《第35章DNA的重组.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第35章DNA的重组.doc（19页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第三十五章 DNA 的重组第一节 同源重组一、Holliday 模型二、细菌的基因转移与重组致育因子（F 因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F 质粒约1/3 的基因与转移有关，traS 和traT 基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD 蛋白构成转移的通道，在TraI 在TraY 的帮助下结合到转移起点oriT 上，切开一条链，使其5端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F 质粒DNA 可以通过重
2、组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf）菌株，若F 质粒的DNA 未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+，F 质粒的DNA 可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F因子，F因子携带的基因可在受体菌表达。外源基因可以进入感受态细菌，称作转化，自然条件下感受态的形成需要10 多种蛋白质参与，实验室常用高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态。通过噬菌体将细菌基因从供体菌转移到受体菌称作转导，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌体DNA的一部分转入受体菌，称作普遍性转导，若宿主整合部位的DNA 取代了噬菌体的部分DNA 称作限制性转导。进入受体菌的基因可与染色体重组。用溶菌酶
3、除去细菌的细胞壁，人工促使原生质体融合，可引起广泛的重组。大肠杆菌染色体的基因图噬菌体的基因重组三、重组有关的酶依赖RecBCD 起始的重组模型：RecBCD 有依赖ATP 的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA 断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi 位点（GCTGGTGG），在其3侧4-6 核苷酸处将链切断，产生3游离单链，随后单链与RecA 结合，开始同源区重组。RecA 蛋白的丝状聚合体与DNA 的相互作用RecA 蛋白的带状图解RecA 蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6 个RecA 蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。RecA 蛋白引起DNA 同源重
4、组的模型在大肠杆菌中由RuvA，RuvB 和RuvC 蛋白参与的同源重组。（a）RuvA 四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。（b）RuvA/RuvB 的作用：（左）RuvA 四聚体结合到Holliday 位点；（中）RuvB 六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA 穿过其中心， RuvB 六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。（右）RuvC 结合到Holliday 位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。（c）RuvA 四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。（d）假设的RuvA 四聚体
5、与Holliday 位点结合的结构模型。第二节 特异位点重组细菌的特异位点重组沙门氏菌两种鞭毛蛋白表达的调控免疫球蛋白基因的重组IgG 的分子结构重组位点有7 和9nt 的信号序列，中间间隔12 或23bp。免疫球蛋白基因重组的模型重组酶（RAC1/RAC2）复合体与重组信号序列结合。复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列的末端形成发夹结构。重组信号序列结合形成环状结构。编码序列连接前经过加工，连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-PK）和DNA 连接酶参与了加工和连接过程。在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质。第三节 转座重组一、
6、细菌的转座因子插入因子转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp 反向重复序列组成，数字1-9 指序列重复碱基对。组合型转座子：两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。复合型转座子：插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3（TnA 家族）的结构。两端为38bp 的反向重复，其两侧为5bp 的靶序列，tnpA 编码转座酶，tnpR 编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA 形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻遏蛋白调节tnpA 和t
7、npR 两个基因的表达，res 为解离的控制位点，TnpR 蛋白结合于其上发挥调控作用。转座的方式转座子可用不同的方式转座，转座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。两个IS10 组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA 易位。当Tn10 是一个小的圆形分子的一部分时，IS10 重复序列可转座至环状分子的任一侧。插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个。复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，以致给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变。保守的转座
8、作用不造成核苷酸的丢失，如噬菌体的整合和切除。转座子引起DNA 的重排，正向重复序列的重组引起其间序列的切除或插入。反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列。转座作用可引起给体和受体的整合或分割，并可引起转座子拷贝数的增加。二、真核生物的转座因子原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性。真核生物的转座酶可以作用于任何末端具有该酶所识别的反向重复顺序的DNA，使其转移到相应的靶位点。在玉米的激活-解离系统（activator-dissociation system， Ac-Ds）中，Ac 编码转座酶（自主因子），Ds（非自主因子）是Ac 不同程度的缺失中间序列形成的，无转座酶活
9、性，但随Ac 转座后可抑制邻近基因的表达。在玉米的抑制-促进-增变系统（suppressor-promotor-mutator，Smp）中，Smp 和En（增强子）序列相似，均为自主因子，与其对应的非自主因子dSmp 为有缺陷的Smp 因子，转座后，若Smp 插入靶基因附近的合适部位，可以促进靶位点基因的表达，若Smp 插入外显子，可抑制基因的表达。玉米的控制元件形成转座子的不同家族，每个家族均有自主和非自主成员。P 品系的果蝇含有40-50 个P 因子（一种转座子）， P 因子的mRNA 前体含有3 个内含子，若P 品系雄性与M 品系雌性交配，子一代的体细胞mRNA 前体加工时保留了第3 个
10、内含子，合成阻遏蛋白，不发生转座，性细胞mRNA 前体加工时切除了全部3 个内含子，活跃的转座使性细胞失去功能。P 雄性或M雄性与P 雌性交配时，由于雌性的卵细胞质中存在抑制P 因子转座酶活性的蛋白质，子代的生殖功能正常。第四节 真核生物基因表达的转录前调控1染色体丢失：如四膜虫的大核为营养核，由小核发育而来，约10%的DNA 在发育过程中被丢失。2基因扩增：如非洲爪蟾卵母细胞的rDNA 可以大量扩增，形成1000 个以上的核仁。3基因重排:重排可以使表达的基因发生切换，也可以产生新的基因。4组蛋白的乙酰化和去乙酰化：组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4 的乙酰化不足（underac
11、etylation）是雌性哺乳动物一条X 染色体失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有关。5染色体DNA 的修饰和异染色质化：DNA 的甲基化可以使其失去转录活性，高度甲基化的DNA 可以形成高度压缩的异染色质，异染色质的基因无转录活性。6染色质结构改变模型-组蛋白置换占先模型（pre-emptive model）：决定的因素是转录因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA 复制时，组蛋白8 聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。例1：当5S rRNA 基因与组蛋白结合时TFA 不能激活此基因。而TFA 可与游离的5S rRNA 基因结合，
12、再加入组蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFD 结合，再被RNA pol 转录，如先加入组蛋白，则不起始转录，如先加入TFD 则形成的染色质中，模板仍能转录。动态模型（dynamic model）：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA 时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界。如果蝇Hsp70 启动子上的核小体在体外实行重建。GAGA（细胞核结合蛋白）转录因子与启动子中4 个富含（CT）n 位点结合，破坏了核小体，形成一高敏感区，而且导致邻接的核小体重排，这样它们就优先插入到随机位点。核小体打开的过程是需要水解ATP 的耗能过程。7细胞周期的调控最关
13、键的是两个蛋白质家族：周期素（cyclin）家族和依赖周期素的蛋白激酶（cyclin-depending proteinkinase，CDK）家族，目前发现的周期素有10 种以上，用字母A，B，C 等表示，CDK 有8 种以上，用CDK1，CDK2，CDK3 等表示。周期素A，周期素D，CDK2，CDK4 的合成受转录因子E2F 的调节，他们共同的作用控制着G1 期向S 期的转化，周期素A 和周期素B 与CDK2 的结合对有丝分裂的启动是必要的。新合成的促细胞分裂周期素与CDK 结合，形成促M 期因子（M-phase promoting factor，MPF），活化的CDK 使自身的Y15 和
14、T161 先后被磷酸化，随后细胞周期基因（cell-division-cycle gene）的产物Cdc25将Y15 的磷酸基水解，才使MPF 活化，使许多靶蛋白磷酸化，导致有丝分裂开始。活化的周期素-CDK复合物还可以激活销毁序列识别蛋白（destruction box recognizing protein，DBRP），DBRP 与周期素的销毁序列结合，随后结合泛素，使周期素被蛋白酶体降解。生长因子受体与配体结合后，其酪氨酸蛋白激酶将一系列蛋白质磷酸化，传递信号到细胞核，促进细胞增殖或分化，如Ras 蛋白可以激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitoge-activated protein ki
15、nase，MAPK），MAPK 磷酸化细胞核转录因子，促进细胞增殖。有些生长因子的受体无酪氨酸蛋白激酶活性，借助另外的激酶（just another kinase，JAK）及其底物（signal transducer and activator transcription，STAT）构成的系统传递信号，受体-Ras-Ras 和JAK-JAK 两个系统及其他系统之间存在相互作用。最早发现的癌基因鸡的肉瘤基因src 是酪氨酸蛋白激酶的变体，它无需接受生长信号，使细胞的增殖持续活化。类似的癌基因家族还有很多，如生长因子类sis，酪氨酸激酶类abl，erbB，src 等。许多因素可引起基因突变，使原癌基因转变为癌基因。抑癌基因可以阻止细胞的过分增值，或使失控的细胞死亡或凋亡。基本要求:1熟悉同源重组的机制。2熟悉特异位点重组的机制。3熟悉转座重组的机制。