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1、苄嘧磺隆对野慈姑的生测检验一 综述; 1 野慈姑形态特征野慈姑又叫驴耳菜，属泽泻科，为多年生杂草。它主茎直立，株高，根生叶，簇生，幼苗鞘叶条形弯曲，叶呈条状，叶呈舌状（披针叶），第叶以上为狭窄剑型叶，两侧叶耳长，叶尖和耳部均为尖长，叶柄粗长有棱，茎部膨大成鞘状，第片剑型叶茎部中间抽花茎，圆锥花序，花轮生，每轮朵，白色，单性，雄花在上部，雌花在下部，地下有须根和球茎，球茎呈卵圆形，有鳞片，野慈姑一般产生个花茎分枝，个别多的能达到个花茎分枝，可结轮花朵，其中轮花朵（朵）均已成熟野慈姑由球茎和种子越冬，翌年繁殖。球茎一般在月下旬至月上旬发青5月中旬开始生根、出苗，6月中下旬开始开花，月上旬为盛花期，
2、8-9月成熟。种子一般在月底至月上旬出苗日种子开始发叶，一直延迟到月底。有少量种子可延迟到月中旬出苗日仍有慈姑种子出苗）。凡是月日出苗的野慈姑到月日都能长出舌状叶，并且都能在新根尖端处生长球茎，野慈姑结球期一般在月中旬至月上旬，野慈姑种子生长在舌状叶片以上的植株，均能结球，一般结球数量个，多则个以上，种子苗结球小、数量少，球茎生长的野慈姑结球大、数量多分布危害黑龙江水田大部分都有野慈姑分布。调查野慈姑植株，茎部第轮朵花，每朵花产生的种子量粒，花朵小种子量就少，花朵大种子量就多。每轮朵花可产生种子粒，球茎野慈姑成株共轮生，节位花朵，按有效产生轮花节位朵花，株野慈姑产种子量大约在粒，每个球茎野慈姑
3、植株可分株花茎，共计朵有效花，共产生种子量在粒。水田野慈姑球茎分布大致如下：轻田块球茎分布每平方米个以内，较重田块球茎分布个左右，严重田块球茎分布个。野慈姑生长迅速，枝叶繁茂，强烈抑制了水稻的生长，一般公顷减产稻谷，严重减产可达。杂草防效调调查杂草防效，对稗草、野慈姑防效达以上的有处、，其中处理、防效最高，均为。第次杂草防效在7月日调查，对稗草、野慈姑、雨久花防效达以上的有处理、，与杂草鲜重防效都达以上处理基本一致。水稻产量分析处理的水稻产量分别为、，表明所有药剂处理产量均明显高于空白对照，其中处理产量最高，其次为处理，再次为处理、，处理、分别比常规药剂处理增产、. ,、。二 苄嘧磺隆 ( b
4、ensulfuron- methyl ) , 又称苄磺隆商品名为；农得时 ( Londax) , 化学名称: 中文为2- ( 4,6 - 二甲氧基嘧啶- 2- 基)氨基羰基氨基 磺酰基甲基 苯甲酸甲酯;分子式: 。分子量: 410.40 。化学结构式: 苄嘧磺隆是 20 世纪 80 年代中期美国杜邦公司（) 开发的 一种新型磺酰脲类除草剂, 具有高效、广谱、低毒及低用量等优点, 是目前广泛用于稻田杂 草防治的主要除草剂之一。苄嘧磺隆在使用的同时, 其降解物是否对环境有不良影响已成 为科学工作者日益关注的问题。 本文仅 就当前国内外对苄嘧磺隆降解研究的现状和研究动向进 行分析。2.1 苄嘧磺隆的
5、理化性质及其应用苄嘧磺隆原药有效成分含量大于96% ,为白色略带浅黄色无臭固体, 熔点185188, 蒸气压为 1.7 10-3Pa(20) 。20时在各种溶剂中的溶解度: 二氯甲烷11720 mg/L ,乙腈5 380mg/L ,乙酸乙酯1660mg/L,丙酮1380mg/L,甲醇990 mg/L。2 5时在磷酸盐缓冲液中的溶解度随pH变化而不同: pH5时为 2 . 9mg/L,pH6时为12mg/L , pH7时为120 mg/L , pH8时为1200 mg /L 。在微碱性溶液中稳定,酸性水溶液中缓慢降解,在醋酸乙酯二氯甲烷乙腈和丙酮中稳定,在甲醇中可能分解。苄嘧磺隆属低毒除草剂,原
6、药大鼠急性经口 LD50 5 000 mg/ k g,兔急性经皮 LD50 2 000 mg / kg , 大鼠急性吸入 LC 50 7 .5 mg/L 。鲤鱼(48h) LC 50 1000 mg /k g , 水蚤(48 h) LC 50 100mg/kg 。苄嘧磺隆适用于水稻插秧田和直播田防除阔叶杂草。如鸭舌草、眼子草、节节菜、陌上菜、 矮慈姑 等及莎草科杂草如牛毛草、异型莎草、水莎草、碎米莎草、萤蔺等。对禾本科杂草防效差, 高剂量下对稗草有 一定的抑制作用。苄嘧磺 隆使用方法灵活, 可用药肥、药土、药砂、喷雾、浇灌等方法, 用量 20 30g/hm2,可与丁草胺、杀草丹、优克稗、禾大壮
7、、甲磺隆、乙草胺等剂混用, 是我国水稻田中使用面广、时间长、量大的一种除 草剂。三 抗苄嘧磺隆慈姑ALS基因突变位点东北地区属于施用稻田化学除草比较早的地区之一,使用磺酰脲类除草剂已有20余年。研究结果证实,延边地区稻田发生抗苄嘧磺隆的雨久花、慈姑、扁秆藨草,过去对SU除草剂极为敏感的慈姑、雨久花大发生,其靶标酶)新型乙酰乳酸合成酶(ALS)对苄嘧磺隆、吡嘧磺隆的抗性系数增到几十倍。本试验通过测定感、抗性生态型慈姑ALS基因部分片段的碱基序列,了解抗性ALS基因突变位点。3.1 供试植物抗药性慈姑(Sagittaria sagittrifoliaL. var.longilobaT. )材料采自
8、多年连续使用苄嘧磺隆、吡嘧磺隆的延边地区稻田,敏感性材料采自野池塘3.2 慈姑ALS基因特异兼并引物设计与合成通过美国生物技术信息中心(NCBI)登录的x51514(拟南芥)等10种植物的ALS氨基酸序列信息分析,利用Primerprimier5. 0程序设计了1对特异简并引物,其上游引物Ap1:TC(A/C)ATGGA(G/A)AT(C/T)CA(C/T)CA(C/G)GC;下游引物Ap2:CC(C/A/G/T)GT(C/G/A)AC(A/T/G)CG(A/G)TC(A/G)TC(A/G)AA。1. 3 慈姑总RNA提取、RT-PCR扩增、ALS基因片段克隆及测序利用Trizol一步法制备总
9、RNA。参照TaKaRa反转录试剂盒说明书,以Oligo dT为引物,以提取的总RNA为模板,经反转录合成cDNA。利用特异简并引物Ap1、Ap2,以反转录cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系由10ExTaqbuffer(210Ll)、cDNA(110Ll)、Ap1(10 pmol/L, 110Ll)、Ap2(10pmol/L, 110Ll)、dNTPMixture(215 mmol/L, 210Ll)、ExTaq(015Ll)、ddH2O(1215Ll)构成,反应程序为94e30 S, 55e30 S, 72e1 min,循环30次。回收、纯化PCR扩增的目的DNA片段,利用pMD-18T
10、载体将目的DNA片断转化至JM109感受态细胞中。经白斑筛选将其接种于含氨苄青霉素的LB培养液中并震荡培养,按煮沸法提取质粒。将重组质粒DNA经酶切鉴定为阳性的DNA克隆委托上海博亚生物公司测序。2 结果目的片段RT-PCR产物与质粒重组鉴定利用特异简并引物Ap1、Ap2进行RT-PCR扩增,扩增产物经电泳获得了800 bp左右的DNA片段(图1)。这与引物设计扩增目标779 bp基本相符合,说明扩增产物是感、抗性慈姑ALS基因编码区的DNA片段。克隆重组质粒DNA目的片段经酶切、鉴定,同样获得800bp左右的DNA片段图2),与RT-PCR扩增产物相似,证明重组质粒DNA中含有目的DNA片段
11、3.2.2 目的基因片段测序分析对测序结果采用DNASIS软件进行排序分析,结果表明,本试验碱基测序区域为363位点到1142位点(以拟南芥ALS基因编码为标准)。其中,抗性慈姑ALS基因编码区第972位的碱基发生转换突变(腺嘌呤A972y鸟嘌呤G972),导致了ALS第324位点氨基酸替代突变(苏氨酸Thr324y丙氨酸Ala324),其他碱基位点突变其他碱基位点突变均属于兼并碱基的无效突变(表1)3.2.3 慈姑与植物类ALS氨基酸同源性分析采用DNASISDemo软件分析和比较感抗.性慈姑目的片段ALS氨基酸序列和其它5种植物的同源性,结果显示,慈姑与低等类绿藻的同源性为70%,与其他高
12、等植物的同源性为80%以上,与日本自生慈姑(Sagittaria trifoliaL. ) (登录号:BAF57909)的同源性为100%。说明慈姑变种之间ALS基因非常稳定。3 讨论国内外研究结果表明,杂草ALS基因抗性突变,常发生在一定的部位和一定的位点4-6。从多种抗药性杂草ALS基因图谱不难看出,目前常发生抗性突变的5个位点(第122位Ala, 197位Pro, 205位Ala, 574位Trp和653位Ser)均是其保守区域。某种杂草的抗药性突变强度、交叉抗药性范围等化性状与突变部位、突变点数量、被取代的氨基酸种类也有相关性6-7。本试验结果表明,抗性慈姑ALS第122位Ala197
13、位Pro、205位Ala均没发生突变(第574位Trp和653位Ser在本试验测序域之外),而发生突变的位点是第324位。虽然此位点的突变目前还是首例,但这个区域同样是一个较长的保守区域(320336位点),具备了发生抗性突变的共同特征。通过多种植物的比较发现,植物ALS一级结构较大范围的保守区约有10处。我们认为,在保守区内氨基酸不可能发生随意性突变,如果突变/过度0,会丧失其固有功能。不同种类的ALS抑制剂各自具有与ALS结合位点,如果此结合位点的氨基酸残基发生异性氨基酸替代而不能与除草剂结合成ALS-除草剂复合物,就会出现ALS同功异构的抗药性现象。慈姑目的片段ALS氨基酸序列和其它植物的同源性约80%,而与日本自生的慈姑ALS同源性达到100%,说明慈姑变种之间ALS基因非常稳定。同样,同属植物之间的ALS氨基酸一级结构保持很高的同源性和具有稳定的保守区。这为未知植物类特异引物设计提供了便利条件。由于本试验慈姑ALS碱基测序区域仅限于第363位点到1142位点,至于非测序区域ALS是否发生抗药性变异等问题,需通过ALS因全码解密来揭示。