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1、科 技 查 新 报 告项目名称：基于MAPK通路的大马哈鱼皮活性肽抗皮肤光老化机制学生姓名： 学号： 联系方式：电话 E-MAIL:查新项目名 称中文：基于MAPK通路的大马哈鱼皮活性肽抗皮肤光老化机制英文： Regulation mechanism of MAPK signal transduction of bioactive peptide from big pacific-salmon skin against skin photoaging 一、 查新目的计算机检索课实习作业二、 查新项目的科学技术要点活性肽的制备研究主要集中在水解条件的优化上，然而活性肽酶解制备过程复杂多变，仅靠参
2、数优化与动力学模拟难以获得高活性的目标肽，新型靶向酶解理论与技术成为活性肽制备中亟待解决的问题。在前期申请人利用生物传感器与人工神经网络模型实现了鳕鱼免疫活性活性肽的靶向制备，显示了巨大优势，本项目将采用新型的生物传感器与人工神经网络模型靶向制备大马哈鱼皮抗光老化活性肽，此研究未见报道。皮肤光老化严重威胁了人们的健康，预防和延缓皮肤光老化已成为目前亟待解决的问题。最近研究发现一些水产活性肽具有高的抗氧化活性、吸收利用率高，显示了潜在的抗光老化优势。国内外研究发现海参胶原肽、海蜇胶原肽、罗非鱼皮活性肽等可以提高体内抗氧化防御机制、减轻紫外线对皮肤的损害。项目申请人在前期研究中发现鳕鱼皮胶原肽能够
3、显著提高光老化小鼠体内抗氧化能力，从而截断自由基攻击，减缓皮肤光老化发生，但是基于MAPK信号传导通路的大马哈鱼皮活性肽对光老化皮肤干预机制未见报道。UV诱导的基质金属蛋白酶（MMPs）活化是导致真皮基质胶原降解与光老化发生的重要原因，MMPs的激活是通过丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路传导的5,6。尽管有研究显示一些海洋活性肽具有潜在的抗光老化效果，然而目标活性肽如何阻断皮肤基质胶原降解尚不清楚，其作用靶点尚待进一步探讨。本研究将建立光老化小鼠模型，从直接与间接调控MMPs的MAPK通路（JNK、p38、ERK、AP-1、c-Jun、c-Fos），探讨大马哈鱼皮活性肽对MMPs的拮抗途径，
4、进而在分子水平、代谢途径上阐释大马哈鱼皮肽抗光老化的作用机制。技术路线形成的成果：（1）采用生物传感器与人工神经网络模型定向制备大马哈鱼皮活性肽。（2）明确大马哈鱼皮活性肽对光老化小鼠皮肤基质金属蛋白酶MMPs与TIMPs的影响。（3）基于MAPK通路的大马哈鱼皮活性肽对光老化小鼠皮肤MMPs的拮抗途径与作用机制的确定。三、 查新点与查新要求查新点：1. 生物传感器与人工神经网络模型（BIO-ANNs）靶向制备大马哈鱼皮抗光老化活性肽。2. 基于MAPK信号传导通路的大马哈鱼皮活性肽对光老化皮肤胶原降解的干预机制。查新要求：国内外查新四、文献检索范围及检索策略国内数据库1.中文科技期刊全文数据
5、库（维普） 1989-2014年2.中国学术期刊论文数据库（万方） 1998-2014年3.中国学位论文文摘数据库（万方） 1980-2014年4.中国学术会议论文数据库（万方） 1985-2014年5.中国科技成果数据库（万方） 1983-2014年6.中国期刊网全文数据库（CNKI） 1994-2014年7.中国博士学位论文全文数据库（CNKI） 1999-2014年8.中国优秀硕士学位论文全文数据库（CNKI） 1999-2014年9.中国重要会议论文全文数据库（CNKI） 2000-2014年10.中国科技论文在线 2003-2014年11.中国学术会议在线 2005-2014年12.
6、国家科技图书文献中心 1989-2014年13.国家科技成果网 1978-2014年14.中国专利数据库 1985-2014年15.中国标准数据库（万方）国外数据库：1. .SCI (Science Citation Index) 1990-2014年2. Dissertation Abstract 1861-2014年3. NTIS-National Technical Information Service 1964-2014年4. Conference Papers Index 1982-2014年5. INPADOC 1968-2014年6. WIPO/PCT Patents Full
7、text 1983-2014年7. WPI 1963-2014年 8. U.S.Patents Fulltext 1971-2014年9. AGRIS International 1975-2014年 10. AGRICOLA 1979-2014年11. CAB ABSTRACTS 1973-2014年12. BIOSIS Previews 1969-2014年13. Biotechnology and Bioengineering Abstracts 1982-2014年14. Biotechnology Research Abstracts 1980-2014年15. Proquest B
8、iology Journals 1980-2014年16. Derwent Innovations Index 1963-2014年17. ASFA 1971-2014年18. Elsevier online 1990-2014年19. SciFinderScholar（CA） 1980-2014年检索词及检索策略： 1. （大马哈鱼 + 大麻哈鱼 + Oncorhynchus keta + Big pacific-salmon ）*（生物传感器 + 人工神经网络 + BIO-ANNs） * 活性肽（Oncorhynchus keta + Big pacific-salmon ）* （bios
9、ensor + artificial neural networks + BIO-ANNs）* bioactive peptide2. （大马哈鱼 + 大麻哈鱼 + Oncorhynchus keta + Big pacific-salmon ）* 活性肽 * 光老化 * （丝裂原活化蛋白激酶 + MAPK） （Oncorhynchus keta + Big pacific-salmon ）* bioactive peptide * photoaging *（mitogen-activated protein kinases + MAPK）五、检索结果根据上述文献检索范围和检索式，共检索筛选出
10、相关文献38篇，摘录如下：1.【篇名】人工神经网络在肽的定量构效关系研究中的应用【作者】刘亚秀【作者单位】华北科技学院电信工程系,101601【出处】科技资讯,SCIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION2006,(28)【ISSN】1672-3791【页码】12-13【摘要】本文作者用人工神经网络模型和相互作用法研究了几种肽分子的定量构效关系(Q S A R s).相互作用法是一种新的表征肽分子结构的方法,它认为:(1)在肽分子链中,任何两个氨基酸分子间都存在相互作用;(2)氨基酸分子间存在的相互作用值不仅与核酸分子类型有关,而且与它们间的距离有关系;(3
11、)肽分子的结构可以用TIV值(即肽分子中任意两个氨基酸分子间存在的相互作用值之和)来表征.这种方法的优点是不同的肽分子的结构都可以由TIV值表征,它有助于更方便地研究肽分子的定量构效关系.计算结果和实验结果的比较证明这种方法的效果令人满意.2. 【篇名】光学生物传感器在研究正、反义肽间选择性相互作用中的应用【作者】胡承香,曾焕芬,巫振洪等【作者单位】第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室,重庆,400042;重庆医科大学附属第二医院,重庆,400010;第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室,重庆,400042;解放军第十五中心医院,新疆,乌苏,833000【出处】免疫学杂志,IMMUNOLO
12、GICAL JOURNAL2003,19(3)【ISSN】1000-8861【页码】224-226【摘要】目的观察生物分子间相互作用动力学、亲和力及特异性,研究C5a与其反义肽的相互作用规律.方法应用生物分子相互作用实时分析系统IAsys Plus,以反义肽R4为固定相,L2和rhC5a为流动相,采用FASTplot软件对选择结果优化的反应模式,计算各动力学参数值.结果反义肽R4与配体rhC5a相互结合的KD=6.6210-6mol,直线在Y轴上的截距(解离常数)Kdiss为0.0225 s-1;与L2的KD=4.50810-6mol.结论生物传感器技术可以用于正义-反义肽之间相互作用的研究中
13、,且反义肽R4可与其正义肽、与rhC5a发生特异性相互作用.3. 【篇名】利用人工神经网络优化制备鳙鱼抗氧化肽【作者】李琳,赵谋明,张黎等【作者单位】华南理工大学,轻工食品学院,广东,广州,510640;华南理工大学,电信学院,广东,广州,510640【出处】四川大学学报（工程科学版）,JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(ENGINEERING SCIENCE EDITION)2006,38(1)【ISSN】1009-3087【页码】80-85【摘要】生物活性肽的制备受到酶用量、酶解时间等因素的影响,利用具有自学习特点的人工神经网络可实现对酶解过程的模拟仿真.以大宗淡水
14、鱼资源-鳙鱼肉蛋白为原料,对其进行控制酶解以制备出具有清除自由基活性的鳙鱼肽,为获得最大的清除自由基活性,采用3层(5-13-1)BP网络对酶解过程进行模拟和优化.结果表明:1)pH7.5,酶解温度60,酶/底物为0.2%,酶解时间为4.8 h,鱼肉/水为1:1.9时可制备出具有最强清除DPPH自由基的肽A;2)pH 7.5,酶解温度60,酶/底物为0.16%,酶解时间为6 h,鱼肉/水为1:1.4时可制备出具有最强清除OH自由基的肽B;3)pH7.5,酶解温度60,酶/底物为0.2%,酶解时间为4.3 h,鱼肉/水为1:1时可制备出具有最强清除O2-自由基的肽C.研究证明人工神经网络以其处理
15、非线性问题的优越性可成为模拟和优化酶解过程的方便工具.4.【篇名】鳕鱼免疫活性肽的可控制备及其免疫活性研究【作者】侯虎【学位类型】博士【授予单位】中国海洋大学,【导师】李八方【年份】2011.【摘要】免疫活性肽是一类具有增强机体免疫力、增强巨噬细胞吞噬功能、提高机体抵御外界病原体感染能力等免疫功能的肽,具有分子量小、稳定性强,且免疫原性弱、生物活性高等诸多优点。目前酶法制备生物活性肽主要集中在活性优化和动力学模拟上,并不能保证酶解按预期进行。而鳕鱼免疫活性肽的可控制备及免疫活性研究,是通过采用生物技术、生物传感器、数学模型、人工神经网络等实现了免疫活性肽的准确预测、动态监测、可控制备,并且利用
16、树脂吸附技术等对免疫活性肽精制,为免疫活性肽的工业化生产提供理论依据和技术支持。同时本文还对制备的鳕鱼免疫肽的体内免疫活性机理作了初步探讨。 本论文形成了以下研究成果: 1、本文以鳕鱼加工下脚料鳕鱼排为原料作为研究对象,首先研究了其基本组成。鳕鱼排中蛋白质含量较高(18.4),以碱溶性蛋白(35.49)和基质蛋白(30.49)为主,有重要利用价值。鳕鱼排蛋白中以高含量的甘氨酸(26.51)和谷氨酸(12.57)为主,其次为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸和赖氨酸。为了充分利用鳕鱼蛋白,对鳕鱼排进行了软化高压预处理研究,条件最终设定为120处理30min。 2、水解度值、分子量分布、多肽含量均是
17、反映酶解产物特征的重要因素,但在线监测困难。鳕鱼蛋白酶解产物游离氨基酸含量呈现规律性变化,可作为监测水解反应的响应因子,并且生物传感器测定响应因子速度快、准确度高、稳定性好。其中对谷氨酸和赖氨酸测定的相对误差分别为1.5和1.0,变异系数分别为3.85和3.03,标准偏差分别为0.78和0.60。多酶切位点下,游离谷氨酸和赖氨酸都呈规律性变化,与水解度正相关,可作为酶解产物的响应因子,同时在一定水解度范围内,游离谷氨酸和赖氨酸浓度与水解度均呈现较好的线性关系。利用游离谷氨酸和赖氨酸浓度作为响应因子监测多种商品酶的水解程度是可行的。 3、鳕鱼排的胰酶水解产物(PFH)可以显著促进脾细胞增殖、T细
18、胞增殖、巨噬细胞吞噬(p0.05)。分子量和水解度是影响脾细胞增殖活性的重要因素。在水解度15-18时,PFH的脾细胞增殖活性最高。采用响应面方法确定了鳕鱼免疫肽制备参数:蛋白浓度25ge/L、pH值8.0、温度(501)、时间290 min和加酶量24 U/mg,验证实验的平均DH为16.87,脾淋巴细胞平均增殖率为28.45,与理论值相符。PFH在220hm和280nm处有较大吸收峰,氨基酸组成以脯氨酸(15.69)含量最高。PFH在广泛的pH范围具有较好的溶解性,在温度20-60范围PFH具有较低的粘度;pH对PFH的起泡性、乳化性影响较大。PFH在胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合酶条件下会发生
19、部分降解,但主要多肽成分的变化很小。 4、在严格控制水解条件下,动力学模型在一定范围内可以很好的预测反应的进行。鳕鱼蛋白的胰酶水解的动力学模型为:R=(0.1693 E0-0.2816 S0)exp|-0.357*DH|,DH=2.801 ln|1+(0.06044 E0/S0-0.1005)t|,胰蛋白酶的失活动力学常数为0.0512 min-1。鳕鱼免疫肽恒定条件时的预测模型:DH=2.801 ln1+1.35006t,可以通过预测曲线,获得免疫肽的制备时间。这对鳕鱼免疫活性肽制备有十分重要的意义。验证试验表明,当条件恒定时,实现了鳕鱼免疫肽制备的预测性,且模型理论值与实际值相符。但是当条
20、件改变时,如搅拌速率的变化、温度的波动,显著的影响了最终反应产物,模型理论值与实际值不符。 5、利用生物传感器,实现了恒定条件和动态条件下鳕鱼免疫制备的监控。恒定条件下,水解度在11-18时,与游离赖氨酸、谷氨酸呈现很好的线性关系,方程式分别为:DH=0.2225Glu-5.3097,DH=0.0126Lys-1.2275。当初始酶浓度或初始底物浓度改变时,谷氨酸、赖氨酸的响应浓度与水解度数学关系不明确,呈现无规律的曲线关系。尽管不能用统一的数学模型确定动态变化的水解反应,但是其反应临界值符合很好的的线性关系,可以用以下公式来表示:Glu=0.8186S0+0.0346E0+0.4506,Ly
21、s=0.7430S0+0.1370E0+5.2931。 6、本文利用人工神经网络(BP-ANNs)和生物传感器,建立了三个可在动态变化条件下实现在线监测的网络模型分别为:GLU-BP-ANNs的动态监控模型,LYS-BP-ANNs的动态监控模型,GLU-LYS-BP-ANNs的动态监控模型。三个模型的样本值与拟合值进行比较分析可知,R2值分别为0.9967、0.9964、0.9967,拟合误差范围分别为0-4.14、0-4.56、0-4.71,拟合平均相对误差值分别为1.06、0.94、0.99。利用模型进行五次独立的验证实验,理论值与实验值相符合,试验的相对误差范围分别为0.23-2.81,
22、0.26-1.91和0.30-2.35。三个模型在一定程度上实现了仿真监控,均可以用来监测水解反应的进程。三个网络监控模型的共性参数如下:隐含层为1层,输入层与隐层之间使用logsig传递函数,隐层与输出层之间使用线性purelin函数,网络训练函数采用trainlm,适应性学习函数采用learngdm。GLU-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、游离谷氨酸浓度Glu;输出层节点为DH:隐层节点数为10。LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的赖氨酸浓度LyS;输出层节点为DH:
23、隐层节点数为11。GLU-LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的Lys和Glu;输出层节点为DH;隐层节点数为8。 7、利用Sephadex G-25凝胶柱层析、阳离子色谱、反相高效液相色谱对鳕鱼免疫肽混合成分反复纯化,获得了三个免疫活性肽,并利用反相高效液相色谱C18分析柱纯度鉴定,得到单一对称的单峰。利用Nano-ESI-Ms/Ms分别对三个活性肽进行结构表征。免疫肽Y3的分子量为583.9922Da,为五肽,肽序列为Asn-Gly-Met-Thr-Tyr,在20g/mL时的脾细胞平均增殖率分别为35.92。免疫肽H2的分子
24、量为470.1422Da,其肽序列为Asn-Gly-Leu-Ala-Pro,为五肽,在浓度20g/mL时,脾淋巴细胞增值率平均值为32.96。免疫活性肽S4的分子量为305.1622Da,为二肽,其序列为Trp-Thr,在浓度20g/mL时,脾淋巴细胞增值率平均值为31.35。 8、本文进一步研究了PFH对正常小鼠、免疫低下小鼠的免疫机理。PFH能显著提高正常小鼠的淋巴细胞转化活性(p0.05)、迟发型变态反应(p0.05)和单核巨噬细胞的吞噬能力(p0.05),而对免疫器官指数和血清溶血素的影响较小(p0.05)。对于免疫功能低下小鼠,PFH能显著提高小鼠的免疫器官指数(P0.05);显著促
25、进小鼠的迟发型变态反应(p0.05),提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P0.05),提高小鼠的细胞免疫功能:提高血清溶血素含量(P0.05),促进小鼠的体液免疫功能;显著促进小鼠的碳廓清能力(P0.01)和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(P0.05,P0.01),促进小鼠的非特异性免疫功能。 9、在免疫肽的精制中,DA201-C树脂对PFH的吸附能力最强,静态吸附最佳条件为:温度25,pH4.0,多肽浓度10 mg/mL,树脂质量与多肽体积比(g/mL)2:1,吸附时间3 h,吸附率可达84.7。乙醇浓度为50()时,静态解析率最高为82.7。动态吸附与解析得到的脱盐多肽,脱盐率为98
26、.1,多肽回收率为90.3。脾细胞增殖实验表明DA201-C树脂脱盐后的多肽仍具有促进脾细胞增殖活性。5.【名称】一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法【申请（专利）号】CN200710014962.2【公开（公告）号】CN101233895【申请人】中国海洋大学.【发明人】李八方,刘尊英,赵雪,张朝辉.【申请日期】2007-6-16【公开（公告）日期】2008-8-6【专利说明】1.？一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法。将鳕鱼皮胶原蛋 白溶于0.02mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为3(w/v)的 溶液，调节pH值至8.5，在45水浴下，加入9
27、0ug/g碱性蛋白酶恒温搅拌 酶解，酶解过程中，采用谷氨酸氧化酶生物传感器检测酶解产物水解度及相 对分子量，谷氨酸含量与水解度的之间的回归方程为y0.7811x+5.9172， 相关系数检验r0.9658，F值为69.46。达到目标活性肽分子范围后，终止酶 解过程，超滤，低温干燥，可得到相对分子量范围在1000-10000Da的系列 活性肽。【摘要】一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法。将鳕鱼皮胶原蛋白溶于0.02mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为3(w/v)的溶液，在45水浴下，加入90g/g碱性蛋白酶恒温搅拌酶解，酶解过程中，采用谷氨酸氧化酶生物传感器检测
28、酶解产物水解度及相对分子量，谷氨酸含量与水解度的之间的回归方程为y0.7811x+5.9172，相关系数检验r0.9658，F值为69.46。达到目标活性肽分子范围后，终止酶解过程，超滤，低温干燥，可得到相对分子量范围在100010000Da的系列活性肽。本发明能实现计算机辅助控制酶解过程，可为活性肽的规模化生产提供技术支持。本发明的核心技术是采用固定化酶生物传感器测定酶解物中的谷氨酸含量，然后依此推导出水解度和活性肽相对分子量大小，并通过生物传感装置，与微机联机，实现计算机辅助控制酶解过程，获取不同相对分子量的活性肽。6.【名称】一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法【申请（专利）号】CN20
29、1210003616.5【公开（公告）号】CN102559822A【申请人】中国海洋大学.【发明人】侯虎,李八方,赵雪,张朝辉.【申请日期】2012-1-7【公开（公告）日期】2012-7-11【专利说明】一种鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为1617时终止水解而制备的。【摘要】本发明涉及一种鳕鱼免疫活性肽，及其制备的在线监控方法。所述的鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为1617时终止水解而制备的。并建立了GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型，从而对鳕鱼免疫活性肽的制备了在线监控方法。本发明确定了鳕鱼蛋白的最佳水解度，从
30、而为获得最佳免疫效果的鳕鱼免疫活性肽奠定了基础。在确定了最佳水解度后，本发明建立了在线监控方法，可以通过生物传感器-人工神经网络模型可以在线监测水解反应程度。即使当水解条件波动时，如温度、pH、搅拌速率等变化时，其仍可以准确监测水解反应的程度。因此，本发明的方法具有很好的推广应用前景。7.【篇名】利用海洋低值小杂鱼制备生物活性肽的研究【作者】陈忆凤,胡昌红,杨友山等【作者单位】江苏天福莱饲料发展有限公司,江苏连云港,222062【出处】粮食与饲料工业,CEREAL & FEED INDUSTRY2009,(3)【ISSN】1003-6202【页码】35-37【摘要】小肽是蛋白质
31、降解过程中产生的中间产物,是由210个氨基酸片断组成的活性短肽物质.小肽物质因具有高吸收性、高转化率和免疫刺激作用,作为饲料添加剂应用于水产、畜禽饲料加工.试验进行了小肽制剂最佳酶解条件方面的研究.得到的主要工艺参数有:最佳酶解时间4 h,最适加酶量480 U/g,最适酶解温度50,最适酶解pH6.0,小肽的得率为10%,并利用层析柱分离得到小肽的初级产品8.【篇名】酶解海洋生物源蛋白制备活性肽研究进展【作者】胡文婷,张凯【作者单位】海南大学海洋学院,海南省热带水生生物技术重点实验室,海南,海口,570228;海南海灵化学制药有限公司,海南,海口,570102【出处】海洋科学,MARINE S
32、CIENCES2010,34(5)【ISSN】1000-3096【页码】83-88【摘要】 海洋是地球上最大的生物储库.辽阔的海洋生长着十几万种海洋动植物,从海洋获取的鱼、虾、贝、藻等,为人类提供了丰富的海洋蛋自资源,是人类的蛋自类食物及生物活性物质的重要来源.9.【篇名】复合酶水解云南白鱼制备生物活性肽类物质【作者】张惠芬,李宝才【作者单位】昆明理工大学化学工程学院,昆明市白龙寺296号,650224;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明市白龙寺296号,650224【出处】光谱实验室,CHINESE JOURNAL OF SPECTROSCOPY LABORATORY2010,27(5)【
33、ISSN】1004-8138【页码】1942-1946【摘要】研究了复合蛋白酶对云南土著白鱼水解的工艺条件.考察了酶用量、温度、pH值、反应时间、底物浓度、复合酶比例等因素对白鱼水解的影响.确定了最佳酶解条件为:复合酶用量(木瓜蛋白酶+风味蛋白酶1:1)16000U/g,底物浓度30%,温度55,pH值7.5,时间4h.在此条件下,水解度达34.12%,氮回收率90.05%.该结果为云南白鱼生产功能食品提供科学依据.10.【篇名】可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究【作者】林伟锋【学位类型】博士【授予单位】华南理工大学,【导师】彭志英,赵谋明【年份】2003.【摘要】该文主要以沙丁鱼蛋白
34、为原料,利用可控酶解技术、超滤和离子交换法分离手段,研究制备生物活性肽的方法,并进行抗疲劳活性研究.在可控酶解工艺优化的研究中,主要研究了pH值、水解时间、蛋白酶的种类和用量、底物的初始浓度和种类、水解温度以及搅拌方式对水解效果和酶解物的分子量分布的影响.11.【篇名】草鱼蛋白源抗疲劳生物活性肽的制备分离及鉴定技术研究【作者】任娇艳【学位类型】博士【授予单位】华南理工大学,【导师】赵谋明【年份】2008.【摘要】本文以蛋白含量丰富的草鱼为原料,通过限制性酶解制备抗疲劳活性肽,同时对草鱼蛋白中具有不同溶解性的肌浆蛋白、肌原纤维蛋白及基质蛋白等的酶解特性进行了探索性研究,借助体外化学模型及动物试验
35、评价了草鱼蛋白肽的生物活性,并集成超滤、离子交换色谱、逆流色谱及凝胶色谱等多种分离技术对草鱼蛋白肽进行逐级纯化,最后以液质联用色谱结合氨基酸分析鉴定出肽的一级序列结构,并研究了抗疲劳运动肽饮料的配方及工艺。 草鱼蛋白中水溶性肌浆蛋白、盐溶性肌原纤维蛋白及不溶性基质蛋白的含量分别为33.651.71、61.422.78及3.120.87,用差示扫描量热法对草鱼蛋白进行分析知肌球蛋白、肌动蛋白热变性温度分别为51.49和76.45,而肌浆蛋白和胶原蛋白的热变性峰重叠,变性温度均为59.83。 选用木瓜蛋白酶、PTN6.0、菠萝蛋白酶、Neutrase1.5MG及Alcalase2.4L分别酶解肌浆
36、、肌原纤维和基质蛋白,筛选出三类蛋白的最适作用酶系分别为木瓜蛋白酶、PTN6.0和Alcalase2.4L,且三类蛋白酶解产物清除羟基自由基能力的顺序为：基质蛋白>肌原纤维蛋白>肌浆蛋白。将三类蛋白的最佳用酶(即木瓜蛋白酶、PTN6.0和Alcalase2.4L)复配后酶解草鱼全肉蛋白,通过响应面分析法优化酶解条件,得到最优条件下酶解物羟自由基清除率的IC50值为155.8911.21g/mL。 用6种体外化学模型综合评价草鱼蛋白酶解物(GCPHs)的抗氧化活性,结果表明其对二苯代苦味肼基自由基的清除力与GSH相当,其还原力及清除超氧阴离子自由基的能力比GSH稍弱,但其对Fe2+的
37、螯合力远远高于GSH,同时还表现出一定的抑制红细胞氧化溶血及肝脂质过氧化能力。 大鼠力竭游泳试验结果表明,GCPHs可显著延长大鼠力竭游泳时间,具显著抗疲劳作用,且能显著降低大鼠血清肌酸激酶活性,并对大鼠血睾酮含量具有显著的纠正提高作用,可维持机体内分泌平衡,GCPHs能够在一定程度上减少大鼠体内疲劳代谢产物的蓄积、增加大鼠肌糖原含量,但效果不是十分显著,说明调节机体内分泌平衡是GCPHs发挥抗疲劳作用的重要因素,而调节疲劳代谢产物及能量代谢平衡起辅助作用。 利用膜过滤及系列色谱技术对GCPHs进行逐级分离,发现酶解物中碱性组分对抗氧化活性的贡献比酸性组分大；疏水性组分对抗氧化活性的贡献比亲水
38、性组分大；分子量13 KDa的组分对抗氧化活性的贡献比分子量<1kDa的组分大。经各级纯化后,以在线连接RP-HPLC的电喷雾离子质谱(ESI-MS-MS)结合氨基酸分析鉴定出功能肽因子的一级结构为Pro-Ser-Lys-Tyr-Glu-Pro-Phe-Val,分子量966 Da。 GCPHs在中、酸性条件下可保持90以上的活性,巴氏杀菌对其活性影响也很小,且经体外模拟胃肠消化道酶液处理后其抗氧化活性仍保持为原来的71.873.16,在此基础上研究出草鱼蛋白肽运动性饮料的配方为：草鱼蛋白肽液40(v/v),生姜提取液5(v/v),枸杞、菊花及蜜枣混合提取液20(v/v),蔗糖及葡萄糖各3
39、(w/v),氯化钠约18 mmol/L,以混酸(柠檬酸钠：柠檬酸：乳酸=1:2:1)调节饮料pH至4.4,最后补水至所需体积。12.【名称】海洋低值杂鱼内源酶解生物活性肽蛋白质粉的制备方法【申请（专利）号】CN201010100411.X【公开（公告）号】CN101731453A【申请人】陈忆凤.【发明人】陈忆凤,朱勤.【申请日期】2010-1-25【公开（公告）日期】2010-6-16【专利说明】一种海洋低值杂鱼内源酶解生物活性肽蛋白质粉的制备方法，其特征在于，其步骤如下：(1)原料准备：选取海洋低值小杂鱼与/或水产品加工下脚料为原料；测定原料的内源酶活力，对于内源酶活力大于200ug/g的
40、原料，进行酶解时采用步骤(3)中的内源酶酶解工艺；对于内源酶活力小于200ug/g原料，进行酶解时采用步骤(3)中的外源酶酶解工艺；(2)一次粉碎：将原料投入粉碎机中，按原料与水的重量比11-2向原料中加入水进行浸泡解冻处理，直至原料完全散开无冻块；启动粉碎机进行粉碎，粉碎至原料100通过10目筛网，粉碎后原料浆进入原料池待用；(3)酶解：用泵将原料池中的原料浆抽入酶解罐中进行酶解；内源酶解工艺参数为：酶解时间3.2-3.7小时，酶解温度为54-56，酶解pH7.0；外源酶酶解工艺参数为：酶解时间3.8-4.2小时，加酶量为450-500/g，酶解温度为49-51，酶解pH6.0；酶解按以下方
41、法操作：向酶解罐内的原料浆中加入适量粉状氯化钙并混合均匀，使原料浆中氯化钙溶液的浓度为0.020.03mol/L；控制酶解温度，用浓度为1.0-2.0mol/L的盐酸溶液及浓度为1.0-2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，酶解的同时进行搅拌，搅拌速度为5060转/min；酶解后得到酶解物料；(4)小肽液制备：用板框压滤机或者精滤机滤除酶解物料的杂质，板框压滤机或者精滤机的滤网孔径为6080目，得初滤酶解液；将初滤酶解液加入熬煮罐进行熬煮浓缩处理，熬煮温度为95-105，熬煮至其含水量重量百分比为40-60，得小肽液；(5)混合干燥：以去皮豆粕粉为载体并将其投入混合干燥机中，然后将小肽液喷入
42、去皮豆粕粉中，混合搅拌均匀，制得水分含量重量百分比为8-15的生物活性肽蛋白质物料；(6)后处理：用旋风分离器去除生物活性肽蛋白质物料中的粉状物料后，用粉碎机进行二次粉碎，粉碎至细度达到100过60目筛，得成品生物活性肽蛋白质粉。【摘要】本发明是一种海洋低值杂鱼内源酶解生物活性肽蛋白质粉的制备方法，其特征在于，它包括原料准备、一次粉碎、酶解、小肽液制备、混合干燥和后处理等步骤。酶解时根据原料测定内源酶活力来选择酶解工艺参数；混合干燥时以去皮豆粕粉为载体，制得生物活性肽蛋白质物料。本发明方法是在原有外加蛋白酶制剂酶解的基础上进行的工艺改进，克服了外酶酶解工艺中生产成本高和外源酶酶活力不稳定、酶解
43、难以彻底的难题，极大降低了生产成本，生产工艺可实施性增强，更适合于工业化大生产，制得的成品感官、风味及养殖效果均优于鱼粉，是良好的鱼粉替代品。13.【篇名】日本刺参胶原蛋白多肽对紫外线诱导的光老化模型小鼠皮肤的保护作用【作者】王奕,王静凤,高森等【作者单位】中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛,266003【出处】中国药科大学学报,JOURNAL OF CHINA PHARMACEUTICAL UNIVERSITY2008,39(1)【ISSN】1000-5048【页码】64-67【摘要】目的:研究日本刺参胶原蛋白多肽(AJCP)对紫外线诱导的光老化模型小鼠皮肤的保护作用.方法:采用AJCP灌
44、胃紫外线诱导的光老化模型小鼠,检测小鼠血清及皮肤组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)含量;通过HE、Van Gieson染色观察皮肤组织学变化.结果:AJCP显著提高了光老化模型小鼠血清和皮肤中SOD、GSH-Px、CAT活性,降低了MDA含量(P0.05,P0.01),同时显著提高了皮肤组织中总Hyp含量(P0.01);皮肤组织的形态学观察结果表明,AJCP能有效改善小鼠皮肤胶原纤维的受损程度.结论:AJCP能显著提高机体的抗氧化能力,对紫外线诱导的光老化模型小鼠皮肤具有保护作用.14.【篇名】鸡卵清白蛋白多肽抗皮肤光老化的功能研究【作者】李欣,陈栋梁,张恒业等【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校;武汉肽类物质研究所【出处】中国食品工业,China Food Industry2011,(5)【ISSN】1006-6195【页码】76-78【摘要】本文以昆明小鼠和鸡卵清白蛋白多肽为研究对象，研究了鸡卵清白蛋白多肽对紫外线损伤的小鼠光老化皮肤的保护作