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1、人胚胎生殖干细胞对卵巢癌细胞体内外生长抑制的研究,山东大学齐鲁医院 宋欣燕 孔北华,研究背景,人类胚胎干细胞具有正常的核型及自我更新能力，在发育过程中能分化成多种正常表型的细胞，其生长分化受到多种细胞因子及分子信号通路的调节，如PI3K、BMP、TGF等； 肿瘤细胞与干细胞有较多相似性，包括某些与自我更新等有关的分子信号通路；这些信号通路的改变与肿瘤的发生、侵袭有关；,肿瘤的发展也与周围微环境有关，二者相互作用影响肿瘤的生长、侵袭； 因而，我们设想这种能支持正常发育过程的全能干细胞及其微环境能否逆转异常的肿瘤细胞表型。,加拿大麦克马斯特癌症与干细胞研究所(McMaster Cancer and
2、 Stem Cell Research Institute)的研究人员报告说，胚胎干细胞可以制造特别的壁龛细胞，然后这些壁龛细胞会释放干细胞所需的蛋白质，保证这些“母体”平稳运行。,Nature, 2007, 448:1015-21,Dr. Hendrix报道人胚胎干细胞微环境可以诱导恶性黑 素瘤细胞转为正常皮肤细胞表型，并降低侵袭力。 J. Fair报道鼠胚胎干细胞可以在体外抑制胰腺癌细胞生长。,Stem Cells, 2006,24:501-505,J Sur Res, 2004,121:342,胚胎生殖干细胞（EG细胞）属于全能干细胞，来源于原始生殖细胞，本实验设计研究人EG细胞对卵巢癌
3、细胞SKOV3在体内外生长抑制的作用，并设计通过定量PCR、western blot 等检测AKT信号通路的表达情况。,方法与路线,胚胎生殖细胞的分离、培养、鉴定,5-7周流产胎儿,生殖嵴,分离原始生殖细胞,接种培养,细胞因子（bFGF、forskolin等)、胚胎条件培养液、成纤维细胞饲养层等,传代鉴定,（AP，SSEA-1、3、4，OCT-4，TRA-1-60，TRA-1-81等）,直接共培养EG cells与SKOV3 cells,研究EG细胞在体内对卵巢癌细胞生长的作用,利用SKOV3卵巢癌细胞在SCID小鼠皮下建立人卵巢癌的动物模型，在小鼠皮下出现可触到的瘤块时（约在接种后7天，瘤块
4、直径约0.5cm），将培养的人胚胎生殖细胞注入肿瘤组织内，并以PBS作为对照，比较两组小鼠肿瘤生长情况。,培养的EG细胞呈克隆样生长，边界清楚，似鸟巢状，AP染色阳性。,HEG细胞鉴定,结果,A： SSEA-1 B: SSEA-3 C: SSEA-4 D: TRA-1-60 E: TRA-1-81,结果,HEG细胞的鉴定,HEG自发分化,共培养48h计数SKOV3 cells,实验组：(7.82.4)104 对照组：(11.52.3)104 (p=0.0258),结果,TUNEL凋亡检测,A、C：实验组 B、D：对照组,免疫细胞化学检测Caspase9的表达,Real time PCR检测AK
5、T mRNA表达,结果,Western blot检测p-akt、akt蛋白的表达,结果,肿瘤生长曲线,同期观察测量实验组肿瘤生长慢于对照组,石蜡组织切片TUNEL凋亡检测,结 论,与生殖干细胞体外共培养后，卵巢癌SKOV3细胞的生长显著受到抑制；体内注射实验也表明能够抑制肿瘤生长。 Tunel结果初步表明： 此抑制现象可能是通过诱导凋亡途径发生。,PI3Ks/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在人类肿瘤谱中广泛失调, p-AKT可以通过激活或抑制下游的受体蛋白BAD、Caspase 9等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等；本实验结果显示AKT信号通路参与了此诱导凋亡过程，表现为： p-AKT表达减少，使凋亡抑制被解除；caspase-9被激活，引起SKOV3细胞的凋亡。,干细胞对癌细胞的影响是通过胞外分泌形式还是细胞接触途径？需进一步验证。 干细胞表达的产物多种多样，具体是哪些蛋白或蛋白多糖发挥了作用还需要进一步研究。 我们发现干细胞通过AKT信号途径调节SKOV3细胞生长，是否还有其它途径参与？,进一步实验计划,Thanks,