《病学总论》PPT课件.ppt

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1、第二篇 病毒学,第22章 病毒的基本性状 第23章 病毒的感染与免疫 第24章 病毒感染的检查方法与防治原则 第25章 呼吸道病毒 第26章 肠道病毒 第27章 急性胃肠炎病毒 第28章 肝炎病毒 第29章 虫媒病毒 第30章 出血热病毒 第31章 疱疹病毒 第32章 反转录病毒 第33章 其他病毒 第34章 朊粒 杨 娥 ,第22章 病毒的基本性状,病毒(Virus),微小 简单 一种核酸 活细胞内寄生 复制 非细胞型微生物,病毒与人类关系非常密切：,人类传染病75%由病毒引起 有些病毒传染性极强，流行很广，有效药物少，可引起世界大流行； 有些病毒可引起持续性感染；病后可出现后遗症； 与某些

2、肿瘤和自身免疫性疾病发生密切相关； 流行广泛，新的病毒还不断地被发现。,第一节 病毒的大小与形态,大小：以纳米（nm）作为计量单位 20300nm，可通过滤菌器。 观察工具：电子显微镜,病毒的形态：多样化,病毒体：指结构完整、并具有感染性的成熟病毒颗粒。 基本形态有五种。 球形（近似球形） 如人类及动物病毒 杆形（丝状） 如植物病毒 弹形 如狂犬病毒 砖形 如痘病毒 蝌蚪形 如细菌病毒（噬菌体）,砖形 （痘病毒）,子弹形 （狂犬病病毒）,蝌蚪形 （噬菌体）,杆状 （烟草花叶病毒）,第二节 病毒的结构与化学组成,一、病毒的结构, 基本结构 辅助结构,病毒体结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,

3、核衣壳,包膜,包膜病毒,包膜子粒,一、病毒的结构,（一）核衣壳 nucleocapsid 病毒体基本结构, 由核心和衣壳构成核衣壳。 有些病毒还有包膜。 有包膜的病毒称为包膜病毒， 无包膜的病毒体称为裸露病毒。,核衣壳-核心（ core ）,成分：核酸+功能蛋白 分类 dsDNA ssDNA dsRNA (+)ssRNA (-)ssRNA 功能：携带遗传信息，控制生命特征。 决定病毒的特性 病毒复制 具有感染性,核衣壳衣壳（capsid）,核衣壳衣壳（capsid）,成分：壳粒-蛋白质 对称型结构： 20面体立体对称 螺旋对称 复合对称 功能： 保护病毒核酸 参与感染过程 具有抗原性 衣壳所含

4、壳粒数目及对称方式不同，可作为病毒鉴别和分类的依据。,二十面体立体对称,螺旋对称,复合对称,包膜 （envelope）,包膜,核酸,基质蛋白,糖蛋白,包膜,刺突,包膜 （envelope）,成分 脂质层：脂质+少量糖类，对脂溶剂敏感 刺突层：病毒糖蛋白、刺突 spike 功能 具有抗原性，构成病毒的表面抗原 具有与宿主细胞膜亲和及融合的性能，参与入侵与感染 保护核衣壳 包膜的有无可作为鉴定病毒的依据。,病毒的结构,核心,衣 壳,包 膜 Envelope,核 衣 壳 Nucleocapsid,病毒颗粒 Virion,刺 突,病毒的结构 基本结构 辅助结构,核衣壳,核酸 （DNA/RNA),衣壳

5、(蛋白质）,壳粒,螺旋对称,立体对称,复合对称,核心：核酸（基因组genome）决定病毒遗传、变异和复制 壳粒capsomere: 衣壳capsid 保护、介导、抗原性 包膜envelope，包膜子粒peplomere:（刺突spike） 保护、介导、抗原性,存在形式多样 大小悬殊(5400 Kb) 重叠基因，具有真核基因的特点 复制方式多样 部分核酸具有感染性,线状、环状,1病毒核酸,二、病毒的化学组成与功能,结构蛋白 组成病毒体的成分 衣壳蛋白多肽亚单位，有良好的抗原性 包膜蛋白糖蛋白 基质蛋白连接衣壳蛋白与包膜蛋白的部分， 有跨膜及锚定功能区（M基质蛋白） 非结构蛋白 病毒内酶（药物作用

6、的靶位） 感染细胞内特殊功能蛋白（抑制宿主细胞）,2病毒蛋白质：,3脂类和糖 主要存在包膜中。 功能 维护病毒体结构的完整性,第三节 病毒的增殖,特点： 必须在易感的活细胞内进行。由宿主细胞提供病毒缺乏的酶系统、能量及原料等物质条件。 以自我复制方式进行。以病毒基因为模板复制出子代病毒基因。,（一）复制周期,从病毒进入宿主细胞开始，经基因组复制，到最后释放出子代病毒，称为一个复制周期。 吸附(Adsorption) 穿入(Penetration) 脱壳(Uncoating) 生物合成(Biosynthesis) 装配与释放(Assembly and Release),吸附,穿入,生物合成,组装

7、与成熟,释放,1吸附 先吸附易感细胞方可穿入 （1）静电结合 先接触，随机、可逆。 （2）再吸附 宿主细胞表面特异受体与V体表面配体位点的结合，特异,不可逆。 2穿入： (1)吞饮进入 无包膜V； (2)融合进入 有包膜V； (3)核酸直接进入 噬菌体。,3脱壳：病毒核衣壳进入细胞，经蛋白酶降解衣壳，核酸游离并进入细胞的一定部位。 4生物合成：早期基因转录、翻译，产生必须的复制酶和非结构蛋白(早期蛋白）；然后开始病毒核酸的复制，并转录、翻译产生病毒结构蛋白（晚期蛋白）。,6大类型： 双链DNA病毒 单链DNA病毒 正单链RNA病毒 负单链RNA病毒 双链RNA病毒 逆转录病毒 区域：DNA病毒

8、 核内（除痘病毒） RNA病毒 胞质（除流感病毒和部分副粘病毒）,生物大分子的合成,双链DNA病毒：细胞核内合成DNA，胞质中合成病毒蛋白。,5组装、成熟与释放： 病毒种类不同，核酸、蛋白质在细胞内组装的 部位和方式不同 (1) DNA病毒 大多在细胞核内组装；痘病毒除外 RNA病毒 大多在细胞质内组装； (2) 裸露病毒装配成核衣壳为成熟的病毒体; 包膜病毒须包有细胞膜或核膜方为成熟的病毒体 (3) 释放方式： 包膜病毒出芽释放 裸露病毒破胞释放,逆转录病毒复制示意图,（二）异常增殖与干扰现象,1病毒的异常增殖,（1）顿挫感染 abortive infection 由于宿主细胞提供条件不足，

9、导致进入的病毒不能完成复制周期,使得感染中断,称为顿挫感染。 该细胞称为该病毒的非容纳细胞。 （2）缺陷病毒 defective infection 由于基因组不完整或因某一基因位点改变，不能复制出完整有感染性病毒颗粒的病毒称为缺陷病毒 该病毒在复制时，需要伴随着另一种病毒以弥补缺陷病毒的不足，使之增殖出完整的病毒体。这种有辅助作用的病毒被称为辅助病毒。,缺陷病毒HDV,2干扰现象 interference,定义：两种病毒感染同一种细胞时，常发生一种V抑制另一种V复制的现象，称为干扰现象。 类型：异种V间干扰；同种V间干扰 同型V间干扰；同株V间干扰(自身干扰) 机理： (1)干扰素产生； (

10、2)竞争干扰：第一种V破坏细胞表面受体或改变细胞代谢途径，阻碍另一种V的侵入和转译； (3)缺陷干扰颗粒(DIP)：产生缺陷病毒不能复制，却能干扰同种成熟病毒体进入细胞，称为DIP。,（3）干扰现象的医学意义：, 干扰现象能阻止、中断发病，也可以使感染终止，导致宿主康复，是机体非特异性免疫的一个重要组成部分。 在使用疫苗预防病毒性疾病时，要注意疫苗病毒间的干扰和与野病毒之间的干扰，避免影响疫苗的免疫效果。,第四节 病毒的遗传与变异,病毒的基因组较简单 互相重叠 有内含子,病毒株 病毒型别 由抗体进行血清学分型 病毒准株群体中的个体差异 病毒变异体(表型) 病毒突变体,一、基因突变,病毒在增殖过

11、程中常发生基因组碱基序列置换、缺失或插入，引起基因突变。由基因突变而导致病毒表型性状改变的毒株称为突变株。10-410-8,1条件致死性突变株 只能在某种条件下增殖，而在另一种条件下不能增殖的病毒株。 例：温度敏感突变株(Ts)：也称条件致死性突变株 低温28-35(容纳性温度)复制增殖 高温3740(非容纳性温度)死亡。 例如：小儿麻痹糖丸 2缺陷型干扰突变株（DIM） 因病毒基因组中碱基缺失突变引起，其特点： （1）不能单独复制，必须在辅助病毒（通常是野毒株）存在时才能复制； （2）与某些慢性疾病的发病机制有关。,3宿主范围突变株（hr突变株） 指病毒基因组的改变，影响了对宿主细胞的感染范

12、围，突变株可感染野生型毒株不能感染的细胞，用于制备减毒疫苗，如狂犬疫苗 4耐药突变株 因病毒酶基因的突变使药物作用的靶酶特性改变，使病毒对药物不敏感。,二、基因重组与重配,重组recombination：几种有亲缘关系的病毒在感染同一细胞时，经相互作用后可发生基因重组。重组时病毒核酸则通过分子断裂交叉连接，使核酸分子内部重新排列。 重配reassortment：分节段的RNA病毒基因组之间（如流感病毒），可通过基因片段的交换，使子代基因组发生突变，这种过程称为重配。发生率高于重组。,三、基因整合 integration,指病毒基因组与宿主细胞基因组发生重组，称为整合。 既可引起病毒基因的变异，

13、也可引起宿主细胞染色体基因的改变肿瘤的发生。,四、病毒基因产物的相互作用,1. 互补作用和加强作用 两种病毒感染同一细胞时，其中一种病毒的基因产物促使另一病毒增殖。 2.表型混合与核壳转移 性状不稳定 两种以上病毒感染同一细胞时： 两种衣壳和胞膜互相交换，形成镶嵌的胞膜和衣壳，仅基因产物发生交换表型混合； 无包膜发生的表型混合核壳转移。 应通过传代确定新性状的稳定性，区分是基因重组还是表型混合。,病毒遗传变异的生物学意义,在研究病毒致病性中的作用最保守序列 在诊断病毒性疾病中的应用芯片技术 在治疗病毒性疾病中的应用靶向药物 在预防病毒感染中的应用疫苗设计 在基因工程中的应用病毒载体 在遗传学基

14、础理论研究中的作用,第五节 理化因素对病毒的影响, 破坏病毒胞膜； 蛋白变性； 损伤核酸 一、物理因素 1. 温度：多耐冷不耐热； 2. pH：多在pH5-9的范围内，比较稳定； 3. 射线和紫外线：射线：致死性灭活； 紫外线：灭活后可复活 (光复活)。 二、化学因素 1.脂溶剂：有包膜病毒敏感，乙醚作用最佳； 2.酚类：蛋白变性； 3.氧化剂、卤素及其化合物：病毒都很敏 4.抗生素与中草药： 抗生素：无作用； 中草药：有一定的抑制作用；,第六节 病毒的分类,目，科，亚科，属，种 分类的依据 1核酸类型与结构（DNA或RNA，单链或双链、分子量、基因数） 2病毒体的形状和大小； 3衣壳对称性和

15、壳粒数目； 4有无包膜； 5. 抗原性； 6. 生物学特性（繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）。,亚病毒(subvirus) 1类病毒(viroid) 植物病毒，单链杆状RNA分子，仅由250-400个核苷酸组成，无包膜或衣壳。 细胞核内增殖，利用宿主细胞RNA多聚酶复制； 对核酸酶敏感，对热、有机溶剂抵抗力强； 2卫星病毒(satellites) 植物病毒 (1)可编码自身衣壳蛋白。 (2)拟病毒(Virusoid)： 由500-2000个核苷酸组成，单链RNA分子。 需利用其蛋白衣壳。 与辅助病毒关系 基因无同源性。 干扰其增殖。,3朊粒(prion)： 蛋白侵染子，直径25nm，长1

16、00-200nm的 杆状蛋白、无核酸。 特点：(1)具有传染性。 (2)潜伏期较长。 (3)对理化作用抵抗力强。 在人和动物中引起致死性中枢神经系统 慢性退化性疾病：人克雅氏病，库鲁病。,思考题 1 名词解释： virion （病毒体）virus （病毒） defective virus（缺陷病毒） abortive infection(顿挫感染) interference（干扰现象） 2简答题 （1）举例简述病毒的形态。 （2）简述病毒的基本结构。 （3）简述病毒的复制周期。 （4）简述理化因素对病毒的影响。 （5）简述病毒的增殖特点。 3论述题： （1）试述病毒的结构、化学组成及其生物学功

17、能。 （2）与原核细胞型微生物相比，病毒的基因组有哪些特点,第23章 病毒的感染与免疫 病毒感染：指病毒侵入机体，在易感组织细胞内复制增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染(viral infection)。可引起局部和全身不同程度的病变。 病毒性疾病：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病(viral disease)。 有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。,病毒感染三要素 病毒的致病性 机体的感受性：种属特异性； 后天获得的免疫状况； 环境因素：社会因素、自然环境因素；,第一节 病毒的致病作用 一、病毒感染的 传播方式,一、病毒感染的传播

18、方式 1.水平传播(horizontal transmission) 病毒在人群中不同个体之间的传播，或从动物到动物再到人的传播所导致的感染。 (1)呼吸道：吸入，流感V、腮腺炎V。 (2)消化道：食入，甲肝V、脊灰V。 (3)泌尿生殖道：接触，HSV-，HIV。 (4)皮肤损伤：叮咬、注射，乙脑V，乙肝V。 有些病毒仅引起局部感染，有些则通过病毒血症引起全身感染。,2.垂直传播(vertical transmission) 指病毒通过胎盘或产道，由亲代传给子代的方式。 (1)经胎盘：乙肝V、风疹V、CMV、HIV等。 结果：流产、死胎、先天感染或畸形 (2)经产道：HSV-，乙肝V等 常见的

19、与胎儿先天性感染有关的病毒： 风疹病毒；CMV；HSV；HIV；HBV,感染过程与结局： 局部感染：病毒入侵部位增殖局部疾病 如：鼻病毒，普通感冒； 轮状病毒，腹泻； 全身感染：病毒血、淋巴系统、N系统 靶器官涉及全身或多种组织与器官， 引起功能障碍。 如麻疹病毒。,二、病毒感染的致病机制,1. 杀细胞效应(cytocidal effect) 病毒在宿主细胞内复制完毕，可在很短时间内一次释放大量子代病毒，细胞被裂解死亡。多见无包膜、杀伤性强的病毒 如脊髓灰质炎病毒。,1. 杀细胞效应(cytocidal effect) 机制：(1)阻断细胞核酸与蛋白质合成 (2)引起细胞溶酶体释放水解酶 (3

20、)病毒蛋白的毒性作用 (4)细胞的细胞器受损。 临床表现：对组织细胞破坏严重，往往引起明显的病理生理变化，多数为急性感染。,细胞病变作用（CPE） 在体外培养的细胞中,接种杀细胞性病毒后，经一段时间可在显微镜下观察到细胞变圆、堆积、坏死、从瓶壁脱落等现象。,A.正常细胞,B. CPE细胞,2. 稳定状态感染(steady state infection) 病毒在宿主细胞内复制后，不引起细胞裂解死亡。多见有包膜病毒，常以出芽方式释放子代病毒，对细胞损伤较慢，如流感病毒。,2. 稳定状态感染(steady state infection) (1)细胞融合：感染细胞与邻近细胞融合，有利于病毒扩散；形

21、成多核巨细胞。 (2) 细胞表面出现病毒基因编码的抗原： 流感病毒细胞表面 血凝素红细胞吸附,红细胞吸附,3. 包涵体形成 某些受病毒感染的细胞内，用普通光学显微镜可看到有与正常细胞结构和着色不同的圆形或椭圆形斑块，称为包涵体(inclusion body)， 可作为诊断依据。 本质： 病毒颗粒的聚集； 病毒增殖留下的痕迹； 病毒感染引起的细胞反应物。,海马神经元内基小体 (LM H-E染色 嗜酸性 高倍 ),内基小体,激发,细胞,4细胞凋亡 是一种由基因控制的程序性细胞死亡，属正常的生物学现象。,5基因的整合与细胞转化 某些DNA病毒和反转录病毒在感染中可将基因整合于宿主细胞染色体基因组中，

22、导致细胞转化，增殖变快，失去细胞间接触抑制。 细胞转化也可由病毒蛋白诱导发生，与肿瘤形成 密切相关。,（二）病毒感染的免疫病理作用 1抗体介导的免疫病理作用 2细胞介导的免疫病理作用 CTL杀伤靶细胞，造成组织器官损害，即型超敏反应。 失去对自身和异已抗原的识别功能自身免疫病； 3. 致炎性细胞因子的病理作用 INF-r、TNF-a、IL-1等细胞因子大量产生，可导致代谢紊乱； 4.免疫抑制作用 某些病毒感染可抑制免疫功能 .,激活补体II型超敏反应,病毒抗原抗体,免疫复合物沉积III型,（三）病毒的免疫逃逸 病毒的免疫逃逸能力是病毒毒力的另一重要因素。 病毒可能通过逃避免疫监视、防止免疫激活

23、或阻止免疫发生等方式来逃脱免疫应答。 1.编码特异抑制免疫反应蛋白质； 2.形成合胞体使病毒在细胞间传播逃避抗体作用。 如:乙肝病毒可抑制干扰素的转录，阻断抗病毒蛋白的表达。 （见教材P223 表23-2）,三、病毒感染的类型,显性、隐性感染,急性、持续性感染,慢性感染 潜伏感染 慢发病毒感染,（一)隐性感染和显性感染 1.隐性感染(inapparent infection)病毒侵入机体，有感染但缺乏临床症状者,医学意义:(1)常见，可成为传染源； (2)是机体获得特异性免疫的方式。 2.显性感染(apparent infection)：病毒侵入机体在易感细胞内增殖，产生组织损伤和毒性产物，机

24、体表现出临床症状者。 P224表23-3,形成原因：病毒毒力弱、机体防御较强，病 毒不能大量增殖，未造成细胞、组织严重损 伤；或最终不能侵入靶细胞。,（二）急性病毒感染（acute viral infection ） 潜伏期短、发病急、病程数日至数周、恢复后体内不存在病毒。 病原消灭型感染 如普通感冒、甲型肝炎。 （三）持续性病毒感染(persistent viral infection) 病毒在体内持续数月、数十年，或终生带毒， 而症状可有可无，亦可成为重要的传染源。 类型有： 1.慢性感染(chronic infection) 隐性或显性感染后，病毒在体内仍持续存在，达数月至数年，症状轻微

25、或缺乏。 如：慢性乙肝,2.潜伏感染(latent infection) 经显性或隐性感染后，可有少数病毒基因组 存在于特定的细胞内，不活动，但在一定诱因影 响下，又可呈现增殖性感染，称为潜伏感染。 如：水痘带状疱疹病毒,水痘,恢复,诱因,脊髓后根神经节,急性感染 潜伏感染,3.慢发病毒感染(slow virus infection) 特征：潜伏期长，数年数十年 发病为慢性进行性加重 多以死亡而告终 常见病毒：朊粒、HIV 、麻疹病毒-SSPE,四、肿瘤和病毒 许多病毒和肿瘤发生有密切关系！ 1.肯定的，肿瘤由病毒感染所致： HPV-人疣 人类嗜T细胞病毒-人T细胞白血病 2.密切相关的： H

26、BV-原发性肝癌 EBV-鼻咽癌、淋巴瘤 HPV16-宫颈癌,第二节 抗病毒免疫,固有免疫 干扰素,NK细胞,先天不感受性，屏障作用 适应性免疫 体液免疫 病毒中和抗体 血凝抑制抗体 补体结合抗体 细胞免疫 细胞毒性T细胞, CD4+Th1细胞,固有免疫,干扰素(Interferon, IFN) 定义：是由病毒或其他干扰素诱生剂刺激机体细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞)，诱导细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能的糖蛋白。 分类:,作用机理 不是直接杀灭病毒,IFN 细胞基因 抗病毒蛋白 (蛋白激酶, 2-5腺嘌呤核苷合成酶),自身和邻近细胞 降解病毒mRNA 抑制病毒蛋白合成 抑制

27、病毒组装、释放,抑制病毒复制,中断病毒感染；限制病毒扩散,生物学活性:,广谱的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止 病毒在体内扩散、促进痊愈; 调节免疫功能； 抑制肿瘤细胞生长；,IFN作用特点:,产生需要诱生剂 间接作用 广谱 种属特异性和细胞选择性,2NK细胞：是一种不受MHC限制，也不依赖 抗体的具有杀伤作用的免疫细胞。 功能：(1)非特异地杀伤病毒感染的靶细胞 (2)杀伤肿瘤细胞 (3)某些自身细胞 机理： (1)释放穿孔素溶解靶细胞 (2)释放肿瘤坏死因子(TNF-、) (3)改变靶细胞溶酶体稳定性 (4)活化靶细胞核酸内切酶，降解DNA,二、适应性免疫： (一)体液免疫： 主要作用细胞外

28、游离的病毒 1中和抗体：病毒某些表面抗原的抗体, 与病毒结合后可消除其感染能力 机理： (1)封闭与细胞受体结合的抗原表位 (2)改变病毒表面构型，阻止吸附 (3)V+Ab免疫复合物，易于被吞噬、清除 (4)V+Ab激活补体，溶解病毒。,IgM、IgG、IgA特点比较： IgG： MW小，可通过胎盘； 出现较晚，维持时间长； 中和能力比IgM强； IgM：MW大，不能通过胎盘。 出现最早； 中和能力不如IgG强，固定补体能强。 IgA：分泌型IgA（SIgA），粘膜固有层浆细胞 产生，在局部中和病毒，阻止病毒从局 部粘膜侵入，局部免疫起主要作用。,2非中和抗体：与病毒内部抗原或某些表面抗原结合

29、,不能中和病毒感染性,但具诊断意义 血凝抑制抗体：表面含有血凝素的病毒，可刺激机体产生抑制血凝现象的抗体。如乙脑病毒，流感病毒 补体结合抗体：由病毒内部抗原或病毒表面非中和抗原所诱发，可通过调理作用增强巨噬细胞的吞噬作用。,（二）细胞免疫： 主要靠CTL、致敏TC释放的多种淋巴因子发挥作用,1. CTL作用机制： 分泌穿孔素（溶C素） 在受感染的靶C膜上形 成小孔/通道 C受损。 分泌颗粒蛋白酶,CTL杀伤病毒感染的靶细胞,C裂解或凋亡,2辅助性T(Th)细胞： 可促进B细胞生长与分化，活化CTL及巨噬细胞,释放细胞因子.,3.细胞因子 CD4+T细胞 大量抗病毒因子(-IFN、TNF等）,分

30、泌,抑制病毒复制清除 靶细胞内病毒,激活,T细胞(CTL、Th) 巨噬细胞 NK细胞,三 抗V免疫持续时间,获得持久免疫的原因： V引起全身性感染，并有明显的病毒血症； V的型别少，Ag性稳定、单一； 不易或很少发生突变 获得短暂免疫的原因： 表面感染，无病毒血症； 病毒型别多； 病毒Ag易变异；,第24章 病毒感染的检查方法 与防治原则,第一节 病毒感染的检查方法,形态学检查 病毒包涵体细胞病变等,分离培养 常用细胞培养 也可用动物接种或鸡胚接种,病毒抗原抗体检测 常用有免疫荧光法 酶联免疫吸附试验中和试验等。,病毒核酸检测 常用病毒核酸杂交技术如聚合酶链反应。,一、标本的采集与送检 成败关

31、键!,原则： 尽早采取 无菌收集 部位适宜 冷藏速送：冰块或干冰 50%的甘油缓冲盐水 抗生素 双份血清标本：急性期、恢复期双份血清,检验标本杀灭杂菌(青链霉素),动物接种出现病状 鸡胚接种病变或死亡 细胞培养细胞病变,鉴定病毒种型,接种,病毒分离的一般程序：,二、病毒的分离和鉴定,（一）病毒的分离培养,1动物接种 最早的病毒分离方法，不常用。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。常用动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴等，接种途径有鼻内、皮内、皮下、脑内、腹腔、静脉等，接种后逐日观察动物发病或死亡。 缺点：繁琐；动物对很多人病毒不敏感；感染后症状不明显，体内潜在病毒感染,动物接种,2鸡胚培

32、养 鸡胚对多种病毒敏感，常选用孵化9-14天的鸡胚。 绒毛尿囊膜：天花病毒、痘病毒、人疱疹病毒 尿囊腔：流感病毒、腮腺炎病毒 羊膜腔：流感病毒初次分离培养鉴定 卵黄囊：嗜神经病毒,3细胞培养 最常用的方法 方法 将离体活组织块或分散的活细胞置于培养容器内，并在一定的条件下（合适的营养液、酸碱度及温度等）继续保持活性甚至能分裂繁殖，常用来分离培养病毒，称为组织培养。 按生长方式分单层细胞培养和悬浮细胞培养 按细胞来源、染色体特征及传代次数可分为原代细胞、二倍体细胞及传代细胞系。,（1）原代细胞：来源于动物胚，鸡胚或人胚的肾、肺等正常细胞制备。 （2）二倍体细胞株：指细胞在体外可传代50100代后

33、仍保持二倍染色体数目的单层细胞株，常用人胚肺建立，用于人类病毒的分离和制备病毒疫苗。 （3）传代细胞系：在体外可持续繁殖传代的细胞系，大多由癌细胞和二倍体突变细胞建立，如Hep一2、Hela、BHK细胞等，这些细胞被广泛应用，并可在液氮中长期冻存留用。,病毒在培养细胞中增殖的指标： （1）细胞病变效应 （CPE）。,Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).,病毒感染细 胞与邻近细胞融合,（2）红细胞吸附 （HAd） 具有血凝素（HA）的病毒（流感病毒等），使受染细胞膜

34、含有病毒血凝素抗原成分，能与红细胞结合出现红细胞吸附现象，以检测是否有病毒在细胞内增殖。,（3）病毒干扰作用：一种病毒的感染可干扰感染同一细胞的另一种病毒增殖，从而抑制后者产生CPE。 （4）细胞代谢的改变 病毒感染细胞的结果可使培养液的PH值改变。,（二）病毒的鉴定,1病毒形态学观察 2病毒血清学鉴定 3病毒分子生物学鉴定,HRV,SARS-CoV,（三）病毒的数量与感染性测定,150组织细胞感染量（50% tissue culture infectious dose, TCID50) 概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变或死亡的最小病毒量。 方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释

35、，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以能使50%细胞感染的病毒的最高稀释度作为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量。 用途: 测定感染性病毒的量和毒力,（三）病毒的数量与感染性测定,2红细胞凝集试验（血凝试验） 将含有血凝素的病毒接种鸡胚或感染细胞后，收集其鸡胚羊水、尿囊液，作不同浓度的稀释，加入动物红细胞，如出现红细胞凝集，以出现50%凝集的最高稀释度作为血凝效价，可测定病毒的含量。,（三）病毒的数量与感染性测定,3空斑形成试验： 原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼脂的细胞层上产生可见和可数的局部病灶称为蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，由蚀斑

36、的数目可以计算出原始标本中感染性病毒的含量。 用途： 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,用途： 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,三、病毒感染的血清学诊断,1中和试验：病毒在活体内或在细胞培养中被特异性抗体中

37、和而失去感染性的一种试验。既可测患者血清中抗体的滴度，也可鉴定未知病毒。,2血凝抑制试验 相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的血凝素与红细胞结合，抑制了血凝现象。既可用于流行病学的调查，又可用来鉴定病毒的型与亚型。 3补体结合试验 用已知病毒可溶性补体抗原来检测病人血清中相应的抗体，作为近期感染的指标。,4凝胶免疫扩散试验 用半固体琼脂糖进行的抗原、抗体的沉淀反应。,四、病毒感染的快速诊断,（一）形态学检查 1电镜和免疫电镜检查 直接查病毒颗粒 2普通光镜检查 查包涵体 （二）病毒成分检测 1病毒蛋白抗原检查 。 2病毒核酸检测 直接查病毒核酸成分。 （1）核酸扩增技术： （2）核酸杂交技术

38、：斑点杂交 原位杂交等 （3）基因芯片技术 （4）基因测序 （三）早期抗体检测 检测病毒特异性IgM抗体,香港大学专家：患者鼻咽标本Vero细胞培养CPE EM观察：冠状病毒 随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒 利用免疫荧光法将分离病毒与SARS患者血清进行血清学检测，反应呈阳性 从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-PCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因测序经Genbank数据库同源性比对，发现同源性为64%左右,SARS冠状病毒的分离和鉴定,加拿大专家完成了全基因组测序发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大确定为一种新的冠状病毒。 荷兰

39、的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子出现了与SARS病人相同的临床表现和病理特征再次从动物学实验证实引起SARS的病原体是这种冠状病毒 WHO将其命名为SARS冠状病毒,SARS冠状病毒的分离和鉴定,第二节 病毒感染的特异性预防,一、人工主动免疫常用生物制品,1灭活疫苗 常用的有乙型脑炎、狂犬、甲肝、流感等灭活疫苗。 2活疫苗（减毒疫苗） 常用的有脊髓灰质炎、流感、麻疹等减毒活疫苗。 3亚单位疫苗:化学提取或人工合成疫苗 流感病毒血凝素18个氨基酸肽、狂犬病毒刺突糖蛋白等。,一、人工主动免疫常用生物制品,4基因工程疫苗:使用DNA重组生物技术，把编码病毒特异性保护性抗原的基因定向插入细菌、酵母菌

40、或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。重组乙肝疫苗 5. 重组载体疫苗用减毒活病毒或减毒活细菌作为载体，将编码特定病原体免疫原性蛋白的基因插入载体，作为疫苗输入机体可预防特定病原体,二、人工被动免疫常用生物制品,1免疫球蛋白 血清丙种球蛋白用于某些病毒性疾病的紧急预防；乙肝免疫球蛋白用于特定病毒的紧急预防。 2细胞免疫制剂 主要有干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等。,第三节 病毒感染的治疗,抗病毒药作用机理： 与病毒竞争细胞表面的受体，阻止病毒的吸附； 阻碍病毒穿入或脱壳； 阻碍病毒生物合成； 增强宿主抗病能力的物质； 中草药具有清热解毒功效，有抗病毒作用； 如大青叶、板蓝根.

41、,抗病毒治疗原则： - 抑制病毒复制； - 增强机体免疫应答能力，促进消灭病毒感染的细胞；,临床抗病毒治疗的局限性 针对病毒复制过程中的某个环节，对潜伏状态的病毒无效。 某些病毒易突变，易出现耐药毒株 数量较少,1. 核苷类药物：用合成的异常嘧啶取代病毒胸腺嘧啶，抑制病毒复制或导致缺陷病毒。 无环鸟苷(ACV)，叠氮胸苷(AZT)， 碘苷(IDU，疱疹净)，病毒唑(三氮唑核苷) 2. 病毒蛋白酶抑制物 沙喹那韦(saquinavir)，利托那韦(ritonavir) 吲哚那韦(indinavir) , 奈非那韦(nelfinavir) 3. IFN、IFN诱生剂、细胞因子、中草药 4. 基因治疗 反义寡核苷酸（asON，反义RNA）； 干扰RNA（Si RNA) 核酶（ribozyme） 5. 治疗性疫苗,重点掌握： 病毒的结构、化学组成及功能 病毒的复制周期 异常增殖和干扰现象：顿挫感染，缺陷病毒，干扰现象 遗传与变异：条件致死性突变株，缺陷型干扰突变株，重组与重配，整合 传播方式：垂直传播 病毒感染的致病机制 感染类型：持续性病毒感染，潜伏感染，慢发病毒感染 干扰素：定义，分类，抗病毒活性 中和抗体 病毒的分离培养程序，病毒感染的快速诊断 CPE,红细胞吸附,