《黄酮纯化.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《黄酮纯化.doc（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、1.1.1.1.重结晶法重结晶法重结晶法重结晶法 重结晶法利用黄酮类化合物不溶于酸，易溶于碱水、乙醇和丙酮的性质，将黄酮类化合物分离和纯化。多次重结晶可以获得较高纯度的黄酮类化合物2。 2.2.2.2.薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法 21制备型薄层色谱法(PTLC) 制备型薄层色谱法具有操作简单、用时少、分离效果好等特点，可以得到毫克级的物质，一直是分离微量天然药物不可或缺的方法。陈欣安等3利用制备型薄层色谱法，以硅胶HCMC为薄层板。以氯仿丙酮醋酸和甲苯氯仿丙酮两种三元展开剂双向展开的方式，从鱼藤中分离出了9种异黄酮类化合物。刘玉红等4对聚酰胺柱层析得到的黄酮类化合物组分进行硅胶G
2、GGGFFFF254254254254 薄层板(100 mmx200 mm)层析，加点数次层析后刮下并合并比移值相同的物质。用乙醇溶解洗脱，得到各组分的溶液后，以HPLC鉴定由薄层层析得到的样品已经达到色谱纯的要求，可以用于结构鉴定。 22高效薄层色谱法（HPTLC） 该法可用于混合物的分离、定性及定量分析，与薄层色谱相比，主要是因为支持剂的改进，而具有了展开时间短、所需样品少、分辨率高等特点，且具有较好的光学活性。王克勤等5采用G60高效硅胶板，以氯仿甲醇水(1800：230：035)为展开剂，芹菜素标样和试样有相同的比移值065；用最小二乘法作线性回归，芹菜素含量与斑点峰面积的标准曲线回归
3、方程：Y= 15 138X+7 5948，r= 0993，线性范围：0332-0996g斑点。精密度实验RSD=1. 33(n=5)，平均回收率达到9782。 3.3.3.3.柱色谱分离法柱色谱分离法柱色谱分离法柱色谱分离法 31硅胶柱色谱 该法以硅胶为吸附剂，是一种较为广泛的分离方法。可用于分离二氢黄酮，二氢黄酮醇和高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇等。加水活化后可用于分离多羟基黄酮醇及其苷类等极性较大的化合物。通常使用的洗脱剂主要有：乙酸乙酯石油醚，氯仿甲醇，石油醚丙酮。可用氯仿甲醇水或乙酸乙酯丙酮水作流动相来分离黄酮苷，以氯仿甲醇为流动相来分离酮苷元。应注意的是硅胶中含有微量金属离子，可用
4、浓盐酸预先处理。另外，甲醇可溶解部分硅胶，要注意调整甲醇比例及分出物质后的处理问题。梁鸿等6从北柴胡根醇提物中取正丁醇萃取物，经硅胶(200300目)干柱层析，以氯仿甲醇水(65：30：10)进行洗脱，经纯化后得到8 g黄酮类化合物。姜红芳等7从毫菊花纯提物中取正丁醇萃取物30 g，拌以等量硅胶，装入600 g(160200目)硅胶柱内，以石油醚乙酸乙酯(3：1、1：1、1：4)梯度洗脱，得到三个黄酮类化合物。 32聚酰胺柱色谱 聚酰胺是一种最常用于分离黄酮类化合物的吸附剂，具有吸附量大、分离效果好等特点。聚酰胺通过与黄酮类化合物形成氢键，化合物酚羟基越多，吸附的程度越强，从而根据吸附作用的强
5、弱进行分离。另外聚酰胺的吸附能力还与溶剂有关.在水中形成氢键的能力最强，有机溶剂中较弱。在含水系统中类似于反相分配，非水系统中类似于正相分配。所以，聚酰胺分离黄酮类化合物时，用含水流动相时对苷元的吸附能力较强。有机溶剂流动相中，对苷吸附能力较强。杨海艳等8用正丁醇、乙酸乙酯、乙醚分别对川楝水溶液中萃取，取正丁醇部萃取物，采用聚酰胺(6090目)柱层析反复层析，以乙醇水梯度洗脱，主33葡聚糖凝胶柱色谱 葡聚糖凝胶可以根据分子的大小对化合物进行分离，常用的有Sephadex G型和Sephadex LH20两种。分离黄酮苷时可以起到分子筛的作用，分子量越大的越先分离出去。分离苷元时，根据酚羟基的多
6、少而分离，越少的越先分离出去。常用的有机溶剂系统有：醇和醇水，水及水的酸、碱液，氯仿甲醇等9。以上是三种最常用的分离黄酮类化合物的柱色谱分离方法可以相互结合起来使用。王红燕等10运用上述三种柱色谱法从黄芩茎叶中分离得到白杨素、红花素、异红花素等七种黄酮类化合物，日本学者运用硅胶柱色谱和聚酰谱从黄芩中分离得到三种黄酮类化合物11。 34大孔树脂色谱 大孔树脂是一种吸附性与分子筛性相结合的分离材料。被分离的物质根据其分子的大小以及与树脂形成氢键及范德华力作用的大小而被分离。大孔树脂稳定性高、吸附选择性独特、耐腐蚀、再生简便、解吸条件温和，使用周期长、可重复使用；选择性好，易于分离极性不同的物质；避
7、免了用有机溶剂分离而造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点；分离得到的产物具有良好的化学纯度；操作条件温和，不易破坏物质的性能，能耗低，操作简单方便，易于工业化12。周嫒等13采用大孔树脂D101柱层析，分别以40、70 、100乙醇一水的体系进行洗脱，从虎杖醇提物中得到了黄酮类物质-葡萄糖苷酶抑制剂。 丁彩丽等14采用6种大孔吸附树脂，比较其对款冬花总黄酮的吸附量、解吸率及吸附动力学特性，筛选出较优的款冬花黄酮吸附树脂。陆英等15用大孔树脂分离纯化鼠曲草中黄酮类化合物。王婷婷等16研究了AB-8和H103两种大孔吸附树脂对丰城鸡血藤总黄酮的吸附特性，筛选出适合丰
8、城鸡血藤总黄酮分离纯化的树脂，并对其进行了动态吸附特性研究。 4.4.4.4.高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)(HPLC)(HPLC) 高效液相色谱已经广泛应用于天然化合物的分离纯化手段其柱效高、分离迅速是分离纯化不可缺少的方法。HPLC与纸色谱、柱色谱、薄层色谱的分离效果相比，效果均后者比理想。更多的是制备型的HPLC在中草药有效成分分离上应用较广且比分析型的进样量大，更适于分离。田娜等17采用高效制备液相色谱法从荷叶中制备分离荷叶黄酮类化合物。用60乙醇回流提取荷叶，粗提液浓缩后经大孔树脂D101柱及聚酰胺柱色谱分离，再在CCCC181818
9、18 柱上分离，以水乙腈为流动相进行梯度洗脱，得到了三种黄酮类化合物。经分析确定该三种物质分别为金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷。所制备的三种化合物的纯度都在97以上。 5.5.5.5.高速逆流色高速逆流色高速逆流色高速逆流色谱法谱法谱法谱法(HSCCC)(HSCCC)(HSCCC)(HSCCC) 高效逆流色谱法是一种新的分离技术，主要具有两大优点：分离量较大，分离效率较高，一次进样可达几十毫升，一次可分离近10 g样品；不需要载体作为固定相，避免了载体对样品的不可逆吸附，造成样品的损失。陈四平等18运用高效逆流色谱法，从黄芩茎叶中分离出了7-O-D葡萄糖醛酸苷。李彩侠等19运用HSCCC分离纯化
10、荷叶中的黄酮类化合物。TLC分析、颜色反应鉴定得到的分离物纯度很高。 6.6.6.6.液滴逆流色谱法液滴逆流色谱法液滴逆流色谱法液滴逆流色谱法(DCCC)(DCCC)(DCCC)(DCCC) 原理：化合物在两相溶剂中的溶解度不同而实现的分离具有上样量大、分离快、损失少等特点。该方法可用于黄酮苷类化合物的分离，常用溶剂体系有氯仿甲醇水、氯仿甲醇丙醇水等。在分离异东方蓼黄素-3-O -葡萄糖苷、芦丁和异东方蓼黄素时，使用水层作移动相。结果双糖苷先于单糖苷流出。对极性较小的黄酮，则宜用氯仿甲醇水(7：13：8)系统。如从墨西哥的一种药用植物黄钟花中得到纯苷。经鉴定为异槲皮素(槲皮素-3-O-葡萄糖苷
11、)，采用正丁醇醋酸水(4：1：5)作移动相。 7.7.7.7.络合沉淀法络合沉淀法络合沉淀法络合沉淀法 具有邻位羟基、邻二酚羟基、邻位羰基结构的黄酮类化合物与镁、铝、铅等金属形成络合物，而与其他物质分开，加酸可还原。如果所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质过滤除去。再向滤液中加碱式乙酸铅。可使其他黄酮类化合物沉淀析出。近年来，在用铅盐沉淀法不理想的情况下，可用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作沉淀剂PVP与酚羟基形成氢键的最合适条件是pH值为35的110甲醇水溶液。马慧萍等20采用铅盐沉淀法对淫羊藿黄酮进行分离，将提取液浓缩后，加入醋酸铅溶液，放置，至无沉淀发生为止，抽滤，冲洗沉淀数次后，将沉淀置于70乙醇中，加硫酸进行脱铅、过滤、滤液减压浓缩、真空干燥，收率为2321，收率较低。 8.8.8.8.萃取黄酮类化合物中有酚羟基的取代而显酸性，由于羟基的数目和位置不同，酸性强弱也不同，利用这一特性，可以将植物提取的总黄酮溶于有机溶剂中，分别按弱碱至强碱，由稀碱到浓碱的水溶液的顺序进行梯度萃取，就可以将黄酮从强酸性至弱酸性的顺序中萃取出来。比如将黄酮类化合物的混合物溶于有机溶剂乙醚后，依次用5NaHCO 、5Na2CO，、02NaOH、5NaOH碱性水溶液分别萃取，可依次萃取出7，4-二羟基黄酮、7-羟基黄酮或4-羟基黄酮、一般酚羟基黄酮、5-羟基黄酮。