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1、幻灯片1第二章 基因工程的酶学基础Enzymes幻灯片2第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。幻灯片31. 来源原核生物。2. 性质内切酶。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。3. 功能自我保护作用。细菌的限制和修饰系统（R/M体系）幻灯片4（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。幻灯片5（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切
2、酶识别切割。 Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基幻灯片6幻灯片7二、限制性内切酶的类型目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 幻灯片81. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。如 EcoB和 EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC幻灯片9（2）切割位点在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机
3、切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。幻灯片102. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。幻灯片11（2）切割位点识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACG
4、TC-5 产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端幻灯片12（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC 5-3 CTTAAG3-5 5-G AATTC -3 CTTAA G 3-5 幻灯片13 3端凸出（如Pst I切点）CTGCAG 5-3 GACGTC 3-5 5-3 CTGCA G 3-5 G ACGTC 幻灯片14（4）粘性末端的意义 连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。ii）同
5、一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。幻灯片15幻灯片16 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。幻灯片17（4）同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 幻灯片18 不完全同裂酶：识别位点相同，
6、但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 幻灯片19（5）同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 BamH I5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 Bgl 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。幻灯片20Sau 3A5-GATC-3 3-CTAG-5 同尾酶
7、的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？GATCT-3 A-5 5-G 3-CCTAG BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 Bgl BamH ISau 3A幻灯片21（6）限制酶的酶活性限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。幻灯片22使用的时候要特别注意！EcoR I和BamH I等都有*活性。GAATTCEcoR I：在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AA
8、ATTC、GAGTTC等7幻灯片23（7）s型限制性内切酶移动切割（shifted cleavage):在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。Hga IGACGCNNNNN 5 3 CTGCGNNNNNNNNNN 幻灯片243. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG在基因工程操作中用途不大。幻灯片25核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不
9、同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列 （IIs型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG幻灯片26切割位点在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端2426bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用幻灯
10、片27三、限制性内切酶的命名1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： l 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。幻灯片282. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上
11、M（Modification）。（现已省略）。幻灯片29四、影响限制性内切酶活性的因素1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 一般采取纯化DNA 加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积（ 20ml）幻灯片302. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。幻灯片313. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度o
12、CApa I Bcl I Mae II Taq I30 50 50 65Apy I BstE II Mae III30 60 55Ban I Mae I Sma I50 45 25幻灯片324. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；幻灯片33五、限制性内切酶对DNA的消化1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍
13、射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG幻灯片342. 完全消化 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。13241234幻灯片353. 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。 132414通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。幻灯片364. 限制酶酶切反应的终止 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。 5. 几种常用限制酶识别位点幻灯片37幻灯片386. 限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG * *MaeII Hpac MspIc * Alu I *
14、A*T Nla A*T ApoI Hind Afl III AgeI BsrFI A*T A*T SspI A*T 幻灯片39AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG A*T Nsp7524 C*G NcoI StyI Dsa I XmaI AvaI C*G NdeI C*G Pml I BsaAI PvuII NspBII SmaI C*G C*G G*C EcoRI ApoI NgoMI BsrFI 幻灯片40AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG G*CBseHI G*CEcl136II EcoRV NaeI G*CG*C AatII SacI Ba
15、nII HgiAI Bsp1286 SphI Nsp7524 T*A BspHI BspMII T*A T*A SnaBI BsaAI T*A T*A 幻灯片41CGCG CTAG GATC GCGC GGCC * MboIc Sau3AIc *BfaI HinpI * BstUI DpnI HaeIII * HhaIA*T A*T MluI Afl III SpeI Bgl II BstYI A*T A*T Eco47III StuI A*T 幻灯片42CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A*T HaeIIC*G DsaI AvrII StyI EagI EaeI GdiII
16、C*G C*G NspBII C*G SacII PvuI C*G BsiEI BsiEI G*C BssHII NheI BamHI BstYI KasI BanI Bsp120I 幻灯片43CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G*CNarI BsaHI G*CG*CG*C T*A BbeI HaeII ApaI BanII Bsp1286 T*A XbaI Bcl I EaeI T*A NruI FspI MscI T*A T*A 幻灯片44GTAC TATA TCGA TGCA TTAA * *Csp61 TaqI MseI * RsaI * A*T A*T A*T Cla
17、I AseI A*T ScaI A*T 幻灯片45GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A*T Nsi I C*G Bsi WI SfcI XhoI AvaI AvaI SfcI C*G C*G C*G C*G PstI G*C Asp718BanI Sal I ApaLI 幻灯片46GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*CAccI AccI G*CBsrl107I HincII HpaI HincII G*C G*C KpnI Bsp1286 HgiAI T*A T*A BstBIT*A DraI T*A T*A 幻灯片47第二节 DNA 连接酶一、DNA连接酶（
18、ligase)的发现从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA复制一定有断口。幻灯片48二、DNA ligase的特点1. 两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。幻灯片492. 连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+幻灯片50三、连接反应的机理1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。2. AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.
19、 AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。ATPPPi+H3NAMPOC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+幻灯片514. AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。AMP-OHHO-P-AMP-OHO-P-幻灯片525. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。幻灯片53四、连接反应的温度1. 最佳温度连接酶反应的最佳温度是37C。2. 实用温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 416 C。幻灯片54五、影响连接反应的因素1. 插入片段与载体的浓度比例 1020倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体
20、自我连接的现象。2. 反应温度12.5。一般1416幻灯片55第三节 DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶l 大肠杆菌DNA聚合酶 l 2. Klenow fragment l 3. T7 DNA聚合酶 l 4. T4 DNA聚合酶 l 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶幻灯片56二、常用的DNA聚合酶的特点1. 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3OH端。2. 主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。幻灯片573. 常用DNA聚合酶的
21、特性比较DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高幻灯片58三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽。53外切酶活性位于N端。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。幻灯片59（2）DNA聚合酶I（P
22、ol I）的反应条件 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板dNTPs5 -OH3 幻灯片60（3）用DNA聚合酶I 制备探针 核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。标记已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交幻灯片61 探针的标记方式5 标记已知序列的核酸片断3 标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断幻灯片62 DNA聚合酶I 对探针序列的标记l 放射性同位素标记：切口转移法(nick translation )：DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的
23、聚合酶活性（以及35外切酶活性）。幻灯片6353外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5 3 3 5 3 5 3 5 幻灯片64纯化的DNA片断5 3 3 5 3 5 DNase I 制造单链切口5 3 32P-dNTP3 5 一种a-32P-dNTP和dNTPs 5 3 32P-dNTP3 5 DNA Pol I 进行切口转移3 5 从头至尾都被标记8幻灯片652. Klenow fragment（1）Klenow fragment的性质具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。枯草
24、杆菌蛋白酶DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 幻灯片66（2）主要用途 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。klenow5 5 klenow DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。幻灯片67限制性内切酶切EcoR IBamH I3隐蔽末端的DNA片断5-G3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 根据末端的顺序选择一种 a-32P-dNTPsa-32P-dATPa-32P-dGTP25oC 1h5-GG3 3-CCTAG5 5-GAA3 3-CTTAA5 Klenow fragment补平5-GAATT3 3-CTTAA5 5-GG
25、ATC3 3-CCTAG5 末端标记的DNA 幻灯片68 cDNA第二链的合成mRNA5 3 逆转录cDNA第一链3 5 klenow引物cDNA第二链3 5 幻灯片693. T4 DNA聚合酶（1） T4 DNA聚合酶的性质 来源从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。 酶活性有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。幻灯片70 特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。幻灯片715 3 5 3 T4 DNA聚合酶无dNTPs5 3 5 3 T4 DNA聚合酶有dNTPs5 5
26、 幻灯片72（2） T4 DNA聚合酶的用途 补平隐蔽末端 DNA 3末端标记标记末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。 再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。幻灯片735 3 DNA酶切片断5 3 无dNTPsT4 DNA聚合酶 （35外切）5 3 5 3 加入某种32P-dNTP和dNTPs内切酶切T4 DNA聚合酶 （53聚合）5 3 5 3 酶切中间产生两个末端标记3 5 3 5 5 5 3 3 幻灯片74a. 放射性标记的优缺点：优点：制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。缺点：半衰期短（32P
27、只有14.3天）、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。幻灯片75b. 非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶RCH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。幻灯片76利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中5 3 纯化的DNA片断3 5 DNase I 制造单链缺口3 5 5 3 生物素-dTTP生物素-dTTP和dNTPs 3 5 5 3 生物素-dTTPDN
28、A Pol I 进行缺口转移5 3 3 5 幻灯片77光促生物素标记探针序列+生物素连接臂光敏基因光照探针序列生物素连接臂光敏基因幻灯片78生物素的识别亲和素：能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：抗生物素蛋白（avidin）：是一种鸡卵清蛋白。链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：细菌中avidin的类似物。幻灯片79ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。幻灯片80幻灯片81iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶 （ho
29、rseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。幻灯片82化学发光底物幻灯片83HRPO和AP的显色反应底物幻灯片84发光反应机理幻灯片85iv）用非放射性标记的探针检测原理探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。待测基因底物生物素探针序列中间产物亲和素酶发光产物幻灯片86核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。幻灯片874
30、. T7 DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。幻灯片88（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍幻灯片89（3）T7 DNA聚合酶的用途 以大分子量DNA为模板的合成如M13 进行末端标记 取代合成法标记3末端。与T4 DNA聚合酶相同。 补平隐蔽末端合成补平3隐蔽末端； 水解修平3突出末
31、端。幻灯片905. 修饰后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA测序双脱氧法。 标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末端幻灯片916. 逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：（2）性质由a和b两条多肽链组成。幻灯片92 a链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH： a链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以53或35
32、方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNA DNARNaseHRNA DNA幻灯片93 b链RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。（3）逆转录酶的用途 合成cDNA以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。mRNA 5 3 AAAAA5 TTTTTcDNA幻灯片94 合成DNA探针用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合） RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。幻灯片95第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶（te
33、rminal transferase）1. 来源小牛胸腺。2. 组成大小两个亚基。3. 特性（1） 53DNA聚合酶活性幻灯片96 需要3OH、二甲胂酸缓冲液。 不需要模板！ 底物可以是单链DNA、 是3OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。3 DNA 5 dTTP ，末端转移酶TTT幻灯片974. 末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。5 3 5 载体DNA3 外源DNAdGTPdCTP末端转移酶CCCGGGCCCGGG幻灯片98便于回收克
34、隆片断。（2）再生酶切位点5 AAGCTT TTCGAA5 Hind酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平幻灯片99AAGCT TTCGAAGCTT TCGAA末端转移酶dTTPAAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAA外源DNAAAA幻灯片100连接Hind位点Hind位点AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAA（3）非放射性标记DNA片断的3端催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）幻灯片101二、T4多核苷酸激酶1. 来源T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物
35、细胞中也发现这种酶。2. 功能催化g磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。不论5-OH端突出与否。幻灯片102-OH3 HO-5 -OH3 HO-5 ATPT4多核苷酸激酶3 -OHP-5 -P3 HO-5 如果ATP的g磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。幻灯片1033. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。（1）正向反应（forward reaction）3 -OHP-5 -P3 HO-5 碱性磷酸酶3 -OHHO-5 -OH3 HO-5 (g-32P)ATP多核苷酸激酶3 -OH32P-5 -32P3 HO-5 幻灯片104（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(g-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(g-32P)ATP的g-32P与DNA5端的磷酸交换。3 -OHP-5 -P3 HO-5 多核苷酸激酶(g-32P)ATP、ADP3