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1、一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml) = 1.45*OD280-0.74*OD260 * Dilution factor（2）精确计算通过计
2、算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果： 蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D 其中d为测定OD值比色杯的厚度 D为溶液的稀释倍数二紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。【实验原理】大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速
3、，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】1.实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。2.实验试剂(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mgml的酪蛋白溶液。(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。【实验操作】1. 绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂： 管号试剂 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液(ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 蒸馏水(ml) 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 蛋白质浓度(mg/ml) 0.000 0.125 0.2
4、50 0.375 0.500 0.625 0.750 试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。2. 测定未知样品取样品溶液4毫升,加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。 【实验结果】根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质
5、浓度。三双缩脲法（Biuret法）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9 L B P n! 试剂与器材# S; d( z/ I+ M( h3 C6 试剂： T! $ d3 V, J%
6、 A（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。1 ) + : 1 L2 N ?6 C（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于
7、塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。- P( C4 v( K6 / 器材：) m, W4 G% C9 , w) O1. 可见光分光光度计) q A4 S8 X9 t, n2. 比色杯! l# T# q; g* G e3. 大试管15支+ |/ Y- a3 P+ d& H4 - v4. 旋涡混合器等。: P h/ f: h( e4 u/ d% o% - B操作方法2 G0 ?3 _+ - h) F V1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入
8、4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。+ l% A( Y 7 j; o U2. 样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。7 S2 ?% p8 4 H/ 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。四BCA方法测定蛋白质含量【实验目的】掌握用BCA方法测定
9、蛋白质含量的原理和操作方法【实验原理】BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。【实验材料】 1.实验器材721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管
10、架和试管。 2.实验试剂(1) BCA试剂的配制 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O62H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。 试剂B，50ml：取2g CuSO45H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。 BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400g/ml的溶液。(3)样品溶液：配制约5
11、0g/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。【实验操作】1.绘制标准曲线取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。管号1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（l）蒸馏水（l）BCA试剂（ml）蛋白质含量（g）0 250 5 0 50 200 5 20 100 150 5 40 150 100 5 60 200 50 5 80 250 0 5 100 上述试剂加完后，混匀，于37保温30min，冷却至室温后，以第1管为对照，在562nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品测定准确吸取250l样品溶液于一干燥洁净的试管中，加入BCA试剂5ml，摇
12、匀，于37保温30min，冷却至室温后，以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。【实验结果】根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。五Lowry法目的掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 原理 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。操作取试管7支、编号、按下表操作： 立即混匀，在2025水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。 操作注意事项： 1按顺序添加试剂 2试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲
13、）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。 计算 (一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 (二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(gL)。 (三)再从标准管中选择管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(gL)。 器材 (一)721型分光光度计 (-)恒温水浴箱 (三)中试管7支 (四)刻度吸管：1.0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。 试剂 (一)试剂甲 (1)4碳酸钠(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氢氧化钠溶液 (3)1硫酸铜溶液(CuSO45H2O) (4)2酒石酸钾
14、钠溶液(或酒石酸钾或钠) 在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 (一)试剂乙： (1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。 (2)或取Na2WoO42H2Ol00g和Na2MOO325g。溶于蒸馏水700ml中，再加85H3PO450ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈
15、黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。 (三)标准蛋白质溶液 用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mgml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。 (四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。六考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理 考马斯亮蓝法测
16、定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓 度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶
17、液中含蛋白质5L/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10100g蛋白质，微量测定法测定范围是110g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100，SDS，玻璃去污
18、剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇。二、标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白质溶液。三、器材试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度计。
19、操作方法一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表a试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b试管编号0123
20、451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。注意事项（1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2） （2） 测定中，蛋白
21、染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。七凯氏定氮法【实验目的】学习凯氏定氮法的原理和操作技术。【实验原理】 凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。 当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨
22、，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。【实验材料】1.实验器材微量凯氏定氮仪 1套；50ml凯氏烧瓶 4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠2.试验试剂(1)浓硫酸；30氢氧化钠溶液；2硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01molL)。(2) 粉末硫酸钾硫酸铜混合物
23、：K2SO4与CuSO45H2O以3：1配比研磨混合。(3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50ml 0.1甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。(4) 样品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。【实验操作】1.安装凯氏定氮仪。2.消化：取4个50ml凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品1ml，催化剂(K2SO4- CuSO45H2O)200 mg，浓硫酸5 ml。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号及4号瓶中各加1 ml蒸馏水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照。在通风橱内进行消化。 在消化开始
24、时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力，冷却至室温。3.蒸馏：(1)蒸馏器的洗涤：用水洗涤干净微量凯氏定氮仪，在蒸汽发生器中加入用几滴硫酸酸化的蒸馏水和几滴甲基红指示剂，用这样的水蒸气洗涤凯氏定氮仪。约15分钟后，在冷凝器下端倾斜放好装有硼酸-指示剂的锥形瓶，继续蒸汽洗涤2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。移走锥形瓶，停止加热，打开夹子。(2)蒸馏：取下棒状玻塞，用吸管吸取消化液，细心地插到反应室小玻璃杯的下方，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下
25、方，使冷凝器下端浸没在液体内。取30的氢氧化钠溶液10ml放入小玻璃杯中，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5ml。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子，开始蒸馏。氨气进入锥形瓶，瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。变色时起记时，再蒸馏5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面，继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净，再继续下一个蒸馏操作。待样品和对照均蒸馏完毕后，同时进
26、行滴定。4.滴定：用0.01molL的标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿色变淡紫色为滴定终点。【实验结果】运算下列公式计算出每次无机氮标准样品和未知样品的总含氮量。式中 WN每毫升样品的含氮毫克数； A滴定样品消耗的盐酸量（mL）； B滴定空白消耗的盐酸量（mL）； C测定样品所取用量（mL）； 0.0100标准盐酸物质的量浓度（mol/L）； 14.008每摩尔氮原子质量（g/mol）。 三次样品测定的含氮量相对误差应小于2%。样品粗蛋白含量总氮量 6.256.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。.这个系数来自蛋白质平均含氮量为16，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含
27、氮量不完全相同。Lowry法蛋白浓度测定试剂盒 组成 包装（1000微孔) 保存 Folin酚甲试剂A 100ml2 2-8 Folin酚甲试剂B 5ml 2-8 Folin酚乙试剂(1N) 20ml 2-8 PBS稀释液 30ml 2-8 BSA蛋白标准 (5mg/ml BSA) 1ml -20 本试剂盒自订购之日起一年内有效。 Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。定量范围为5100g/ml蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品
28、中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。操作说明：一 .酶标仪法 1. 根据需要量，将Folin酚甲试剂A和Folin酚甲试剂B按50：1混合，其有效期为24小时，过期失效。 2.稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。 3.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时
29、的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 4.将配好的Folin酚甲试剂每孔加入200微升，轻轻震动，混匀，室温放置10分钟。 5.各孔加入20微升Folin酚乙试剂，迅速混匀，37放置30分钟。用酶标仪测定A650，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 6.使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。 注：如没有酶标仪，可用分光光度计，将所加试剂都等比放大，在离心管中混匀后加入比色皿中比色。二 .分光光度计法 如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。步骤如下： 1根据需要量，将Folin酚甲试剂A和Folin酚甲试剂B按50：1混合，其
30、有效期为24小时，过期失效。 2稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。 3取八支（或者更多）5ml离心管，标让号，按下表加入试剂。 4混匀，37放置30分钟。用酶标仪测定A650。BCA蛋白浓度测定试剂盒 组成 包装（500微孔) 保存 BCA试剂 100ml 2-8 Cu试剂 3ml 2-8 PBS稀释液 30ml 2-8 BSA蛋白标准 (5mg/ml BSA)1ml -20 本试剂盒自订购之日起一年内有效。 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸
31、收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。操作说明：一 . 微孔酶标仪法 1.配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。 2.稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释）
32、，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。 3.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 4.各孔加入200微升BCA工作液，37放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算 出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。二 . 分光光度计法 如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。 步骤
33、如下： 1.配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。 2.稀释标准品：取100微升BSA标准品用PBS稀释至1ml（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。 3.取八支（或者更多）5ml离心管，标让号，按下表加入试剂。 4.37放置15-30分钟。用分光光度计测562nm处吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。Bradford蛋白浓度测定试剂盒 组成 包装（2500微孔) 保存 5G250染色液 100ml 2-8 PBS稀释液 30ml
34、 2-8 蛋白标准(5mg/ml BSA) 1ml -20 本试剂盒自订购之日起九个月内有效。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用索莱宝生产的BCA蛋白浓度测定试剂
35、盒。操作说明：一.微孔酶标仪法 1.完全溶解蛋白标准品，取10ml，稀释至250ml ，使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 2.5G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml 5G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1G250染色液，此1G250染色液可在4保存一周。 3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。 4.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器
36、在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。 5.各孔加入200微升稀释后的1G250染色液，室温放置3-5分钟。 6.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 7.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。二.分光光度计法如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。步骤如下： 1.取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。2.取100ulBSA，加PBS 2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。 3.5G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml 5G250染色液，加入40ml双蒸水，混匀成1G250染色液，此1G250染色液可在4保存一周。 4.按下表加入试剂(以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿) 5. 反应3分钟后测OD值。为了实验的准确性，可每间隔2分钟加一管染色液，每间隔2分钟测一管OD值。 如下表。 此图为伯乐酶标仪680，单波长，570nm测得。室温反应三分钟。