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1、灰葡萄孢菌AUR1基因对细胞生长和繁殖的影响赵红霞,孙九丽, 苟萍*(新疆大学生命科学与技术学院, 新疆 乌鲁木齐 830046)摘 要：目的: 明确灰葡萄孢菌AUR1基因（BcAUR1）对灰葡萄孢菌细胞生长、发育和繁殖的作用。方法: 采用PCR扩增BcAUR1的 P 和T 片段，依次克隆于pTFCM质粒载体的潮霉素基因两侧，构建灰葡萄孢菌AUR1断裂基因表达载体，通过农杆菌介导转化灰葡萄孢菌，在潮霉素抗性培养基上筛选转化子。AbA处理灰葡萄孢菌，观察细胞形态。结果: 断裂基因转化子比空载转化子显著减少，说明BcAUR1断裂基因同源重组替代了宿主AUR1基因，导致转化子不能存活。AbA显著影响
2、野生型灰葡萄孢菌的生长发育，导致孢子萌发延迟、菌丝形态异常，不能形成分生孢子头；但AbA不影响抗AbA突变体BcAUR1a的生长发育。结论： AUR1基因对灰葡萄孢菌生长、发育和繁殖起重要作用。关键词：灰葡萄孢菌, IPC合成酶, 短梗霉素A, 同源重组，转化子中图分类号：S188+ 2 文献标识码：AEffects of Botrytis cinerea AUR1 gene on cell growth and reproductionZHAO Hong-xia, GOU Ping*(College of Life and Technology ,Xinjiang University,Ur
3、umqi 830046,China)Abstract:Objective: To investigate the influence of AUR1 gene on Botrytis cinerea cell growth and reproduction. Method: BcAUR1 P fragment and T fragment were amplifided by PCR, cloned into both sides of hygromycin gene of plasmid vector pTFCM by sequence. The vector was transformed
4、 into B. cinerea by agrobacterium-mediated genetic transformation method and the transformants were screened by hygromycin resistance. B. cinerea was treated by AbA and cell morphology was observed. Result: The interrupted gene transformants were obviously less than empty plasmid transformants, indi
5、cating that BcAUR1 interrupted gene had been homologous recombinantion into B. cinereas genome, causing B. cinerea not survive. Besides, AbA could inhibit the growth of wild B. cinerea obviously, delay spore germination, induce abnormal of mycelial morphology, block the formation of conidium head. H
6、owever, AbA did not affect the growth of AbA-resistant mutant BcAUR1a. Conclusion: AUR1 gene plays a key role in B. cinerea cell growth and reproduction. Keywords: Botrytis cinerea, IPC synthase enzyme, aureobasidin A, homologous recombination, transformantsa基金项目：国家自然科学基金项目(31160031)作者简介：赵红霞（1987），女
7、，甘肃定西市人，硕士研究生，专业方向：生物化学与分子生物学. (E-mail) 通讯作者：苟萍(1955)，女，新疆乌鲁木齐人，教授，硕士生导师，研究方向：生物化学与分子生物学(E-mail) gou_ 0 引言 鞘脂普遍存在于各种动、植物细胞的细胞膜、细胞器膜、富脂器官和载脂蛋白中，在质膜中的含量尤为丰富，鞘脂是维持真核细胞结构不可缺少的组分。近年来发现鞘脂及其代谢产物还是重要的信号分子, 在细胞的生长、凋亡、分化、衰老等细胞基本活动过程中发挥重要的调节作用。在人类致病真菌中，鞘脂与致病性相关的信号传导有密切的关系。丝状真菌中的鞘脂还与孢子萌发、菌丝的极性生长相关1-3。AUR1基因编码的肌
8、醇磷脂酰神经酰胺（IPC）合成酶是真菌鞘脂代谢的关键酶，该酶催化真菌中的特有反应神经酰胺和磷脂酰肌醇生成IPC和甘油二酯4，在哺乳动物和植物中没有发现这个酶。因此IPC合成酶的抑制剂能抑制真菌的生长，而对哺乳动物和植物是安全的，可作为筛选抗真菌药物的靶标。短梗霉素A（AbA）是一种环状多肽抗生素，通过抑制IPC合成酶抑制真菌的生长。AbA处理酵母细胞能引起肌动蛋白异常组装，导致细胞膜结构遭到破坏，引起细胞出芽方式的改变，最终导致细胞死亡5-6。通过在酵母等真菌中筛选抗AbA突变体，发现突变体能抵抗AbA引起的细胞形态和生长发育的异常7。迄今，对植物病原真菌灰葡萄孢菌（Botrytis cine
9、rea）AUR1基因的表达及其在生长发育过程中的作用了解甚少，我们通过构建灰葡萄孢菌AUR1（BcAUR1）断裂基因（BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1 T片段）载体，转化灰葡萄孢菌，以及AbA对细胞生长发育的研究，明确灰葡萄孢菌AUR1基因对细胞生长和繁殖的重要作用。1 材料与方法1.1材料1.1.1 实验材料灰葡萄孢菌（B. cinerea）由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供，AGL1农杆菌感受态购自北京鼎国有限责任公司，质粒pTFCM由华中农业大学植物科技学院姜道宏教授实验室提供。灰葡萄孢菌突变体BcAUR1a由本实验室通过紫外诱变，AbA筛选获得8。经鉴定和序列测
10、定发现，该突变菌株AUR1基因序列中缺失117231位115 bp的内含子序列，但AUR1基因编码的氨基酸序列未发生突变9。1.1.2 试剂 Xho、Spe、Not、Sac内切酶，T4DNA连接酶购自TAKARA，异丙醇、无水乙醇、RNA酶购自北京鼎国有限责任公司，潮霉素B溶液（50 mg/mL）购自宝信生物有限责任公司，由德国Roche Diagnostics GmbH 公司生产。1.1.3 仪器高速冷冻离心机（德国Heraeus公司），85P-72型冷冻超速离心机（日本日立公司），凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。1.1.4 培养基 灰葡萄孢菌培养基为PDA，根癌农杆菌AGL1培养基
11、为YEB，农杆菌与灰葡萄孢菌孢子共培养使用MM培养基。不同培养基中使用的抗生素终浓度分别为：卡那霉素50 g/mL，利福平100 g/mL，头孢霉素200 g/mL。1.2方法1.2.1 灰葡萄孢菌的培养菌种用平板划线法进行活化，28 培养箱中倒置培养一周，待其菌丝变为灰色并长满平皿后再进行2次活化，直至产生孢子。用无菌水洗下第二次活化后的孢子，接种到液体培养基，28 ，180 r/min震荡培养，直到摇瓶中有大量小球状菌体产生即可。1.2.2 灰葡萄孢菌基因组的提取灰葡萄孢菌总DNA的提取参照分子克隆实验指南中的方法10和Talbot NJ等11的方法。1.2.3 BcAUR1断裂基因表达载
12、体的构建 在“Genome information for Botrytis cinerea”数据库中搜索，得到肌醇磷脂酰神经酰胺转录子BC1T_15253序列。从野生型灰葡萄孢菌中提取总DNA，根据BcAUR1基因的P片段和T片段序列（图1）设计引物，并加入相应的酶切位点（表1）。扩增BcAUR1基因的P片段和T片段。以Sac和Not消化P 片段PCR产物，Spe和Xho消化T片段PCR产物。DNA纯化试剂盒回收目的片段。依次将BcAUR1基因的P片段和T片段连接到用相同酶消化的pTFCM质粒潮霉素基因（Hygromycin）的两端，得到含BcAUR1断裂基因（BcAUR1 P片段-Hyg-
13、BcAUR1T片段）的pTFCM重组质粒，送华大基因公司测序。BcAUR13UTR BcAUR15UTR 缺失序列4 BcAUR1基因 潮霉素基因 图1 BcAUR1的断裂基因示意图Fig. 1 The interrupted gene of BcAUR1. 表1 引物序列Table 1 The sequence of primers.引物名称Primer name 引物序列 Primer sequences (53)内切酶Restriction enzymePFCGAGCTCATGAAGACGGGAGCGGCTACSacPRATTTGCGGCCGCATGGAGGCGAACAAGGGANotT
14、FGGACTAGTATGTACACAACGAACTTTASpeTRCCCTCGAGATGACCTCACTAAGCTXho 1.2.4 灰葡萄孢菌分生孢子的制备 将活化的灰葡萄孢菌接种于PDA固体培养基，28 恒温培养箱中倒置培养5 d。用无菌蒸馏水洗脱新鲜的分生孢子，显微镜下用血球计数板计数，使孢子浓度达到107个/mL。1.2.5 灰葡萄孢菌分生孢子对潮霉素敏感性测定灰葡萄孢菌薄壁分生孢子分别在不同潮霉素浓度（0 g/mL、20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL）的PDA培养基上培养6 d，观察结果。潮霉素浓度在20 g/mL灰葡萄孢菌能够生长，40
15、-60 g/mL只有少数几个菌落生长，60 g/mL以上无菌落生长。因此，本试验潮霉素抗性筛选的浓度设为70 g/mL。1.2.6 转化方法参照沈卫锋等12的方法通过根癌农杆菌介导转化灰葡萄孢菌。将100 L根癌农杆菌AGL-1感受态细胞分别与50 ng 含BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1 T片段（BcAUR1断裂基因）的pTFCM和pTFCM混合，依次置冰上10 min，液氮速冻5 min，28 水浴热激5 min，加入1 mL LB液体培养基，28 ，200 r/min摇床培养3 h，取200 L菌液涂布于LB固体培养基（含卡那霉素50 g/mL，利福平100 g/mL）28 培
16、养2 d，挑选转化子于LB液体培养基（含卡那霉素50 g/mL，利福平100 g/mL），在28 、200 r/min摇床培养过夜。离心收集菌体，用MM液体培养基重悬菌体，使OD600为0.15，28 、200 r/min摇床培养至OD600值介于0.4-0.6之间。分别取上述含BcAUR1断裂基因的pTFCM和pTFCM的根癌农杆菌转化子菌液100 L与100 L灰葡萄孢菌孢子(1107个/mL)混合，涂布于MM固体培养基，28 共培养48 h后，覆盖一层PDA培养基（含头孢霉素200 g/mL、潮霉素70 g/mL），28 培养6 d后统计转化子数量，计算同源重组率。1.2.7 转化子验证
17、分别挑取2-3个空载和断裂基因转化子菌落，以野生型灰葡萄孢菌为对照，在含70 g/mL 潮霉素的PDA液体培养基中培养5-7 d，收集菌体。分别提取基因组DNA，用潮霉素基因引物（引物序列为:5-TTCGATGTAGGAGGGCGTGGA-3; 5-CGCGTCTGCTGCTCCAT ACAAG-3）扩增潮霉素基因。扩增条件：94 预变性3 min，94 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸1 min，循环35次，72 充分延伸5 min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.2.8 细胞形态观察分别将PDA和含8 g/mL AbA的PDA涂布于凹形载玻片上，冷却凝固，放到含有无菌水浸
18、湿滤纸的培养皿中，以保证培养基在试验期间的湿度。分别取2 L野生型BcAUR1和突变体BcAUR1a孢子悬液（1107个/mL）滴加到培养基上，用无菌玻璃棒涂布均匀，28 恒温培养，每个试验5个重复。每隔12 h 观察一次，连续观察72 h。每次至少观察50个细胞，数码显微镜观察并拍照。 2 结果与分析2.1 BcAUR1断裂基因表达载体构建从野生型灰葡萄孢菌中提取总DNA，用BcAUR1基因序列的特异引物扩增得到BcAUR1基因的P片段（524 bp）和T片段（506 bp）（图2），将P片段和T片段构建到pTFCM质粒潮霉素基因的两侧，含断裂基因BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1
19、T片段的pTFCM经Sac和Not双酶切鉴定，目的条带与预期相符（图3），DNA测序结果表明构建序列正确。图2 BcAUR1基因的P片段和T片段 Fig. 2 P and T fragment of BcAUR1 gene. 1: 2000 maker. 2-5: P fragment. 6-9: T fragment.图3 BcAUR1断裂基因的pTFCM酶切鉴定Fig. 3 Restriction enzyme digestion of pTFCM containing interrupted BcAUR1 gene. 1: 15000 maker. 2: pTFCM containing
20、 P fragment and T fragment of AUR1. 3-5: The fragment of recombinant plasmid by Sacand Notenzymes，big fragment is about 13000 bp, small fragment is about 520 bp. 6: 600 maker.2.2 BcAUR1断裂基因同源重组灰葡萄孢菌菌株Botrytis cinerea strains灰葡萄孢菌转化子数量The numbers of Botrytis cinerea strains野生型 wild type空载质粒转化子 Empty
21、plasmid transformants 断裂基因转化子 Interupted gene transformants以野生型灰葡萄孢菌为对照，根癌农杆菌介导空载pTFCM质粒和含BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1 T片段的pTFCM转化野生型灰葡萄孢菌，通过共培养、潮霉素抗性培养基筛选，统计转化子数量（图4），并对转化子进行PCR鉴定（图5）。野生型未扩增出潮霉素基因条带，而空载和断裂基因转化子扩增出潮霉素基因条带，表明转化成功。野生型在潮霉素培养基上不能生长，空载转化子能在潮霉素培养基上生长，转化子平均数为45.6。断裂基因BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1 T片段的pTF
22、CM转化子的平均数为32.6，断裂基因转化子数目显著低于空载转化子，说明断裂基因BcAUR1 P片段-Hyg-BcAUR1 T片段与野生型灰葡萄孢菌的AUR1基因发生同源重组，导致AUR1基因失活，菌体死亡，同源重组率为28.5%。表明AUR1基因对灰葡萄孢菌的生长起关键作用。注：图中不同的字母表示不同组间有显著差异（P0.05）Note: Figure with the different letters are significantly different between different groups, P0.05.图4 灰葡萄孢菌转化子数量Fig. 4 The numbers of
23、 Botrytis cinerea transfomantsM 1 2 3 4 5 6 7 8 9图5 空载和断裂基因转化子PCRFig. 5 PCR of transfomants with empty plasmid and interrupted BcAUR1 gene.M: 2000 marker. 1: wild type. 2-5: Empty plasmid transformants. 6-9: Interrupted gene transformants.2.3 BcAUR1基因在孢子萌发中的作用在含与不含AbA的培养基上，观察不同时期野生型BcAUR1和BcAUR1a（缺失
24、内含子突变体）的生长状态，发现BcAUR1在不含AbA的培养基上，12 h孢子开始萌发，24 h 芽管伸长、单极性生长，36 h长满菌丝，48 h形成分生孢子头，60 h散发分生孢子，72 h分生孢子散发完（图6）。BcAUR1在含AbA的培养基上，孢子萌发延迟了12 h，到24 h孢子开始萌发，36 h芽管分枝增多，多极性生长，48 h至60 h可见生长的菌丝多分枝，72 h时未观察到分生孢子头的形成（图7）。结果表明AbA能明显延迟孢子萌发，导致菌丝形态异常，不能形成分生孢子头。而突变体BcAUR1a不论是否存在AbA，其生长状况与野生型不含AbA时基本一致（图8、9），表明BcAUR1a
25、的生长不受AbA的影响，产生了对AbA的抵抗。 12h 24h 36h 48h 60h 72h 图6 BcAUR1不同时段孢子萌发状态（1020） 12h 24h 36h 48h 60h 72h图7 BcAUR1加8 g/mlAbA时不同时段孢子萌发状态（1020） 12h 24h 36h 48h 60h 72h图8 BcAUR1a不同时段孢子萌发状态（1020） 12h 24h 36h 48h 60h 72h图9 BcAUR1a加8 g/mlAbA时不同时段孢子萌发状态（1020）3 讨论近年来真菌基因序列测定已获得了大量的基因组信息，但对大多数基因的功能还不明确，目前真菌基因组研究已进入功
26、能基因组时代。通过构建断裂目的基因载体，农杆菌介导转化，同源重组将断裂基因整合到宿主基因组，实现目的基因的敲除，再通过表型变化确定基因的功能，是开展基因功能研究的重要手段。目前已有多种真菌成功实现了T-DNA的同源重组14-16，我们通过农杆菌介导成功的获得AUR1基因灭活的灰葡萄孢菌转化子，空载对照转化子转化率为43.2个/106个孢子，比稻曲病菌和稻瘟病菌转化子17-18的转化率低，这可能与受体菌菌株、共培养时间、分生孢子活性等因素有关。Yu JH 等利用基因敲除技术，成功失活了构巢曲霉、烟曲霉和禾谷镰刀菌等3种丝状真菌共31个基因，同源重组率在040%之间15，我们的实验结果表明BcAU
27、R1基因的同源重组率为28.5%。目前越来越多的研究发现鞘脂及其代谢分子在细胞生长和信号转导方面发挥着重要的作用，鞘脂代谢异常将导致细胞多种生命活动的紊乱，甚至导致细胞凋亡19 。本研究证实了断裂基因BcAUR1-Hyg-BcAUR1发生同源重组敲除了宿主BcAUR1基因，导致宿主不能存活，明确了BcAUR1基因对灰葡萄孢菌生长和繁殖的重要作用。已有研究表明AbA能抑制真菌的生长，破坏真菌细胞膜的完整性，并引起细胞形态异常，如芽管伸长受阻，芽管和菌丝顶端的分支增多，菌丝生长缓慢20-21，我们实验也表明低浓度的AbA显著延迟孢子萌发，导致芽管分枝增多、多极性生长，菌丝呈树状分枝，不能形成分生孢
28、子头。而AUR1基因突变体BcAUR1a则不受AbA的影响，生长正常。这些结果均表明AbA能够通过抑制肌醇磷脂酰神经酰胺（IPC）合成酶的活性，导致鞘脂合成不足，最终不仅抑制灰葡萄孢菌的生长发育，而且导致细胞形态异常。目前已有许多研究表明内含子（intron）具有调控基因转录的功能，在其序列中发现了转录调控元件，起着启动子（promoter）、增强子（enhancer）和抑制子（repressor）的作用22-23。我们的实验中发现BcAUR1基因中缺失内含子突变体BcAUR1a 产生了AbA抗性，抵抗AbA引起的细胞表型的变化，说明该内含子可能在BcAUR1基因表达调控中发挥重要的作用，很可
29、能是转录抑制子。4 结论本文通过研究BcAUR1断裂基因同源重组和IPC合成酶抑制剂AbA对灰葡萄孢菌生长、发育和繁殖的影响，证实BcAUR1基因对真菌生长、发育和繁殖是必不可少的。参考文献1 Hannun YA, Obeid LM. Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nature Review Molecular Cell Biology, 2008, 9(2): 139150. 2 Juliana M，Figueiredo，Wagner B，et al. Characterizatio
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