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1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶的分类：根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoB、
2、EcoK。第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoPI、HinfIII。限制酶在遗传学方面的应用：1、 在甚因工程方面利用能产生“粘性末端” 的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的D
3、NA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬
4、菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求使用安全。显然, 要寻找理想的天然载体是不容易的。实际上, 基因工程中所采用的载体, 都是重新建造的。2、在遗传分析方面要确定杂种子代中某部分DNA来源于哪一亲本, 用经典的遗传分析方法, 是相当困难的,若借助于限制酶, 则大为方便.3、在生物进化方面用限制酶处理后的DNA水解片段的电泳图谱进行比较的方法, 来分析生物的亲缘关系和进化, 特别是在近缘生物的分析中, 更
5、具独特的优点.它既比DNA碱基顺序分析要简便,也比蛋白质氨基酸顺序的分析要直接, 更比染色体组型分析要精细.例子：EcoRIEscherichia coli5GAATTC3CTTAAG5-G/AATTC-33-CTTAA/G-5BamHIBacillus amyloliquefaciens5GGATCC3CCTAGG5-G/GATCC-33-CCTAG/G-5限制性核酸内切酶 Not一、概念： Not是一种罕见的限制性内切酶，它可识别八个碱基的核酸序列( 5-GC/GGCCGC-3) ，在低盐的情况下它还可识别( 5-AC/GGCCGT-3)。Not不仅为一普通的限制性内切酶，它在生物领域的其
6、他方向也具有重要的应用价值及研究潜力，有关Not蛋白性质特征及功能机制等方面的报道最近日渐增多。二、应用：1. Not识别位点每65kb 的随机碱基序列中才出现一次，故可被用于基因组大片段的产生以及DNA 甲基化定位图谱的绘制。2. 因为其识别位点中富含GC序列，故其在真核生物基因组的GpC岛上出现频率较高（GpC岛通常位于基因转录起始区域，并且是DNA甲基化的热点区域）因此它可在很大程度上影响基因的表达。Not对甲基化相当敏感，甲基化其识别位点的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都会阻止DNA被切割。基于其低频率性和甲基化敏感性，Not通常可被用于在地标基因组扫描技术( Restriction
7、Landmark Genomic Scanning，RLGS)中引进放射性标记物，这一技术已在肿瘤细胞中异常甲基化的研究中得到了广泛应用3。3. 在目前已被公认的各种限制性内切酶中，Not是唯一一个发现具有金属结构域的蛋白酶。这一结构域由金属离子及四面体结构的Cys4模体构成的，位于靠近DNA识别位点的区域，在维持蛋白的组织结构上起一定作用。这一研究结果表明Not有可能是随机性核酸内切酶( 其可识别更长的目的片段) 与限制性核酸内切酶的中间进化产物。因此，为进行Not蛋白结构、性质及机理的进一步研究，其高表达菌株的构建及高纯度蛋白的大量获得显得极为重要。三、研究现状： 但目前商品化Not蛋白的
8、价格依然居高不下，其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在，这一原因亦是造成许多其他广泛应用的限制性内切酶价格昂贵的主要因素。现在Not纯化流程涉及到了磷酸纤维素阴离子交换柱、肝素琼脂糖亲和层析柱、DEAE-琼脂糖柱、PEI 柱四步上柱洗脱过程，最后再将Not在其存储缓冲液中透析过夜，整个纯化流程约需3 4d，工艺繁琐且蛋白损失相当严重。 为探索限制性内切酶的提纯新工艺，可通过分离和鉴定了Not基因后，及重组体的改建，对重组菌进行诱导条件摸索，获得了高表达工程菌。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统，对蛋白的纯化工艺进行创新优化，使提纯步骤大大简化，提纯时间缩减为原
9、来的1 /10，提高了得率、保证了酶活，从而使其在产量和效率上较以前报道均有很大程度提高，为实验室制备及工业化生产型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得不仅在常规分子生物学实验中具有较高的应用价值，为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考，也为进一步研究Not限制性内切酶的结构及其特殊功能的研究奠定了良好的基础。聚合酶聚合酶-分类可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物
10、的3-OH延伸，这DNA的合成方向记为53。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(NTP)外，还需要Mg2+ 、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下，在前一个核苷酸3-OH与下一个核苷酸的5-P聚合形成3，5-磷酸二酯键，其新生链的方向也是53。聚合酶-特性聚合作用:在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。35外切酶活性校对作用:这
11、种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸53外切酶活性切除修复作用:53外切酶活性就是从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。RNA聚合酶的功能包括以下几个方面：（1）从DNA分子中识别转录的起始部位；（2）促使与酶结合的DNA双链分子打开；（3）催化适当的NTP以3，5-磷酸二酯
12、键相连接，进行聚合反应，完成一条RNA转录本的合成；（4）识别DNA分子中的转录终止信号，促使聚合酶反应的停止；（5）参与转录水平的基因表达调控。DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶（定位于胞核，参与复制引发具53外切酶活性），（定位于核内，参与修复，具53外切酶活性），（定位于线粒体，参与线粒体复制具53和35外切活性），（定位核，参与复制
13、，具有35和53外切活性），（定位于核，参与损伤修复，具有35和53外切活性）。原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。双酶切双酶切：使用两种不同的限制性内切酶进行酶切产生两个不同的末端，从而使载体与目的基因的连接方向只存在一个，且可避免载体自连。双酶切的操作：1. 同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBu
14、ffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见内切酶在不同缓冲液里的活性表及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。2. 分步双酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。注意事项：因为一个载体会有多个酶切位点，导致双酶切虽然会切出两条带但是不能保证一定具有两个不同的末端，故需选择酶切位点相对少的的载体。