取建立融合分子病毒学、分子免疫学和病毒控制策略研究的国家级科研基地。7. 发表50-70篇SCI研究论文，其中影响因子10以上的论文2-3篇，影响因子5以上的论文10-15篇，争取在Nature、Science等国际著名综合性学术刊物发表研究成果。8. 申请5项以上中国发明专利。三、研究方案学术思路：本项目根据我国重大传染病防控对基础研究的实际需求和国际研究前沿，围绕病毒
10、持续性感染的形成和维持机制这个传染病和免疫学基础研究中的核心科学问题，以HBV（DNA/RNA病毒）与HIV（RNA病毒）为主要研究对象，在部分环节上利用疱疹病毒（DNA病毒）的成熟体系为参照对象，运用前沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等学科的先进技术，从靶细胞和机体两个层面选择与病毒形成和维持持续性感染密切相关的若干关键环节：病毒入侵细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤，通过不同水平的研究模型系统研究病毒与宿主分子的相互作用，对比不同病毒形成和维持持续性感染的机制，力争发现其共性，从而不仅获得对HBV和HIV形成和维持持续性感染机制的新认识，而且为其
11、它病毒持续性感染的研究提供启示，为干预HBV和HIV等的持续性感染提供特异的和共性的靶点。技术途径：本项目利用细胞组织模型、动物模型及临床标本，应用基因组学、蛋白质组学、分子生物学、分子免疫学、转基因与基因敲除及RNA干扰等技术，系统研究HBV和HIV持续性感染形成和维持的机制，并在此基础上，利用RNA干扰、抗体阻断等技术探索阻断这些病毒持续性感染的策略。项目的技术路线如下图所示。项目技术路线示意图创新性和特色：本项目以HBV、HIV等持续性感染的形成和维持机制为研究内容，开展系统研究，具有很强的创新性，主要体现在以下几方面。虽然不同病毒的持续性感染过程各有特点，但它们都必须与同一个人体系统的
12、细胞和分子相互作用，因此，不同病毒的持续性感染过程中不可避免地存在一些共同或相似的性质，发现这些共性对于遏制病毒的持续性感染有极重大的意义。理论上，针对这些共性的防治策略有可能控制多种病毒的持续性感染。研究不同病毒的持续性感染的共性也是国际上传染病学和免疫学研究的最新生长点，所以，本项目在着眼于研究HBV和HIV等持续性感染的特点的同时，注重比较它们之间的异同，以求发现这些病毒持续性感染形成和维持的共性机制。本项目选择的关键环节包括病毒入侵细胞、复制调控、抗凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤等，是病毒持续性感染形成和维持过程中不可分割的有机组成部分，将这些关键环节纳入同一个项目进行研究，相对于
13、分别就某一个环节进行的研究而言，更有系统性，也更能反映持续性感染形成和维持的整体面貌。本项目的许多研究内容如HBV入侵细胞的机制、HIV跨越粘膜屏障的机理、病毒通过影响自噬而调控病毒复制、不同病毒抗凋亡机制的比较研究、病毒在持续性感染中诱导免疫耐受或免疫功能损伤机制等都是本领域的重大问题或热点问题。这些重大或热点问题的突破将开辟相关病毒研究领域的新发展方向，可能直接促进新的病毒感染细胞模型和疾病动物模型的产生，从而极大地推动领域发展。而首先在这些问题上取得突破的研究力量显然将在相关领域中取得优势地位，从而使我国在病毒持续性感染研究方面达到国际先进的水平。本项目拟与国际上本领域的先进实验室（加拿
14、大Alberta大学李嘉诚研究所）通过大型项目的联合资助，探索一条我国与他国间科学研究合作的新途径，实现人员和信息充分交流，资源和技术密切互补，合理分工，加快研究进度，齐心协力攻克科学难题。可行性分析：1. 理论上可行：本研究所涉及病毒与宿主细胞和分子的相互作用包括病毒表面蛋白介导病毒入侵细胞、病毒在细胞间的传递、维持持续性感染状态时病毒复制调控与再激活、病毒抵抗宿主细胞凋亡以及通过诱导免疫耐受与免疫损伤逃避或压制宿主免疫系统攻击等研究内容均基于国际相关领域的最新进展以及课题组长期的研究积累，有成功经验可循，部分研究已经取得初步成果。2. 具有资源优势：项目团队由从事基础研究、临床研究以及动物
15、模型研究的实验室构成，可保障研究工作获得必要的细胞模型、动物模型和临床标本等资源。其中主要承担单位之一复旦大学拥有多种HBV转基因小鼠模型，拥有HIV病毒株与伪病毒毒株近50株。3. 具有成熟的技术平台：项目团队中的复旦大学与中科院院所已具备国际标准的基因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学研发平台。项目团队已建立了转基因小鼠与灵长类动物平台，并具备生物安全二级与三级实验室等保障条件，为研究计划的实施奠定了物质基础。各课题组熟练掌握了进行毒力评价研究的多种方法和模型，所需其它各类实验技术均已被研究团队熟练掌握，开展本研究不存在技术障碍。4. 具有高素质的研究团队：本项目集合了来自多个国家
16、和省部级重点实验室、大多具有海外高水平实验室研究经历的中青年科学家为主体的研究团队，包括国家“千人计划”引进人才1人、中科院“百人计划”引进人才3人、 “国家杰出青年基金”获得者2人、省部级“杰出青年基金获得者”以及地方学科带头人与领军人才多名。集中了乙型肝炎、艾滋病以及疱疹病毒领域的高水平实验室，具有良好的工作基础，为本项目的完成提供了重要保障。课题设置思路：本项目紧紧围绕病毒形成和维持持续性感染的机制这个传染病基础研究中的核心科学问题，以我国当前最重要的持续性感染的病毒HBV（DNA/RNA病毒）与HIV（RNA病毒）为主要研究对象，部分借鉴疱疹病毒（DNA病毒）的成熟研究体系，分两个层面
17、病毒与靶细胞的相互作用和病毒与机体免疫系统的相互作用开展深入研究。病毒与靶细胞的相互作用选择病毒入侵细胞、病毒维持持续性感染状态时病毒复制的调控与再激活及病毒抵抗宿主细胞凋亡等环节；病毒与人体免疫系统的相互作用选择病毒诱导免疫耐受或免疫功能损伤逃避宿主免疫攻击等环节。因此，本项目共设置了5个课题，分别针对病毒形成和维持持续性感染的五个关键环节。课题间的联系及其与项目目标的关系：本项目的课题设置充分考虑了病毒形成和维持持续性感染所经历的主要关键环节。这些环节是几乎所有持续性感染病毒在形成和维持感染中都需要自然经历的过程，是一个完整的病毒持续性感染过程中不可分割的组成部分，因此各环节之间存在天然的
18、相互联系，分别选择这些环节作为课题研究内容具有鲜明的代表性和合理性，深入研究有助于获得对病毒形成和维持持续性感染机制方面更全面的认识，从而回答本项目的关键科学问题，并为病毒持续性感染的预防控制、疫苗和药物研发等奠定理论基础。课题1：HBV和HIV入侵靶细胞的机制主要研究内容： 将围绕上述两种代表性模式病毒在感染细胞的过程中，从病毒吸附到进入的不同时相，将细胞与组织水平模型有机地结合，渐进式地系统研究病毒与宿主细胞的相互作用及其进入靶细胞的方式（受体特异性或非特异性，融合或内吞），并分析影响感染的宿主分子。1. 研究病毒膜蛋白介导的病毒与宿主细胞作用的分子机制：(1) 以HepaRG细胞和树鼩原
19、代肝细胞培养体系为细胞模型，利用突变分析技术与生物信息学技术来研究病毒吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制。(2) 利用树鼩原代肝细胞细胞模型来筛选和研究与乙肝病毒表面蛋白相互作用的树鼩肝细胞蛋白，确定它们在乙肝病毒感染中的作用，并结合(1)的研究来验证其相关的人同源蛋白在乙肝病毒感染中的作用。在此研究基础上构建新的乙肝病毒细胞感染模型。2. 病毒膜蛋白介导的病毒进入宿主细胞的分子机制：(1) 建立HIV膜融合和细胞内吞的机制的模型：将表达HIV包膜蛋白Env的CD4+细胞与含有HIV受体CD4和辅受体CXCR4的靶细胞混合、模拟HIV膜融合过程;将含有
20、绿色荧光蛋白（EGFP）的HIV假病毒感染CD4-人表皮细胞A431， 检测EGFP评价通过内吞途径进入细胞的HIV病毒量。(2) 研究分子对HIV膜融合和内吞的影响：利用噬菌体肽库或酵母双杂交技术筛选与HIV包膜蛋白gp120和gp41结合的宿主分子；研究gp120或gp41与这些宿主分子的相互作用，并检测它们对HIV膜融合和内吞的影响，研究HIV进入靶细胞的分子机制。3. 利用肠道粘膜活组织模型探索病毒在细胞间传递（感染突触）的机制：(1) 采用近似于生理状态的人肠道粘膜体外活组织感染模型，通过活体成像与双光子技术，在细胞水平验证与病毒粘膜感染相关的宿主细胞分子与病毒的相互作用，观察模式病
21、毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，追踪病毒穿越粘膜的迁徙轨迹。(2) 分析病毒在穿越细胞膜的过程中，限制病毒入侵靶细胞的宿主因子及其与病毒作用的机制，观察感染微环境中各种因素，如病毒的存在形式、趋化因子的水平及其它各种常态或诱导产生的宿主生物学因素对感染过程的影响。课题目标：1) 建立HBV感染的细胞模型并揭示HBV感染肝细胞的分子机制；2) 阐明HIV通过细胞内吞和融合感染靶细胞的分子机制；3) 初步确定HIV跨越粘膜屏障并在细胞间传递的机制；4) 发表SCI研究论文12-15篇，其中IF10的研究论文1-2篇，IF5的研究论文4-5篇；5) 申请1-2项专利；6) 培养3-5名博士后
22、，10-15名博士研究生。承担单位:复旦大学、中科院微生物研究所、中科院武汉病毒研究所课题负责人：姜世勃教授复旦大学主要学术骨干：张晓燕 研究员复旦大学张继明教授复旦大学朱以萍副研究员中科院微生物研究所吴春晨副研究员中科院武汉病毒研究所 经费比例：19%课题2：持续性感染中病毒复制的调控机制主要研究内容：1. 研究HBV cccDNA形成的分子机理及表面蛋白的调控机制利用诱导表达HBV表面蛋白的细胞模型和突变分析方法，研究HBV cccDNA形成的分子机理及表面蛋白对cccDNA形成的调控作用，发现HBV表面蛋白调控cccDNA形成的主要信号通路，通过过表达、RNA干扰等技术研究参与cccDN
23、A形成的重要细胞因子，着重研究负责细胞内DNA修复的蛋白因子；在以上研究基础上，筛选能抑制cccDNA形成的小分子化合物。2. 研究HBV准种表面蛋白调控cccDNA的差异及其临床意义利用生物信息学方法归纳分析临床常见HBV准种的表面蛋白，利用在细胞模型中表达不同的表面蛋白结合突变分析、蛋白相互作用分析等技术手段研究表面蛋白对cccDNA形成的调控及其作用机制及其与临床表型之间的关联性；3. 研究HIV持续性感染中病毒复制调控机制。在HIV-1感染靶细胞后，研究病毒蛋白或基因通过与宿主细胞内元件的相互作用，抑制免疫信号传递的分子机制，包括：1）分析HIV-1主要病毒结构蛋白介导的逃避体液和细胞
24、免疫监视的机理; 2）揭示病毒在基因水平上阻止免疫细胞信号传递的可能方式; 3）研究天然免疫系统在HIV-1持续性感染中的作用。4. 研究比较HBV和疱疹病毒影响细胞自噬的分子机制在转录水平（如对自噬关键基因atg5、atg7、atg12等表达的调控）、蛋白质水平（如与Beclin 1，Vps34等自噬关键蛋白因子的相互作用）、钙离子信号通路（如病毒通过钙离子信号通路影响mTOR的活性）等多层次上研究HBV和疱疹病毒影响细胞自噬的分子机制，研究自噬状态的改变对病毒复制的调控，发现自噬信号通路上影响病毒复制的信号分子；在以上研究基础上，筛选能通过影响自噬活性而抑制HBV和疱疹病毒复制的小分子化合
25、物。课题目标：1) 揭示HBV cccDNA形成的分子机理，阐明HBV表面蛋白调控cccDNA形成的机制；2) 揭示HIV-1感染宿主细胞后如何逃避免疫系统监视而导致持续性感染的分子机制3) 阐明HBV和疱疹病毒调控细胞自噬以利于其复制的机理，发现共同的关键分子；4) 发表SCI研究论文15-18篇，其中IF10的研究论文1-2篇，IF5的研究论文5-6篇；5) 申请1-2项专利。6) 培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。承担单位:复旦大学、上海交通大学、中山大学、中科院上海生命科学研究院、中科院北京生物物理研究所课题负责人：谢幼华教授复旦大学主要学术骨干：赵慕钧研究员 中科院上海生命
26、科学研究院张欣欣教 授 上海交通大学医学院附属瑞金医院彭华研究员 中科院北京生物物理研究所邓强副研究员 中科院上海生命科学研究院潘春根 副教授 中山大学经费比例：22%课题3：持续性感染病毒拮抗细胞凋亡的机制主要研究内容：1. 筛选和鉴定乙肝病毒和疱疹病毒抑制细胞凋亡的病毒因子通过流式细胞技术、TUNEL、Anexin V免疫荧光法比较病毒感染和病毒蛋白及microRNA对细胞凋亡主要通路：死亡受体通路、线粒体通路及内质网通路的影响，从上述研究中发现参与细胞凋亡调控的病毒蛋白及miRNA。2. 分析病毒因子参与的信号通路建立表达或可诱导表达病毒蛋白以及病毒miRNA的稳定细胞株，检测细胞中MA
27、P、MAPK、MAPKK、JNK的磷酸化变化、细胞周期检验点关键分子ATM/ATR、Chk1/2、BRCA1、MDM2、p53等蛋白的表达、磷酸化水平及其在细胞内的定位，PI3K/AKT或NIK-NFkB通路中的关键分子变化，明确病毒蛋白以及病毒miRNA参与的信号通路。3. 研究病毒因子调节细胞凋亡的分子机制建立病毒蛋白的诱导型表达细胞株，通过串联亲和纯化（TAP）方法寻找与其相互作用的细胞蛋白，分析其直接参与的细胞关键信号通路（细胞凋亡、细胞周期检验点）；通过免疫印迹、荧光素酶报告基因分析等方法分析病毒蛋白是否调控凋亡相关蛋白的转录和翻译；阐明病毒蛋白调节细胞凋亡的分子机制。课题目标：1)
28、 揭示HBV和疱疹病毒持续性感染过程中病毒因子（蛋白，非编码RNA）与宿主蛋白相互作用，协同调控宿主细胞凋亡的分子机制，阐明病毒基因产物在建立和维持病毒持续性感染中的作用。2) 比较不同持续性感染病毒（HBV、疱疹病毒）在调控细胞信号通路的异同点，为控制病毒持续性感染提供理论基础和靶点。3) 发表SCI论文10-12篇，其中IF10的研究论文1-2篇，IF5的研究论文3-4篇；4) 申请1-2项专利；5) 培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。承担单位:中科院微生物研究所、中山大学、中科院武汉病毒研究所课题负责人：叶昕研究员中科院微生物研究所主要学术骨干：罗敏华研究员中科院武汉病毒研究所
29、宋立兵研究员中山大学刘燃义副研究员中山大学经费比例：16%课题4：病毒持续性感染诱导免疫耐受的机制及逆转策略主要研究内容：1. 乙肝病毒抑制天然免疫的识别、诱导免疫耐受。(1) 利用HBV稳定复制的肝细胞系研究HBV Pol蛋白和X蛋白与干扰素生成信号通路中重要分子的相互作用，并进一步在人源肝小鼠HBV感染模型和慢性乙肝患者肝活检组织中进行验证。(2) 利用HBV复制肝细胞系和人源肝小鼠HBV感染模型研究HBV Pol蛋白和X蛋白对干扰素诱导的JAK-STAT信号的抑制作用及对干扰素效应基因表达的影响。(3) 利用pDC细胞系、转基因鼠感染模型和慢性乙肝病人队列，研究HBV抑制性ODN序列和H
30、BV分泌的S蛋白作用于pDC干扰素生成相关信号通路的具体环节和作用机制，并进一步研究因pDC功能缺位所引起的天然免疫网络的功能失调。(4) HBV诱导NK细胞介导免疫耐受的机制：以健康人、免疫耐受者、免疫应答者为研究对象，分析TGF-、IL-10对NK细胞抑制性受体NKG2A、活化性分子NKG2D/DAP10、2B4/SH2D1A表达的影响，及与获得性免疫无能的关系。2.病毒诱导Treg导致获得性免疫耐受的机制。(1) HBV诱导CD4+T细胞免疫耐受：以HBV感染鼠为模型，研究肝脏微环境中，HBV通过枯否氏细胞协同作用诱导特异性Treg产生的机制。(2) HIV-1感染通过影响DCs TLR
31、s信号通路诱导Treg产生的机制：分析HIV-1感染正常发病者、长期感染不发病者（LTNPs），以及未感染人群外周血或淋巴结中pDCs与mDCs中TLRs信号通路的激活和抑制性因子（IDO等）的表达；分析IDO对CD45RA+CD4+ Nave T细胞分化为CD25+CD4+ FoxP3+ Tregs的影响。3.病毒持续性感染免疫耐受逆转策略研究。建立能模拟HBV慢性感染、具有免疫耐受特征的小动物模型，应用抗病毒药物、针对病毒特异性及可调控天然免疫通路的RNAi分子及能激活天然免疫系统的TLR、RLG等配体和相关小分子，观察抑制病毒复制、切断免疫抑制通路、调节Treg等手段对动物pDC,NK及
32、Treg数量及功能和HBV特异性获得免疫的影响,评价清除HBV感染的效果及成为新型免疫耐受逆转策略的可能性。课题目标：1) 揭示HBV诱导固有免疫耐受可能由病毒基因组和蛋白等介导及其分子机制2) 阐明HBV可通过诱导TGF-、IL-10产生而抑制NK细胞活化，上调抑制性受体NKG2A，导致NK细胞耐受；3) 证明HBV和HIV在枯否氏细胞和IDO协同下诱导Treg产生而导致获得性免疫耐受；4) 建立特异性打破HBV免疫耐受的方案或发现新型策略；5) 发表SCI研究论文12-15篇，其中IF10论文1-2篇，IF5论文4-5篇6) 申报专利1-2项；7) 培养3-5名博士研究生。承担单位:中国科
33、技大学、中科院上海生命科学研究院、复旦大学课题负责人：魏海明教授中国科技大学主要学术骨干：王建华研究员中科院上海生命科学研究院陈永艳副教授中国科技大学胡芸文副研究员复旦大学经费比例：19%课题5：病毒持续性感染诱导免疫功能损伤的机制与修复策略主要研究内容：1.持续性病毒感染致APC损伤的机制及损伤对获得性免疫细胞的影响.(1) 收集临床HBV与HIV感染者的血标本，利用多色流式与CBA技术，分析APC细胞表面的Toll样受体、CD70、CD80、CD86、MHC等分子的表达，及在病毒、RNA、CpG刺激时炎性分子与调控性细胞因子的分泌，并观察APC对T细胞活化与增殖的影响等。同时对NK受体(N
34、CR123)、gc类因子受体（IL-12R、IL-15R、IL-18R等）、NKG2A/2C、NKG2D等表面分子的表达进行观察，分析NK细胞因子和趋化或炎性分子分泌功能。(2) 利用转基因动物等模型观察APC损伤及对获得性免疫细胞功能的影响,临床标本中观察到的损伤现象进一步在动物模型中进行验证，并通过细胞学模型深入探讨其分子机制。2. 持续性病毒感染致T细胞损伤的分子机制(1) 持续性病毒感染致T细胞识别障碍与共刺激通路异常. 在不同临床进展阶段的感染者及动物模型，研究TCR通路上T-bet与Eomes的表达是否异常，其他激活活化信号是否异常。同时，在体外培养模型中，利用CD3/CD28、I
35、nomycin/PMA等非特异性刺激，确定感染者T细胞活化信号通路的障碍环节。(2) 持续性病毒感染致T细胞功能障碍与负向调控失衡机制. 在临床疾病不同阶段的感染者及动物模型，观察T细胞负向调控受体的表达，并在体外培养模型中，利用CD3/CD28或病毒来源的表位肽作为刺激信号，与不同负向调控分子（包括CTLA4、LAG3、CD160、Tim3、BTLA等）的刺激抗体或阻断抗体组合，观察T细胞出现的功能障碍及可能的机制。3. 病毒感染免疫损失的修复策略研究。利用细胞模型与动物模型再现病毒感染引起的免疫损失，并利用基因敲除或RNAi技术，探索利用基因敲除、RNAi或抗体阻断技术，探讨修复损伤的可能
36、机制与修复策略。同时探索抑制免疫系统过度激活降低免疫损伤的策略，观察降低病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对免疫细胞功能与亚群恢复的可能性。此外，研究不同T细胞亚群的凋亡机制（如记忆亚群中的Foxo3a），并探索通过阻断凋亡使T细胞亚群恢复长期存活的可能性。课题目标：1) 解析病毒持续性感染中固有免疫系统的损伤机制；2) 揭示病毒持续性感染中抗原特异性T细胞的免疫损伤机制；3) 争取获得1-2个具有应用潜力的修复策略，为乙型肝炎与艾滋病的免疫干预与治疗性疫苗的研制理论基础；4) 发表SCI研究论文15-18篇，其中IF10的研究论文1-2篇，IF5的研究论文5-7篇；5) 申请1-2项
37、专利；6) 培养学科带头人1-2名，培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。承担单位：复旦大学、解放军302医院、中国医科院基础医学研究所课题负责人：袁正宏教授复旦大学学术骨干：张政教授解放军302医院徐建青研究员复旦大学刘英副研究员中国医科院基础所周晓辉 副研究员 复旦大学经费比例：24%四、年度计划课题一、年度计划内容和目标课题一研究内容课题一预期目标第一年1. 通过突变分析技术、比较蛋白组学研究技术及生物信息学技术，研究HBV吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制；2. 利用重组杆状病毒表达系统，构建HBV重组杆状病毒；利用HDV系统，产生有HB
38、V包膜蛋白的HDV颗粒，建立HDV感染体系；3. 利用稳定表达HIV包膜蛋白及靶细胞受体蛋白的细胞，建立并完善HIV膜融合模型，利用绿色荧光蛋白技术在人表皮细胞A431上建立并完善细胞内吞机制模型；4. 采用人肠道粘膜体外活组织感染模型，进行感染相关的靶细胞及其表面分子分子的特征研究。5. 收集慢性HBV感染免疫耐受期（高病毒载量）患者和免疫控制期（低病毒载量）患者肝组织标本，用Affymetrix U133 2.0表达谱芯片检测两组患者肝组织的基因表达，分析与HBV载量相关的宿主差异基因。1. 获得HBV易感细胞、非易感细胞膜蛋白中与病毒表面蛋白和已知辅助受体相互作用的蛋白表达谱差异，以及突
39、变对HBV感染影响的数据，分析得出HBV吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制；2. 获得1-2株具有感染潜力的HBV重组杆状病毒；建立HDV感染体系，作为研究HBV感染机制的重要平台；3. 建立HIV膜融合和细胞内吞机制模型，对所建模型通过分子生物学、病毒学等多个层面加以验证。以此作为研究HIV感染机制的重要平台；4. 在细胞水平初步明确与HIV粘膜感染相关的宿主细胞分子特征；5. 初步筛选出100个与HBV载量相关的宿主差异基因。6. 发表SCI论文1-2篇。第二年1. 在树鼩原代肝细胞，以及已建立的HBV易感细胞HepG2-RRP模型上，利用pull
40、 down技术筛选HBV表面蛋白preS1的相互作用蛋白，并纯化结合蛋白、质谱分析测序2. 分析HBV包膜蛋白基因及其序列，结合临床资料构建针对HBV包膜蛋白关键序列或蛋白修饰（如糖基化修饰等）序列的HBV包膜蛋白基因突变体；利用重组杆状病毒系统或HDV感染系统，进行体外肝细胞系或树鼩原代肝细胞的感染分析；3. 选用大蛋白噬菌体库和骨髓瘤细胞库，筛选与HIV包膜蛋白gp41结合的宿主分子，并通过生物信息学等技术再次筛选得到与HIV感染（通过受体进入途径或内吞途径）相关的蛋白。4. 采用人肠道粘膜体外活组织感染模型，通过活体成像与双光子技术，观察模式病毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，追踪
41、病毒穿越粘膜的迁徙轨迹；5. 利用稳定产生HBV的细胞系（如2.2.15）和应用可复制的1.3倍体HBV质粒瞬时转染Huh7细胞，采用RNA干扰的方法，对100个差异基因进行体外验证。1. 初步筛选到2-5个与preS1相互作用的HBV易感细胞膜蛋白2. 获得以重组杆状病毒系统或HDV感染系统为基础的体外细胞感染系统;初步获得HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用如糖基化等的数据；3. 获得2-5个与gp41结合的与HIV进入或内吞途径相关的宿主分子。4. 了解病毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，初步获得病毒穿越粘膜的迁徙轨迹5. 筛选出5-10个与控制HBV复制相关的宿主
42、基因。6. 发表SCI论文2-3篇。第三年1. 通过分子构建表达、Co-IP等技术确定筛选到的蛋白与preS1之间的相互作用，排除假阳性。并通过生物信息学的方法分析筛选到蛋白在细胞功能中的作用及与HBV的潜在关系；2. 通过各种蛋白相互作用研究技术确认筛选到的HIV感染相关蛋白与gp41之间的相互作用，排除假阳性。并在已建立的细胞模型基础上，通过HIV感染抑制实验，初步研究该蛋白在病毒感染（通过受体进入途径或内吞途径）过程中的作用；3. 分析HIV病毒在穿越宿主细胞膜的过程中，限制病毒入侵靶细胞的关键宿主因子4. 将所筛选出的5-10个基因克隆至真核表达载体，采用过表达等方法，在2.2.15细
43、胞系和瞬时转染细胞系上分析这些基因过表达对HBV复制的影响。1. 排除假阳性，确认1-2个有研究潜力的与preS1相互作用的HBV易感细胞膜蛋白或人肝细胞蛋白；2. 确认1-2个有研究潜力的与gp41相互作用的细胞蛋白，在细胞模型上初步确认该蛋白在病毒感染过程中的重要性；3. 发现2-3个重要的宿主因子在HIV病毒穿越细胞膜过程中的作用。4. 确认1-2个有研究潜力的控制HBV复制的宿主基因。5. 发表SCI论文3-4篇；6. 申报专利1项。第四年1. 利用HBV或HBV报告基因载体、RNAi等技术，初步研究筛选到的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用；2. 利用重组杆状病毒系统或
44、HDV感染系统，建立以小鼠或树鼩等为基础的动物感染模型；以动物感染模型为基础，分析HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用数据，并对体外研究结果进行验证； 3. 通过过量表达及RNAi等技术，进 一步研究gp41宿主结合蛋白在病毒感染（受体进入途径或内吞途径）过程中的作用。同时，选用大蛋白噬菌体库和骨髓瘤细胞库，筛选与HIV包膜蛋白gp120结合的宿主分子，并通过生物信息学等技术再次筛选得到与HIV进入和内吞相关的蛋白；4. 深入研究前期发现的关键宿主因子影响病毒侵入的机制5. 采用与4种HBV启动子报告基因共转染等方法，研究这些宿主基因抑制HBV复制的可能机制。利用肝细胞感染模型
45、，研究这些宿主基因及相应的肝细胞蛋白对HBV入侵的限制或促进作用。1. 初步测定所获得的肝细胞preS1相互作用蛋白对HBV感染PTH中的重要性，根据结果分析其可能的作用机制；2. 初步获得一种稳定的动物感染模型；明确HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用数据；3. 初步阐明HIV通过gp41与一些宿主蛋白相互作用介导的病毒感染的相关机制；获得1-2个有研究潜力的与gp120相互作用的细胞蛋白；4.初步阐明关键宿主因子对HIV感染靶细胞的作用机制5. 初步阐明1-2种宿主基因控制HBV复制的新机制。6. 发表SCI论文4-5篇；7. 申报专利1-2项。第五年1. 利用HBV或HB
46、V报告基因载体、RNAi、抗体及preS1小肽等技术，在HepG2-RRP、HepaGR模型以及动物模型上确认筛选到的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用；2. 通过各种蛋白相互作用研究技术确认筛选到的蛋白与gp120之间的相互作用，排除假阳性。并在已建立的细胞模型基础上，通过HIV感染抑制实验，研究该蛋白在病毒感染（通过受体进入途径或内吞途径）过程中的作用；3. 观察HIV在感染微环境中各种病毒的存在形式以及趋化因子等对感染过程的影响4. 在HBV转基因小鼠中验证所筛选到的1-2种宿主基因对HBV复制的调控作用。1. 在HepG2-RRP、HepaGR模型或动物模型上，阐明筛选到
47、的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用，分析HBV感染靶细胞的机制；2. 获得HIV感染靶细胞过程中，与gp120结合的潜在新受体，并初步阐明其作用机制；3. 了解HIV感染微环境中具有较强感染性的病毒存在形式及其侵入宿主黏膜靶细胞的过程与影响因素，提出可能的生物学干预策略。4. 阐明1-2种肝细胞内宿主基因控制HBV复制的新机制。5. 发表SCI论文5-6篇；6. 申报专利1-2项。课题二、年度计划内容和目标年度课题二研究内容课题二预期目标第一年建立研究cccDNA的细胞模型和小鼠模型；建立HBV感染不同临床转归患者标本数据库的建立；构建表达作用于HIV-1特定基因的siRNA表达系统，CD4+细胞的HIV-1瞬时感染模型和稳定感染细胞株，在HIV-1稳定感染的细胞模型中，利用荧光定量RT-PCR、Microarray等技术测定HIV-1病毒的转录产物；研究细胞自噬对HBV或HBx 转染细胞的生存或死亡的影响；分析HSV-1、KHSV、E