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1、黄曲霉毒素B1检测试剂Aflatoxin B1RIDASCREEN Aflatoxin B1酶标免疫分析定量测定黄曲霉毒素B1试剂盒。德国公司R-Biopharm制造（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15（产品编号：R1211）简介 采用竞争酶标免疫法定量测定谷物，饲料，花生，干果及其它食品中的黄曲霉毒素B1。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。样品制备谷物/饲料：粉碎，甲醇/水提取，过滤，稀释时间要求：（以10个样品为例）谷物/饲料.大约30分钟测试时间
2、.大约1小时（与样品数量多少无关）检测下限 1ppb回收率 80-100%交叉反应Aflatoxin B1.100%Aflatoxin G1.大约29%Aflatoxin B2.大约13%Aflatoxin G2大约3.2%Aflatoxin M1大约1.5%1. 用途Aflatoxin B1 30/15竞争酶标免疫法定量测定谷物，饲料中的黄曲霉毒素B1。2. 概要黄曲霉毒素主要是两种霉菌Aspergillus flavus 及 A.paraticus的二级代谢物。这些霉菌在湿热的环境和耕作土地上污染的植物产生。黄曲霉毒素B1属于自然最强烈的致癌物质。黄曲霉毒素B1作为毒性最高的的分析物，它一
3、般产生于玉米，花生，巴西坚果和棉花种子中。鉴于这种霉菌毒素的毒性，欧洲国家做出了相近的限量，对黄曲霉毒素B1的限量为2ppb，对黄曲霉毒素总量的限量为4ppb。使用RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15检测试剂盒，能够快速而准确的检测谷物，饲料和其他食品中的黄曲霉毒素B1。3. 测定原理测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1抗体的捕捉抗体。加入标准或样品溶液、黄曲霉毒素酶标记物和黄曲霉毒素抗体。游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争结合黄曲霉毒素抗体，同时黄曲霉毒素抗体与固定在板孔的捕捉抗体相连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质/发色剂加入
4、到孔中并且孵育。结合的酶标记物将微红色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量，吸光值与样品中的浓度成反比。4. 提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔）盒中的材料如下196孔板（12条 X 8孔）包被有捕捉抗体6黄曲霉毒素B1标准液，1.3 ml/瓶浓度为：0ppb，1ppb， 5ppb，10ppb，20ppb，50ppb黄曲霉毒素B1的甲醇/水溶液1酶标记物（6ml）.红色帽过氧化物酶标记物的黄曲霉毒素B11黄曲霉B1抗体（6ml）黑色帽1基质/发色剂（10ml）.棕色帽1反应停止液（14ml）. 黄色帽为1N硫酸1洗涤缓
5、冲液为10Mm的磷酸缓冲液（pH7.4），包含0.05%的Tween20* 样品的10倍稀释倍数已经考虑，因此，样品中黄曲霉B1的浓度可以直接在标准曲线读取。5. 需要的材料但盒中不提供5.1设备-微孔板酶标仪(450nm)定量分析用-100ml量筒-样品提取用玻璃器皿：漏斗、50ml容量瓶-粉碎机-振荡器-Whatman NO.1或相当的滤纸-50ul，100ul，1000ul微量加样器5.2 试剂-甲醇-70%甲醇溶液：准备70%甲醇溶液，70ml甲醇与30ml蒸馏水混合。-蒸馏水或去离子水6. 操作者应该注意之事项-标准液含有黄曲霉毒素B1，要特别小心，应戴手套，避免试剂接触皮肤-使用过
6、的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜-反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤-不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起 灵敏度的降低-不要交换使用不同批号的盒中试剂7. 储存条件-保存试剂盒于2-80C。不要冷冻-将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封-标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下-基质/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下8. 试剂变质的迹象红的基质/发色试剂若显蓝色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm0.6)时，表示试剂可能变质。9. 样品处理 样品应当在阴凉避光之处保存在分析前将代
7、表性的样品粉碎，彻底混均-称取5g 粉碎的样品于适当容器中，加入25ml 70%甲醇溶液-强力振荡3分钟（用手或振荡器）-用Whatman NO.1或相当的滤纸进行过滤-取1ml滤液加入1ml蒸馏水稀释-取50ul稀释液用于试剂盒分析*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加 （例如：样品10g+50ml 70%甲醇溶液）花生等含脂肪较高的样品：样品去皮粉碎，取5.0g样品，加入25.0ml甲醇水（7+3）溶液和20ml石油醚，振荡10分钟，用滤纸过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，取1ml样品提取液，用1ml蒸馏水或是去离子水稀释，取50ul稀释液进
8、行分析。食用油：称5.0g油样品于25ml小烧杯中，用20ml石油醚（或者正己烷）分次将试样转移到125ml分液漏斗中，准确加入25.0ml甲醇水（7+3）溶液，加塞振摇5分钟，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，取1ml样品提取液，用1ml蒸馏水或者去离子水稀释，取50ul稀释液进行分析。注意如果样品中黄曲酶毒素的浓度比预计的浓度高，样品需要进一步稀释。请注意加入到微孔中分析的样品必须是比例为35/65的甲醇/水溶液。10. 酶标免疫分析程序10.1测定之前注意事项1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25）。2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8。 3. 在使用中不要让微孔
9、干燥。4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。10.2包被有抗体的微孔板条锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻.10.3标准液黄曲霉毒素B1标准液直接应用，样品的10倍稀释倍数已经被考虑，因此，样品的黄曲霉B1的浓度可以直接在标准曲线读取。10.4 洗涤缓冲液在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂，一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中，制备好的洗涤缓冲液在4oC条件下保
10、存4周。方法二：将小袋里粉剂只用100ml蒸馏水溶解得到一个10倍的缓冲液浓缩液。此溶液在室温（20-25C）下，可保存8周。使用时，1倍的浓缩液+9倍的蒸馏水稀释即可得到待用的洗涤缓冲液10.5测定程序 （在20-25 oC条件下操作）1将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。2.加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。3.加入50ul酶标记物（红色帽）到微孔底部。4.加入50ul黄曲霉抗体（黑色帽）到微孔底部，轻轻地在桌面振摆酶标板，使之混合。在室温（20-25 oC）孵育30（+/-1）分钟5.倒出孔中的
11、液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。6.加入100ul基质/发色试剂（棕色帽）到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15（+/-1）分钟。7.加入100ul反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，15分钟内读取光度值。11. 结果所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。标准的吸光度值（或样品）-x 100= %吸光度值0标准的吸光度值计算的标准值绘成为一个以黄曲
12、霉毒素B1浓度（ng/kg）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在5-20ppb范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。12 灵敏度RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15试剂盒的最低检测下限为大约1ppb13 特异性RIDASCREEN黄曲霉毒素B1试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到：Aflatoxin B1.100%Aflatoxin G1大约29%Aflatoxin B2.大约13%Aflatoxin G2.大约3.2%Aflatoxin M1.大约1.5%14. 再现性由三个不同的实验结果确定了室内精密度，图2显示出RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数(%CV)对相应黄曲霉毒素B1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。15. 回收率谷物类样品黄曲霉毒素B1的回收率80-100%，平均变异系数大约为8%16. 参考文献见试剂盒中提供的英文原版说明书。