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1、实时检测单个活细胞1受肾上腺素刺激后的1AAR运动sh sh jin c wi1A -rn gng y jio c j de yn dngdn q yng shng huCell1更好的翻译建议Xu Ning1*, Liang Zhangyi2*, Xu Ming1, Guan Yinghua2, He Qihua3, Han Qide1,Zhao Xinsheng2*, Zhang Youyi1*1血管医学研究所，北京大学第三医院，并重点分子心血管科学，教育，北京，中国（100083）教育部重点实验室2国家实验室北京分子科学，结构的动态与稳态化学国家重点实验室，化学生物学和化学与分子工程学院
2、，北京大学，北京，中国（100871）3医学分析中心，北京大学，健康科学中心，北京，中国（100083）E-mail：摘要目的：调查运动的1A -肾上腺素受体（1AARs）的激动剂苯肾上腺素（PE）和受体的动态与毫秒，在活细胞中第一个实时活动中激发。方法：标记1AARs使用单克隆抗体和Cy3共轭山羊抗鼠IgG，记录了他们在theliving HEK293A由激动剂苯肾上腺素（PE）刺激细胞运输过程中的轨迹，然后分析了它们的动态特性。结果：1A的具体检测，对市民生活HEK293A表面- 1A条，敷设PE内在的刺激下后，刺激细胞与PE 1A型细胞二十分钟刺激了PE，明显的合作关系定位为1A至敷设，
3、并发现架F -肌动蛋白。40后的PE，在HEK293A近似直线运动轨迹分刺激- 1A型细胞记录，而且他们计算速度。结论：特定标记活细胞表面的方法，提供实时的表面行为实时检测手段方便。通过这种方法，我们能够明确地发现第1A ARS，记录与50ms的暴露在单个活细胞的实时时间行为的受体单个粒子。关键词：肾上腺素能受体;轨道;活细胞绪言膜受体往往发挥的生理和大量关键作用病理生理条件。这些受体的治疗药物的大量目标。可视化和跟踪激动剂刺激受体在活细胞，将有助于了解分子机理受体激活。但是，使用传统的生化技术是很难调查，实时单个活细胞受体的运动，因此它是不够的受体调控的研究。未来的研究，研究了受体贩卖动态特
4、性，不仅将加强在受体细胞功能的理解，而且将有利于为新型药物的设计和改进对广大受体一系列相关待遇的条件。高节奏实时显微镜分辨率相信是在努力造成很大影响，了解蛋白质的功能1。最近，一个或几个分子检测技术已经在生命科学研究方面取得迅速进展。这些技术使我们能够记录实时单个粒子的行为2,3。由于受体的脱敏和内部已在实时成像研究生活在一分钟时间分辨率4细胞，现在的挑战是调查受体运动实时或迅速发生在单个活细胞的活动与动态毫秒的决议。1本工作由国家自然科学基金（20333010，30490172）和NKBRSF（G1999075305）资助。对于这个目标，一个良好的标记方法和检测方法是非常重要的1 -肾上腺素
5、受体国集团成员蛋白偶联受体（G蛋白偶联受体）的家庭。 1 -ARS发挥调解收缩，心脏和血管平滑肌细胞生长反应5了重要作用。独特的3个基因编码受体亚型，第1A -，1B至，和1D -ARS，已经被克隆和药理特点6。根据过去的调查，第1A受体表达不仅在细胞表面，而且在细胞质7。然后，我们标记由一种单克隆抗体标志使用杀伤和Cy3 -共轭山羊抗鼠IgG（Cy3免疫球蛋白）- 1A型ARS，并记录了高节奏的使用高分辨率荧光成像技术对他们的运输过程中的轨迹刺激受体激动剂肾上腺素（PE）。使用这种方法，我们能够明确地发现并记录表面受体的受体与50ms的单个粒子暴露在单一活细胞的实时时间的行为。我们先取得1A
6、的轨迹，敷设内部的实时分析激动剂刺激了它的动力特性，而不是由经典生化技术或扫描分在这项研究中，我们已经制定了标记活细胞表面的受体和跟踪高节奏的使用高分辨率荧光成像技术在单个活细胞的内在受体的方法。这种方法可以提供对机制和受体运输动态特性研究的一些新的见解。钟的时间分辨率激光共聚焦显微镜的使用探讨。材料与方法细胞培养，转染，并选择稳定表达细胞FLAG标记的1A在pDoubleTrouble载体（1A-AR/pDT）机场铁路是由热心提供PE明尼曼教授肯尼思（Emory大学，美国）。人类胚胎肾293A细胞（引领293A）的传播，但有10（5 / 5）胎儿在37牛血清，5CO2的环境中培养液（Invi
7、trogen公司）。 2000年转用脂质体转染试剂（Invitrogen公司）根据制造商的建议，细胞转染1A- 24每小时铁构造细胞稳定表达1A受体被选定的800微克/毫升经G418（Sigma）中1a表达和受体的放射配体结合化验确定为如前所述8。 HEK293A -1A细胞在细胞密度为105镀/毫升，就coverships保持在培养基，10为1-2天前实验胎牛血清。活细胞标记的Cy3偶联山羊抗鼠IgG活细胞孵育3710分钟 抗-FLAG单克隆抗体（12.5g/ml; Sigma）和Cy3 -共轭山羊抗鼠IgG（Cy3 - IgG抗体，3.75g/ml;染料/蛋白3.9; Jackson Im
8、munoResearch）顺序。前荧光实验，细胞的PBS缓冲液（pH 7.4）洗3次。钙反应为了检测HEK293A的聚乙烯反应1A细胞，荧光- 3（分子探针公司）是用来表明用PE钙信号增加。c j。wi le jin cHEK293A de j y x fn ynga1A x bo， yng gung- 3（fn z tn zhn gng s） sh yng li bio mng yngPE gi xn ho zng ji更好的翻译建议细胞的培养基中培养4微米荧光- 3在37，60分钟前实验。洗涤后用PBS 3次，观察细胞的免疫荧光显微镜。 10微米聚乙烯加入作为PE脉冲，同时从荧光荧光- 3
9、检测。该显微镜系统是用来测量荧光- 3荧光这是一样的外延荧光成像，和488 nm激光束（型号163C条，光谱物理），40 目标（北美= 0.6，尼康）和一个分色镜（505nm长通，色度技术）被选中。通过一个五十零分之五百三十五荧光发射波长带通滤波器是由同一CCD所采集。药物治疗研究1A-AR在PE的刺激下，细胞培养中等10微米聚乙烯（Sigma）为实验前20分钟内。PE的浓度保持在整个细胞培养实验。或PE加入观察期间的文化瞬时免疫荧光生活HEK293A -1A细胞培养在3710分钟反旗单克隆抗体（12.5微克/毫升;Sigma）和FITC偶联山羊抗鼠IgG（杰克逊ImmunoResearch）
10、顺序。然后，细胞的培养基中培养10微米聚乙烯（Sigma）20分钟细胞。在此之后，细胞固定为15 4多聚甲醛的PBS分和0.2透性海卫- 100。用PBS洗涤后，细胞培养与鬼笔标记的鬼笔环肽（Sigma为25分钟），然后在Vectashield清洗和安装。图片被收购利用激光共聚焦扫描显微镜。激光共聚焦显微镜 对样品进行了光谱成像的物理与激光扫描共焦显微镜计划，载脂蛋白油浸60倍物镜（莱卡，Wetzlar，德国）。用于收集图像的软件是徕卡TCS的NT版本1.6.587。这些照片被送到一家减少与Adobe Photoshop 4.0（Adobe系统，加州Mountain View）分析的计算机。关
11、于激光设置是恒定的所有实验。然而，无论荧光和鬼笔数字信号，通过调整提高光电倍增管（PMT）。光电倍增管初步的调整使我们能够最大限度地减少背景信号的同时，最大限度地感兴趣的荧光信号。外延荧光成像 细胞兴奋的532纳米激光束（千禧非法入境者，光谱物理），它是反映样本由分色镜（575nm长通，色度技术）。从Cy3荧光发射是由一个100 客观收集（北美= 1.40，石油，尼康）装在一个倒置荧光显微镜（TE300，尼康）。通过四十分之六百五纳米带通滤波器或长通565纳米过滤器（色度技术）的散射光被冻结，Cy3荧光图像背部照亮，帧转移CCD（级联512B，罗佩尔科学取得） 。通过使用的CCD，帧速率只有部
12、分得到提高，同时我们成功地测定高品质的专业服务公司（点扩展函数在50毫秒时间分辨率）。图像采集，存储和显示的执行使用MetaView软件（通用影像公司）和WinView32软件（罗珀科学）。整个观察，在室温下进行。图像分析 每个中1a肾上腺素受体复合物和标记抗体形成衍射极限的形象。每个像素点的数据，至少由一个二维高斯函数拟合广场以获取精确度小于10 nm 10中心值9。整个装置是通过一个用户定义的Matlab程序（MathWorks的公司）。数据分析与统计 所有数据都为平均值扫描电镜至少3个人的实验。与手段比较表演，使用SPSS软件t检验。结果 1A-ARS特别标记的活细胞表面 中1a具体的检
13、测，对市民生活HEK293A表面氩1A细胞从而实现了其主要的单克隆抗体和Cy3使用免疫球蛋白（图1A）。每个中1a肾上腺素受体复合物和标记抗体形成衍射极限的形象。个别地区则是在中1a肾上腺素受体复杂的图像和标识细胞表面抗体，每一个点可能包含不只是一个1A受体。在相同的亮度，初级抗体和非特异性吸附Cy3 - IgG的HEK293A细胞（图1B）及无主抗体，Cy3非特异性吸收抗体在HEK293A -1A细胞（图1C）非常低。不同的荧光强度的直方图，如图所示是一维，初级抗体和Cy3非特异性吸附，跻身中1a-ARS初级标记抗体和Cy3在生活HEK293A IgG的1A细胞特别（红色），IgG的HEK2
14、93A细胞（蓝色）和无主抗体，Cy3非特异性吸收抗体在HEK293A -1A细胞（绿色）（图1D）。因此，通过这种方法，我们可以专门标签的受体活细胞表面。图1 （甲）外膜荧光显微镜显示1A的荧光图像标记特别初级抗体和Cy3 - IgG的生活HEK293A - 1A细胞。 （乙）HEK293A细胞 被选为对照样本。初级抗体和Cy3非特异性吸附抗体很低。 （c）无主抗体，Cy3非特异性吸收抗体非常低HEK293A - 1A细胞。 （四）不同的荧光强度的直方图中的1A，专用标记初级抗体和Cy3 - IgG抗体在活HEK293A - 1A细胞（红色），初级抗体和Cy3非特异性吸附在HEK293A细胞抗
15、体（蓝色）和无主要抗体，Cy3非特异性吸收抗体在HEK293A - 1A细胞（绿色）。对于外延形象，荧光显微镜，比例尺= 5微米。 与抗体标记不影响活动的1A受体 要检查后，抗体中1a标记的生物活性ARS，10微米聚乙烯被添加到标记HEK293A -1A细胞诱导钙的反应是由荧光显示- 3（图2A）。两种钙瞬态特性，钙瞬变幅度+增加（表现为一种荧光比例/背景荧光，F/F0）和钙的速度+瞬态upstroke上升（为每相对荧光强度变化带来的第二，友通），获得了从最初的荧光时间的推移，3全细胞荧光增加。独立实验测定三次分别与每帧20毫秒的曝光时间。 在F/F0标记细胞为1.86 0.15，而细胞的无标
16、记为1.83 0.07（平均值扫描电镜）。标记的细胞和未标记细胞钻石是1.70 0.41和1.88 0.26（平均值 SEM）也分别（图2B）。这些数据表明，与抗体标记不影响活动的1A受体。图2 （一）荧光- 3作为钙的指标，表明了10微米PE钙反应。钙反应的标记细胞之间的连贯性和控制支持，与抗体标记不损害第1A受体的活动。也没有在活细胞内钙的反应HEK293A没有第1A受体。这些数字显示出三个独立的实验。比例尺= 5微米。 （乙）+钙瞬变幅度增加（F/F0）的标记细胞为1.86 0.15，与未标记细胞F/F0为1.83 0.07（平均值扫描电镜）。在每秒（钻石相对荧光强度的变化标记细胞）是1
17、.70 0.41和1.88 0.26（平均值教统局局长）的未标记细胞。 1A-ARS内部受激动剂PE刺激下 随着外在荧光标记方法，我们使用个人HEK293A由外延荧光显微镜1A细胞。PE孵化后20分钟，粒子的部分细胞内出现（图3B）。相反，如果缺乏PE刺激的荧光点，表明1A-ARS留在细胞表面的细胞后，浸泡20分钟，在培养液（图3A）。为了估计对总1A内在的比例ARS，我们计算细胞内荧光点数目诗句在整个景点焦点平面细胞，其中39个单独的试验，从7展出内部编号。中1a的比例在20分钟内化铁为41 14。观察激光共聚焦显微镜，生活HEK293A -1A细胞标记的荧光素标记的抗体（绿色）和F -人与
18、鬼笔标记肌动蛋白-鬼笔（红色）。细胞后，用PE刺激20分钟，明显的共同定位，发现与1A-ARS和F -肌动蛋白（图3c）。 图3 （a）无PE刺激，细胞在培养液孵育20分钟，第1A -ARS对HEK293A表面- 1A细胞依然存在。 （乙）经过20年的10微米聚乙烯，1A条，敷设化民是明显的刺激生活HEK293A - 1A细胞。 （c）合作1A的定位，ARS和肌动蛋白在PE刺激。 10微米的刺激与PE20分钟，明显的共同定位（黄点）之间1A条，敷设发现（绿点）和F -肌动蛋白（红色线），是由激光共聚焦显微镜观察。对于外延形象，荧光显微镜，比例尺= 5微米;和激光共聚焦显微镜图像，比例尺= 1微
19、米。 在单个细胞里面用PE示踪1A-ARs分析1-细胞中铁轨道回应PE提供有关的动态特性和受体的信息传输机制。为了测量位移的1在活细胞中，50毫秒的曝光时间栈帧ARS被选为和7 7的每个像素点有限衍射阵列是安装在一个二维高斯峰，以增加空间定位精度9 。经过40年的10嗯PE，在HEK293A近似直线运动轨迹，1A民刺激（图4）细胞的记录。在Figure4A四个不同颜色的线条代表时指出痕迹荧光点。而在Figure4B箭头所示的代表轨迹开始点。要显示的标记1A位移细节ARS，我们扩大了HEK293A的轨迹图谋，1A细胞（图4，参）。对于所有积极运输的速度轨迹代表1受体轨迹是从0.10m/ s到0.
20、50m/ s，这是在如图4所示。 图4（一）四种不同的轨迹Cy3抗体标记的A至活细胞内铁。四种不同颜色的线条显示的时间痕迹的人指出，在（乙）的箭头发光点。 （乙）外膜荧光1A的形象敷设由Cy3标记特别在现场HEK293A抗体- 1A细胞，四个箭头所示的四个有代表性的轨迹开始点。（参）的四种不同的轨迹放大图（一）。比例尺= 5微米。讨论 主要抗体和第二抗体中已广泛使用的经典生化 如免疫印迹，酶联免疫吸附试验。但是，这种方法已很少用于单个活细胞的研究。在这里，我们制定了标记活细胞内的总标记高达10，在37分钟很短的时间外表面蛋白标记此方法我们成立标志标签是短肽序列（8个氨基酸）到第1A受体胞外域。
21、使用这种标记方法，不仅可以记录的实时受体内在化过程中的运动轨迹，而且中1a分析的动态特性，由聚乙烯刺激ARS。这种方法可以提供对机制和受体运输动态特性研究的一些新的见解。而随着商业化的多种实现形式 ，标记抗体，这种标签膜受体方种非常通用的方法可以普遍适用的膜蛋白。 据了解，气相化学还原信号紧密由细胞蛋白受体脱敏促进和内部11系列规定。在HEK293细胞进行了瞬时转染的1A-AR/GFP早期的研究中，对细胞内荧光强度增加的分析表明，中1a重要内在受体激动剂下PE刺激20分钟后，会出现12。但作者无法区分细胞1A-AR/GFPs的内在受体，因为很难区分泳池内绿色荧光蛋白标记的活细胞外池膜蛋白，因此
22、，国际化进程中1a，不能敷设直接进行调查。而且很难跟踪单个活细胞中绿色荧光蛋白颗粒，因为这对绿色荧光白的荧光强度太弱，无法探测单个绿色荧光蛋白分子。和自动活细胞fluorescenece也增加了绿色荧光蛋白检测单分子的困难。在这里，我们开发了一个用于标记活细胞表面的受体和追踪活细胞内化受体的方法，可以调查有关的受体运动实时或生活迅速发生毫秒细胞与事件的动态信息。该标签仅限于细胞表面蛋白的抗体，因为不通过细胞膜渗透性。通过这种方法，我们能够明确地发现表面受体，它是由钙反应阳性细胞之间的协调和控制的结论是，与抗体标记不损害这种受体的活动。因此，这种具体的标记方法，对生活标签细胞表面可以提供实时的受
23、体的行为实时检测手段方便的受体种类。 此外，使用这种标记方法，我们录得的受体实时化过程中的轨迹。PE孵化后20分钟，在荧光斑点部分细胞内出现（图3B）。相反，如果缺乏PE刺激，1A-ARS留在细胞表面，即使20分钟后，细胞培养液中浸泡（图3A）。中1a的比例在20分钟内化铁为41 14（平均标准差）。这一结果是一个比以上12提到Chalothorn的研究略高于。两者之间的区别实验可以解释不同的标记方法。 1A-ARS本地化细胞表面的细胞内，而且7不但。的内在1A-AR/GFP无法区分从细胞或新生产的先前的研究1A-AR/GFP。因此，新生产的1A-AR/GFP和1A-AR/GFP运往膜可能中断
24、化量的检测。相反，外在我们所使用的标记可避免细胞内1A影响ARS，减少从细胞新陈代谢2干预。 分析1-细胞中铁轨道回应PE提供有关信息的动态特性，我们甚至可以研究受体传输机制。 10微米的刺激与PE20分钟，明显的合作关系定位为1A至ARS和F -肌动蛋白，发现是由激光共聚焦显微镜观察（图3c）。这表明，中1a化，ARS是密切相关的细胞骨架。经过40年的10嗯PE，在HEK293A近似直线运动轨迹分刺激1A细胞记录。我们可以计算速度的代表1受体轨迹是从0.10至0.50m人/秒因此，使用这种标记方法，不仅可以记录的实时受体内在化过程中的运动轨迹，而且中1a分析的动态特性，ARS。在这项研究，我
25、们第一次得到了经典生化技术或扫描分钟的时间分辨率激光共聚焦显微镜使用1A的轨迹，敷设内部的实时激动剂刺激，这是很难探索。 最后，对生活的特定标记细胞表面的方法，提供实时的表面受体的行为实时检测带来很大的方便。通过这种方法，我们能够明确地发现第1A -ARS，记录与50ms的暴露在单个活细胞的实时时间行为的受体单个粒子，并分析了其动态特性。这方面的工作可以进入机制和受体运输动态特性研究的一些新的见解。 鸣谢这项工作得到了国家自然科学基金（20333010，30490172）和NKBRSF赠款（G1999075305）参考1 Weiss S. Fluorescence spectroscopy o
26、f single biomolecules. Science 1999; 283:16671695.2 Seisenberger G, Ried MU, Endress T, Buning H, Hallek M, Brauchle C. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science 2001;294:1929-1932.3 Lakadamyali M., Rust MJ, Babcock HP, Zhuang X. Visualizing inf
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28、ion of alpha 1aAR splice variants. J Biol Chem 2003;277:9570-9579.5 Piascik MT, Perez DM. Alpha1-adrenergic receptors: new insights and directions. J Pharmacol Exp Ther 2001;298:403-410.6 Graham RM, Perez DM, Hwa J, Piascik MT. alpha 1-adrenergic receptor subtypes. Molecular structure, function, and
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