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1、第三章 病 毒要点：病毒：一类超显微的、结构极其简单的、专性活细胞内寄生的、在活体外能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性的非细胞生物。病毒粒的大小以纳米来计量，常见的病毒形态有球形、杆状或丝状、蝌蚪形、砖形和弹状5种。病毒的基本结构是核衣壳，有些病毒还具有包膜、刺突等结构。病毒粒的基本成分是核酸和蛋白质。病毒的结构呈现高度对称性：即立体对称、螺旋对称、复合对称和复杂对称。噬菌体：噬菌体是发酵行业的常见病毒。根据结构可分为A、B、C、D、E、F 6种。其中A、B、C型为蝌蚪形，D、E型为球形，F型为丝状。病毒增殖过程：病毒粒子进入细胞内增殖发育成熟的全过程，大体上分为吸附、侵入与脱
2、壳、生物合成、装配和释放5个阶段。病毒增殖的一步生长曲线分为潜伏期、裂解期和平稳期3个时期。温和噬菌体：有些噬菌体侵入相应宿主细胞后，其DNA整合到宿主的核基因组上，并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制，一般情况下不进行增殖，也不引起宿主细胞裂解，这类噬菌体称为温和噬菌体。其存在形式有游离态、整合态、营养态3种。溶源菌：核基因组上整合有前噬菌体DNA并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌（或其他微生物）称为溶源菌。溶源菌的检出在发酵工业上具有重要意义。病毒的分离与鉴定：分离培养病毒可用寄主接种法、鸡胚培养法或细胞培养法，而且还必须根据不同病毒的要求进行选择，才能得到满意的结果。病毒鉴定是诊断病毒
3、性疾病的可靠方法，也是病毒分类的前提。包涵体：某些细胞在感染病毒后，出现于细胞质或细胞核内的，在光镜下可见的，大小、形态和数量不等的小体称为包涵体。它可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。亚病毒：亚病毒包括类病毒、卫星病毒、卫星RNA以及朊病毒。在亚病毒中，仅类病毒和朊病毒能独立复制，卫星病毒及卫星RNA必须依赖辅助病毒进行复制。非细胞生物包括病毒和亚病毒。病毒(virus)是一类体积非常微小、结构极其简单、性质十分特殊的生命形式。与其他生物相比，它们具有下列基本特征： （1）形体极其微小。一般都能通过细菌滤器，故必须在电镜下才能观察。 （2）缺乏独立代谢能力。只能利用宿主活细胞内
4、现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质组分，再以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现其大量增殖。无个体生长，无二均分裂繁殖方式。 （3）没有细胞结构。病毒被称为“分子生物”，其化学成分较简单，主要成分仅核酸和蛋白质两种，而且只含DNA或RNA一类核酸。尚未发现一种病毒兼含两类核酸的。 （4）对一般抗生素不敏感，而对干扰素敏感。 （5）具有双重存在方式。在活细胞内营专性寄生，在活体外能以化学大分子颗粒状态长期存在并保持侵染活性。病毒既是一种致病因子，也是一种遗传成分。几乎所有的细胞型生物，包括微生物、植物、动物及人类都发现有病毒，不过就某类病毒而言，它具有宿主的特异性。人们习惯根据其宿主种类将病毒分为
5、微生物病毒、植物病毒和动物病毒。20世纪70年代以来，陆续发现了比病毒更小、结构更简单的亚病毒，亚病毒包括类病毒、卫星病毒、卫星RNA和朊病毒。可以认为，病毒是一类超显微的、结构极其简单的、专性活细胞内寄生的、在活体外能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性的非细胞生物。第一节 病毒的形态结构和化学组成一、病毒的大小及形态（一）病毒的大小成熟的具有侵染能力的病毒个体称为病毒粒子（Virion）。病毒粒子的大小以纳米（nm）来计量。各种病毒的大小相差悬殊，一般分为大、中、小三种。较大的病毒如痘病毒，其体积为300nm200nm100nm；中等大的病毒如流感病毒，其直径为90120nm；
6、小型的病毒直径仅20nm，如口蹄疫病毒。绝大多数病毒直径都在150nm以下。病毒的大小可借分级过滤、电泳、超速离心沉降、电镜观察等方法测定。（二）病毒的形态病毒粒子的形态大致可分为5类（图3-1）：1. 球形 人、动物、真菌的病毒多为球形，其直径2030nm不等，如腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、花椰菜花叶病毒、噬菌体MS2等。2. 杆状或丝状 是某些植物病毒的固有特征，如烟草花叶病毒、苜蓿花叶病毒，甜菜黄化病毒等。人和动物的某些病毒也有呈丝状的，如流感病毒、麻疹病毒、家蚕核型多角体病毒等，其丝长短不一，直径1522nm，长度可达70nm。3. 蝌蚪状 是大部分噬菌体的典型特征。有一个六角形
7、多面体的“头部”和一条细长的“尾部”，但也有一些噬菌体无尾。4. 砖形 这是各类痘病毒的特性。病毒粒子呈长方形，很像砖块。其体积约300nm200nm100nm，是病毒中较大的一类。5 弹状 见于狂犬病毒、动物水泡性口腔炎病毒和植物弹状病毒等。这类病毒粒子呈圆筒形，一端钝圆，另一端平齐，直径约70nm，长约180nm，略似棍棒。病毒的大小及形态特征，可供鉴定病毒时参考。图3-1 常见病毒粒的形态和大小二、病毒的结构、化学成分及其功能病毒粒的基本结构主要包括两部分，即核心与衣壳。除此之外，有些较为复杂的病毒还具有包膜、刺突等结构（图3-2）。病毒粒的基本化学成分是核酸和蛋白质，有的病毒还有脂类、
8、糖类等其他成分。图3-2 病毒粒子的结构断面（模式）左：无包膜正二十面体对称的核衣壳病毒粒子右：带包膜螺旋对称的核衣壳病毒粒子（一）病毒的核心病毒的核心（Viral core）是病毒粒子的内部中心结构。核心内有单链或双链的核酸（DNA或RNA），还有少量功能蛋白质（病毒核酸多聚酶和转录酶）。共同特点是，任何一种病毒粒子核心内只含有一种类型的核酸，DNA或RNA，绝不混合含两种核酸。DNA或RNA构成病毒的基因组，包含着该病毒编码的全部遗传信息，能主导病毒的生命活动，控制病毒增殖、遗传、变异、传染致病等作用。（二）病毒的衣壳病毒的衣壳，是包围在病毒核心外面的一层蛋白质结构，由数目众多的蛋白质亚单
9、位（多肽）按一定排列程序组合而成。这些亚单位称为衣壳粒，彼此呈对称形排列。每一个衣壳粒，可由一个或几个多肽组成。衣壳的功能除能保护核心内的病毒核酸免受外界环境中不良因素（如DNA酶和RNA酶）的破坏外，还具有对宿主细胞特别的亲和力，又是该病毒的特异性抗原。核心和衣壳合称核衣壳，它是任何病毒粒子都具有的的基本结构。（三）病毒的包膜有些病毒在衣壳外面附有一种双层膜，称为包膜(Viral envelope)或囊膜，它的主要成分是蛋白质、多糖和脂类。其成分主要来自宿主细胞，是病毒在感染宿主细胞“出芽”时从细胞膜或核膜处获得的。图3-3 病毒的包膜结构（流感病毒）包膜上的蛋白质由很多亚单位（多肽）与多糖
10、、脂类呈共价结合，常组成糖蛋白亚微结构。嵌附在脂质层中向外突出，称为包膜粒（peplomer）（突起），例如流感病毒包膜上有两种包膜粒，即血凝素和神经氨酸酶（图3-3）。但有些病毒包膜虽有糖蛋白及脂质，但无包膜粒。由于有包膜的病毒都含有脂质，易被乙醚溶解。另外，有某些病毒，例如腺病毒（图3-4），在病毒体外壳20面体的各个顶角上有触须样纤维突起，顶端膨大，它能凝集某些动物的红细胞和毒害宿主细胞。这些突起与病毒的包膜粒一起称做刺突（spike）。病毒包膜有维系病毒粒结构，保护病毒核衣壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。 图3-4 腺病毒体的表面结构模式三
11、、病毒结构的对称性用电镜观察发现病毒的结构呈现高度对称性：即立体对称、螺旋对称、复合对称及复杂对称。立体对称与螺旋对称是病毒的两种基本结构类型，复合对称是前两种对称的结合。立体对称、螺旋对称和复合对称分别相当于球形、杆状和蝌蚪状这3种形态的病毒。所有DNA病毒除痘病毒外为立体对称，RNA病毒有立体对称，也有螺旋对称，噬菌体及逆转录病毒多数呈复合对称，痘病毒属于复杂对称型。(一)立体对称有些病毒的外形呈“球状”，实际上是一个立体对称的多面体，一般为二十面体。它由20个等边三角形组成，具有12个顶角，20个面和30条棱。腺病毒（图3-4）是二十面体对称的典型代表。二十面体病毒有的也具有包膜。(二)
12、螺旋对称有些病毒粒子呈杆状或丝状，其衣壳形似一中空柱，电镜观察可见其表面有精细螺旋结构。在螺旋对称衣壳中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，能够控制螺旋排列的形式及衣壳长度，核酸与衣壳的结合也增加了衣壳结构的稳定性。烟草花叶病毒(TMV)(图3-5)是螺旋对称的典型代表。 图3-5 烟草花叶病毒的结构示意图 图3-6 大肠杆菌T4噬菌体结构模式图(三)复合对称大肠杆菌T4噬菌体（图3-6）是复合对称的代表，由二十面体的头部与螺旋对称的尾部复合构成，呈蝌蚪状。头部蛋白质衣壳内有线状双链DNA构成的核心。在头尾相连处有颈部，由颈环和颈须构成，颈须的功能是裹住吸附前的尾丝。尾部由尾管、尾鞘、基板
13、、刺突和尾丝构成。尾管中空，是头部DNA进入宿主细胞的通道。尾鞘由24圈螺旋组成。基板是六角形盘状结构，上面有6个刺突和6根尾丝，均有吸附功能。逆转录病毒内部是螺旋形的核心，外部是二十面体的外壳，是复合对称型病毒。(四)复杂对称痘病毒科的病毒对称性比较复杂，病毒粒子通常呈卵圆形，干燥的病毒标本呈砖形。在病毒体表面有双层膜，在病毒中心为哑铃状的核心，核心内含有蛋白质和核酸，核酸为双链DNA，线形。在核心两侧为侧面小体。四、病毒的群体形态虽然病毒粒无法用光镜观察到，但当它们大量聚集并使宿主细胞发生病变时，就形成了具有一定形态、构造并能用光镜加以观察和识别的特殊“群体”，例如动、植物细胞中的病毒包涵
14、体；有的还可以用肉眼观察，例如由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌斑，由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑以及由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑等。病毒的这类“群体”形态对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等许多实际工作具有一定的意义。五、噬菌体噬菌体(phage，bacteriophage)即原核生物病毒，包括噬细菌体、噬放线菌体和噬蓝细菌体等。噬菌体具有其他病毒的共同特性：体积小，结构简单，有严格的寄生性，必须在活的易感宿主细胞内增殖。噬菌体分布广，种类多，目前已成为研究分子生物学的一种重要实验工具，其危害主要存在于发酵工业中。根据外形，噬菌体可分为蝌蚪形、球形、丝状3种。根据结构又可分为
15、A、B、C、D、E、F 6种。其中A、B、C型均为蝌蚪形，D、E型均为球形，F型为丝状。（图3-7，表3-1）图3-7 各型噬菌体的形态结构模式噬菌体的化学成分主要是核酸和蛋白质，后者组成尾部和头部的外壳。核酸为噬菌体的遗传物质，已知有DNA噬菌体和RNA噬菌体。在大多数DNA噬菌体中，多数是dsDNA，只有少数是ssDNA。至今发现的RNA噬菌体中只有ssRNA。表3-1 噬菌体的形态特征及其宿主形态及特征大肠杆菌噬菌体举例其他菌种噬菌体形态类型特 征蝌蚪形A型dsDNA，收缩性尾T2、T4、T6假单胞菌属：12S，PB-1芽孢杆菌属：SP-50粘球菌属：MX-1沙门氏菌属：66tB型dsD
16、NA，非收缩性长尾T1、T5、假单胞菌属：PB-2棒杆菌属：B链霉菌属：K1C型dsDNA，非收缩性短尾T3、T7假单胞菌属：12B土壤杆菌属：PR-1001芽孢杆菌属：GA/1沙门氏菌属：P22球形D型ssDNA，无尾，大顶衣壳粒X174沙门氏菌属：RE型ssRNA，无尾，小顶衣壳粒f2，MS2，QB假单胞菌属：7S，PP7柄细菌属的某些噬菌体丝状F型ssDNA，无头尾fd，f1，M13假单胞菌属的某些噬菌体第二节 病毒的增殖病毒的增殖是病毒基因组在宿主细胞内复制与表达的结果，它完全不同于其他微生物的繁殖方式，又称为病毒的复制。病毒由于缺乏完整的酶系统，不能单独进行物质代谢，必须在易感的活细
17、胞中寄生。由宿主细胞提供病毒合成的原料、能量和场所。一、病毒增殖的一般过程病毒粒子进入细胞内增殖发育成熟的全过程，大体上分为吸附、侵入与脱壳、生物合成、装配、释放5个阶段。不同病毒的增殖过程在细节上有所差异。噬菌体的增殖方式见图3-8。（一）吸附吸附是指病毒以其表面的特殊结构与宿主细胞的病毒受体发生特异性结合的过程，这是发生感染的第一步。病毒吸附蛋白(VAP)是病毒表面的结合蛋白，它能特异性识别宿主细胞上的病毒受体并与之结合。如流感病毒包膜表面的血凝素，T偶数噬菌体的尾丝蛋白。病毒受体是宿主细胞的表面成分，能够被病毒吸附蛋白特异性识别并与之结合，介导病毒侵入。如狂犬病毒的受体是细胞表面的乙酰胆
18、碱受体，单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素。噬菌体以其尾丝尖端的蛋白质吸附于菌体细胞表面的特异性受体上。如T3、T4和T7噬菌体吸附的特异性受体是脂多糖；T2和T5噬菌体的受体为脂蛋白；沙门氏菌的X噬菌体吸附在细菌的鞭毛上。吸附作用受许多内外因素的影响，如细胞代谢抑制剂、酶类、脂溶剂、抗体，以及温度、pH值、离子浓度等。（二）侵入与脱壳侵入是指病毒或其一部分进入宿主细胞的过程。侵入的方式因病毒或宿主细胞种类的不同而异。有伸缩尾的T偶数噬菌体吸附于宿主细胞后，尾丝收缩使尾管触及细胞壁，尾管端携带的溶菌酶溶解局部细胞壁的肽聚糖。接着通过尾鞘收缩将尾管推出并将头部核酸迅速注入到细胞内，其蛋白质衣壳留在
19、菌体外。动物病毒侵入宿主细胞有3种方式：膜融合，病毒包膜与宿主细胞膜融合，将病毒的内部组分释放到细胞质中，如流感病毒；利用细胞的胞吞作用，多数病毒按此方式侵入；完整病毒穿过细胞膜的移位方式，如腺病毒。植物病毒的侵入通常是由表面伤口或咬食的昆虫口器感染，并通过胞间连丝、导管和筛管在细胞间乃至整个植株中扩散。脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或衣壳被除去而释放出病毒核酸的过程。脱壳的部位和方式随病毒种类的不同而异。大多数病毒在侵入时就已在宿主细胞表面完成，如T偶数噬菌体；有的病毒则需在宿主细胞内脱壳，如痘病毒需在吞噬泡中溶酶体酶的作用下部分脱壳，然后启动病毒基因部分表达出脱壳酶，在脱壳酶作用下完全脱
20、壳。（三）生物合成图3-8 T4噬菌体的裂解周期生物合成指病毒在宿主细胞内合成病毒蛋白质，并复制核酸的过程。此过程可分为三个连续的阶段：病毒早期基因的表达；病毒基因组的复制；病毒晚期基因的表达。1. 病毒蛋白质的合成病毒粒子在细胞内脱壳后，释放出DNA或RNA。这些DNA或RNA转入细胞核中或仍留在细胞质内。若是DNA病毒，其基因组作为模板进行转录成具有特定信息的RNA即mRNA。mRNA转移到细胞的核糖体上进行转译，合成病毒蛋白质。若是RNA病毒，其RNA正链可直接作为mRNA进行蛋白质的合成。病毒早期转译的蛋白质，主要是参与病毒核酸复制及转录，以及改变或抑制宿主细胞的正常代谢的功能性蛋白质
21、。晚期转译的蛋白质种类较多，其中主要是构成子代病毒粒的结构蛋白质。2. 病毒核酸的复制根据病毒核酸的类型以及复制、转录方式的不同可分为6类，如图3-9所示。（四）装配装配就是在病毒感染的细胞内，将分别合成的病毒核酸和蛋白质组装为成熟病毒粒子的过程。1. 噬菌体的装配T4噬菌体装配过程（图3-10）较复杂，主要步骤有：DNA分子的缩合，通过衣壳包裹DNA而形成完整的头部，尾丝和尾部的其他“部件”独立装配完成，头部和尾部相结合后，最后装上尾丝。图3-9 不同核酸类型病毒在宿主内mRNA的合成方式图3-10 T偶数噬菌体装配示意图图3-11 TMV病毒的装配模式2. 动物病毒的装配无包膜的动物病毒组
22、装成核衣壳即为成熟的病毒体，有包膜的动物病毒一般在核内或细胞质内组装成核衣壳，然后以出芽形式释放时再包上宿主细胞核膜或质膜后，成为成熟病毒。3. 植物病毒的装配TMV等杆状病毒是先初装成许多双层盘，然后因RNA嵌入和pH降低等因素而变成双圈螺旋，最后由它聚合成完整的杆状病毒（图3-11）。球状病毒则是靠一种非专一的离子相互作用而进行的自体装配体系来完成的。它们的核酸能催化蛋白亚基的聚合和装配，并决定其准确的二十面体对称的球状外形。（五）释放释放是指病毒粒子从被感染的细胞内转移到外界的过程。主要有两种方式：破胞释放和芽生释放。1. 破胞释放无包膜病毒在细胞内装配完成后，借助自身的降解宿主细胞壁或
23、细胞膜的酶，如噬菌体的溶菌酶和脂肪酶、流感病毒包膜刺突的神经氨酸酶等裂解宿主细胞，子代病毒便一起释放到胞外，宿主细胞死亡。2. 芽生释放有包膜的病毒在宿主细胞内合成衣壳蛋白时，还合成包膜蛋白，经添加糖残基修饰成糖蛋白，转移到核膜、细胞膜上，取代宿主细胞的膜蛋白。宿主核膜或细胞膜上有该病毒特异糖蛋白的部位，便是出芽的位置。在细胞质内装配的病毒，出芽时外包上一层质膜成分。若在核内装配的病毒，出芽时包上一层核膜成分。有的先包上一层核膜成分，后又包上一层质膜成分，其包膜由两层膜构成，两层包膜上均带有病毒编码的特异蛋白、血凝素、神经氨酸酶等，宿主细胞并不死亡。有些病毒如巨细胞病毒，往往通过胞间连丝或细胞
24、融合方式，从感染细胞直接进入另一正常细胞，很少释放于细胞外。二、一步生长曲线一步生长曲线(one-step growth curve)是研究病毒复制的一个实验，最初为研究噬菌体复制而建立，现已推广到动物病毒及植物病毒复制的研究中。具体操作是将适量病毒接种于高浓度敏感细胞培养物，或高倍稀释病毒细胞培养物，或以抗病毒血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，以感染时间为横坐标，病毒的效价为纵坐标，绘制出的病毒特征曲线，即为一步生长曲线。一步生长曲线分为潜伏期、裂解期和平稳期(图3-12)。（一）潜伏期潜伏期(1atent period)是指病毒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒所需的最短时间。不同病毒
25、潜伏期长短不一，噬菌体一般有几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。图3-12 T4噬菌体的一步生长曲线人为裂解病毒感染细胞，在潜伏期前一阶段，受染细胞内检测不到感染性病毒，在后一阶段感染性病毒在受染细胞内数量急剧增加。病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病毒的时期为隐蔽期(eclipse period)。（二）裂解期在潜伏期后，病毒效价急剧增加，这是新合成的病毒核酸和蛋白质装配成大量病毒粒子，并释放的结果。潜伏期后宿主细胞裂解释放出大量子代病毒的时期称为裂解期(rise phase)或成熟期。（三）平稳期裂解期末，受染细胞将子代病毒粒子全部释放出来，病毒效价稳定在最高处的时期，称为平
26、稳期(plateau phase)。裂解量(burst size)是指每个受染细胞产生的子代病毒粒子的平均数目，其值等于平稳期受染细胞释放的全部子代病毒粒子数除以潜伏期受染细胞的数目，即平稳期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。裂解量取决于病毒和宿主细胞。不同病毒有不同的裂解量，噬菌体的裂解量一般几十到几百个，而植物病毒和动物病毒一般为几百到几万个。三、温和噬菌体与溶源菌（一）烈性噬菌体和温和噬菌体大部分噬菌体感染宿主细胞后，能迅速在宿主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体并引起宿主细胞裂解，这类噬菌体称为烈性噬菌体。有些噬菌体侵入相应宿主细胞后，其DNA整合到宿主的核基因组上，并可长期随宿主DNA的复制
27、而进行同步复制，一般情况下不进行增殖，也不引起宿主细胞裂解，这类噬菌体称为温和噬菌体。温和噬菌体侵染敏感细胞后与细胞共存的特性称溶源性。温和噬菌体的存在形式有3种：游离态：指游离的具有侵染性的成熟病毒粒子；整合态：指整合在宿主基因组上的前噬菌体状态；营养态：前噬菌体经外界理化因素诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。温和噬菌体有很多种，如大肠杆菌噬菌体，大肠杆菌Mu-1、Pl和P2噬菌体，鼠伤寒沙门氏菌的P22等噬菌体。温和噬菌体一般用括号表示，写在宿主细菌株号的后面。如Ecoli K12()，表示噬菌体是一种温和噬菌体，寄生在大肠杆菌K12菌株细胞。（二）溶源菌溶源菌是指
28、在核基因组上整合有前噬菌体DNA并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌（或其他微生物）。溶源菌具有如下基本特性：稳定性：溶源菌通常很稳定，将整合到自己DNA上的前噬菌体作为其遗传结构的一部分，随宿主DNA同步复制，能够经历很多代。免疫性：溶源菌对同源噬菌体具有免疫性，这种免疫性具有高度的特异性。裂解：溶源菌中少数(10-310-5)前噬菌体自发脱离宿主细胞染色体，进行增殖，导致细胞裂解。这种现象称为溶源菌的自发裂解。经紫外线、X射线、氮芥、丝裂霉素等理化因子处理而发生的高频率裂解现象，称诱导或诱发裂解。复愈：有极少数（10-5）溶源菌增殖过程中会丧失其前噬菌体，成为非溶源性菌，这一过程称为复愈或非溶
29、源化，复愈后的细胞其免疫性也随之丧失。溶源转变：噬菌体DNA整合到宿主核基因组中而改变了宿主的基因型，使宿主某些性状发生改变，称溶源转变。溶源菌的检出在发酵工业上具有重要的意义。一般可将少量待测菌与大量敏感性指示菌（溶源菌裂解后释放出的温和噬菌体可使之发生裂解性周期者）混合，涂布于琼脂平板上。培养一段时间后，溶源菌可长出菌落。由于溶源菌在生长过程中有极少数个体会发生自发裂解，产生的噬菌体可侵染溶源菌周围敏感性指示菌菌苔，这样会产生一个个中央为溶源菌小菌落、周围有透明圈的特殊噬菌斑（图3-13）。也可先用紫外线照射生长的待测菌株，以诱导前噬菌体裂解，并进一步培养及滤去培养物中的活细菌。然后将滤液
30、与敏感菌混合培养。若所测菌株为溶源菌，由于紫外线诱发裂解产生的噬菌体可侵染敏感性指示菌菌苔，而形成一个个透明的噬菌斑。图3-13 溶源菌及其特殊噬菌斑四、理化因素对病毒的作用理化因素包括热、辐射、pH和化学试剂等对病毒的灭活作用，改变和破坏病毒核酸，使其失去转录和翻译的功能；或者是改变和破坏病毒蛋白衣壳或脂质等结构，从而消除病毒的感染性。但是经灭活的病毒可继续保持其抗原性以及诱导产生干扰素。了解各种理化因素对病毒的灭活作用，有着重要的实际意义。由于不同病毒对各种理化因子的敏感性不同，因此在消毒时必须针对该病毒特点，选择最为有效的消毒剂。相反，在保存毒种或病毒材料时，则必须注意防止和避免各种灭活
31、条件。病毒对不同理化因素的抵抗力，也是鉴定病毒的一个重要依据。（一）温度病毒喜冷怕热。大多数病毒可在4以下良好地生存，特别是在干冰温度(-70)和液氮(-196)下更可长期保持其感染性。相反地，大多数病毒可在5560条件下几分钟到十几分钟内灭活，100可在几秒钟内灭活。因此必须低温保存病毒和疫苗等。必须指出，各种病毒对热的抵抗力不同，甚至有着明显的差异。例如黏病毒和RNA肿瘤病毒等具有包膜的病毒，感染半衰期为37 1h，而痘病毒在干燥状态下，却可耐受100加热510min。热对病毒的灭活作用，受周围环境因素的影响。蛋白质以及钙、镁等离子的存在，常可提高某些病毒对热的抵抗力。长期保存病毒一般采用
32、下述两种方法：1. 快速低温冷冻 于病毒液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加入510的二甲基亚砜，并迅速冷冻和保存于-70-196。对含病毒的组织材料可以直接低温冷冻保存，如有些病毒可先浸入50的甘油缓冲盐水中，再行低温保存，效果更好。2. 冷冻干燥 在真空条件下使冰冻病毒悬液脱水（通常是冷冻真空干燥），可保存几年甚至几十年，毒力不变。毒种的保护剂：一般用脱脂牛乳、经灭活的动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥时，将病毒液加等量保护剂，每支装0.20.5ml，放入冻干机内冷冻。现代冻干机具有冷冻、干燥、抽真空等全部装置，使用十分方便。（二）pH值大多数病毒在pH68的范围内保持稳定
33、。在pH5.0以下的酸性环境中，以及pH9.0以上的碱性环境中，病毒大多迅速灭活。酸、碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂。例如，实验室常用1的盐酸溶液浸泡玻璃器皿和塑料制品，如吸管、微量培养板、滴定板等。常用烧碱作环境消毒剂。贮存病毒，以中性或微碱性为宜，例如病毒病料置中性的50甘油盐水中保存。但是必须指出，各种病毒对pH变化的稳定性可能显著不同。例如呼肠孤病毒能够抵抗pH 3.0；口蹄疫病毒在pH 6.06.5及pH 8.09.0迅速灭活；猪水泡病病毒在pH2.2条件下24h内仍保持其感染性。因此pH的稳定性，是鉴定某些病毒的一个重要指标。根据某些病毒的耐酸性能，病毒实验室已经成功地应用酸性解
34、离方法从病毒-抗体复合物中分离感染性病毒。例如，1983年Pinheiro氏等将脊髓灰质炎病毒-抗体复合物的pH降至2.5，分离获得了感染性病毒。（三）辐射电离辐射中的射线和X射线以及非电离辐射紫外线，都对病毒呈现灭活作用。其原因是它们可以破坏病毒核酸的分子结构，使其失去生物活性。（四）超声波和光动力作用超声波主要以强烈振荡对细菌和其他微生物以及细胞等呈现破坏作用，但对病毒的灭活作用并不明显。常用超声波破坏细胞，使病毒粒子从细胞内释放，以便收获和提纯病毒。有些病毒核酸被染料（如甲苯胺蓝、啶橙）作用后，就能被可见光灭活，称为染料的光动力作用。（五）脂溶剂乙醚、氯仿和丙酮等脂溶剂对有包膜的病毒具有
35、灭活作用。乙醚等灭活试验是鉴定病毒的一个重要指标。（六）甘油和抗生素应用50的甘油盐水，大多数细菌被杀灭，但病毒可以存活数日，甚至几年。生产实践中常用50甘油盐水保存病毒材料，同时采取冷藏措施，效果较为理想；一般的抗生素物质如青霉素、链霉素、土霉素对病毒无作用，故常将青霉素、链霉素等加入到含有病毒的材料中去，以杀死细菌而有利于病毒的分离与培养。近年来，人们已发现一些抗生素对病毒有作用，有的已用在病毒病的预防和治疗上，如金刚铵、利福霉素、放线菌素D等。第三节 病毒学研究的基本方法一、标本的采集和处理用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病毒感染的特征、流行病学规律
36、以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。标本采集必须无菌操作，如有细菌污染，可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般应立即接种。若需要运送或保存，数小时内可置于50中性甘油内4保存，对需较长时间冻存的标本最好置于-20以下或干冰保存。以感染病毒的动物病料采集为例，一般说来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以了解抗体滴度的变化。二、病毒的分离培养病毒与细
37、菌不同，病毒是严格的活细胞内寄生的，因此分离培养病毒应采用寄主接种法、鸡胚培养法或细胞培养法，而且还必须根据不同病毒的要求进行选择，才能得到满意的结果。（一）寄主接种法分离的标本接种于实验寄主的种类和接种途径主要取决于病毒寄主范围和组织嗜性，同时还应考虑操作、培养及结果判定的简便。噬菌体标本可接种于生长在培养液或培养基平板中的细菌培养物。植物病毒标本可接种于敏感植物叶片，产生坏死斑或枯斑。动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部位，嗜神经病毒接种于动物脑内，嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔。常用动物有小白鼠、大白鼠、地鼠、家兔和猴子等。在兽医病毒学实践中，还常用本动物进行实验感染试验。例如，应用健康马驹
38、作马传染性贫血病毒接种试验；应用健康猪、鸡分别作猪瘟病毒、鸡新城疫病毒接种试验等等。接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发病情况，根据动物出现的症状，初步确定是否有病毒增殖。（二）鸡胚培养法不同的病毒可选择不同日龄的鸡胚和不同的接种途径，如痘病毒接种于1012d的鸡胚绒毛尿囊膜上，鸡新城疫病毒宜接种在10d尿囊腔和羊膜腔内，虫媒病毒宜接种于5d卵黄囊，继续培养观察。（三）细胞培养法用机械方法或胰蛋白酶等方法将离体的活组织分散成单个的细胞，在平皿中制成贴壁的单层细胞，然后铺上动物病毒悬液进行培养。细胞培养是目前最常用的方法。三、病毒的鉴定病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法，也是病毒分类的前提。一般
39、可通过以下方法确证病毒的存在：(一)病毒的群体形态特征图3-14 噬菌斑1.噬菌斑 2.菌苔1. 噬菌斑噬菌斑(plaque)测定一般采用双层平板法，将一定量经稀释的噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基(1琼脂)混合均匀后，然后倒入含底层琼脂培养基(2琼脂)的平板，经过一段时间培养后，在细菌菌苔上会出现一个个圆形局部透明区域，即噬菌斑（图3-14)。可以认为，每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果，一个噬菌斑中的噬菌体遗传性都相同，故通过多次重复接种，可获得纯系噬菌体。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的大小、形状、边缘和透明度，故可作为鉴定的指标。此外，噬菌斑亦可用于病毒的定量。2. 空斑和感染
40、病灶一些动物病毒在动物细胞或组织培养系统培养时，由于病毒感染细胞裂解，出现与噬菌斑类似的空斑或称蚀斑。如果是肿瘤病毒，细胞不是被溶解，而是生长速率增加，导致受感染细胞堆积起来形成类似于菌落的感染病灶。3. 枯斑一些植物病毒会在茎、叶等植物组织上形成一个个褪绿或坏死的斑块称枯斑或坏死斑。（二）血凝现象及干扰现象血凝现象是指许多病毒能吸附于一定种类哺乳动物或禽类的红细胞表面而产生凝集的现象。如流感病毒、天花病毒等。可根据病毒凝集的血细胞种类及凝集条件不同而鉴定病毒。两种不同的病毒同时或先后感染同一宿主细胞时，一种病毒抑制另外一种病毒增殖的现象，称为病毒的干扰现象(interference)。如乙型
41、脑炎病毒能干扰脊髓灰质炎病毒，流感病毒能干扰西方型马脑炎病毒的增殖等。若在某一组织细胞培养物中同时加入接种物及可被干扰的病毒，若后者被抑制，则可间接判断接种物中存在可干扰后者的病毒。（三）细胞病变效应 是指病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的明显表现，例如细胞发生凝缩、团聚、肿大，细胞融合形成多核现象，细胞脱落、裂解，细胞内出现包涵体等。用于细胞培养的标本一般以细胞病变效应作为病毒感染的指标。细胞病变是特定的病毒与细胞相互作用的结果，不同病毒感染同一细胞时可能呈现不同的细胞病变效应，同一病毒在不同的细胞上也可引起不同的效应。此外，培养液成分、温度、病毒感染时细胞年龄等也会对细胞病变效应(CPE
42、)产生影响。 1细胞融合现象 细胞融合现象(phenomenon of cell fusion)是指由于病毒感染宿主细胞而出现的多核细胞现象。其发生决定于病毒和细胞的种类，也受病毒数量、温度、离子强度等因素的影响。如仙台病毒可在Hela细胞、猪肾继代细胞内引起细胞融合，但不能在人的二倍体成纤维细胞中诱发融合现象。2.包涵体某些细胞在感染病毒后，出现于细胞质或细胞核内的，在光镜下可见的，大小、形态和数量不等的小体称为包涵体(Inclusion body)。包涵体可以是病毒粒子的聚集体，如昆虫核型多角体病毒、质型多角体病毒的包涵体和腺病毒的包涵体；也可以是病毒结构蛋白与感染有关的蛋白质等病毒组分的
43、聚集体，如人类巨细胞病毒的致密体(dense body)等。由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。例如，烟草花叶病毒与马铃薯Y病毒的形态极其相似，但它们的包涵体形态截然不同，前者为三角形，后者为矩形；狂犬病病毒在病犬大脑海马角、小脑、延及的神经细胞的细胞质内形成嗜酸性圆形或卵圆形的内基氏小体(Negri)，可用Seller氏染色法染色镜检。（四）其他鉴定方法利用电镜技术及热、紫外线、脂溶剂等理化因子对病毒感染性的作用，病毒组分的分子量、沉降系数、核酸类型等的测定，也可用于病毒的鉴定。建立在抗原抗体特异性
44、反应基础上的免疫学方法也是病毒鉴定的一类常见方法。此外，通过分子杂交、序列测定、PCR等分子生物学方法鉴定病毒也有重要意义。四、病毒定量的几个概念（一）病毒感染单位能够引起宿主或宿主细胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量称病毒感染单位（IU)。（二）病毒的效价或毒力病毒的效价是指单位体积(ml)病毒悬液的感染单位数目(IUml)或称毒力。噬菌体的效价是指能使感染细菌裂解，产生噬菌斑的噬菌体数，或形成噬菌斑单位数（pfu)。因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过100，所以根据噬菌斑或空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌体电镜下直接计数低。pfu与噬菌体的真实数目之比即成斑率(EoP)。（三）半致死剂量使
45、半数宿主细胞死亡的病毒剂量称半致死剂量(LD50)。（四）半数感染剂量使半数宿主细胞发生感染的病毒剂量称半数感染剂量(ID50)。（五）半数组织培养感染剂量使半数组织培养物发生感染，产生细胞病变效应的病毒剂量称半数组织培养感染剂量(TCID50)。第四节 亚 病 毒亚病毒包括类病毒、卫星病毒、卫星RNA以及朊病毒。在亚病毒中，仅类病毒和朊病毒能独立复制，卫星病毒及卫星RNA必须依赖辅助病毒进行复制。一、类病毒类病毒(viroid)是由单链共价闭合环状RNA分子组成，类病毒相对分子质量为O.71051.2105，大小仅为最小病毒的120，这种RNA能在敏感细胞内自我复制，不需要辅助病毒，其结构和
46、性质都与已知病毒不同，故名类病毒。马铃薯纺锤形块茎病类病毒(PSTV)是发现的第一个类病毒，它是由359个核苷酸组成的单链环状RNA分子，是由高度碱基配对的双链区与未配对的环状区相间排列而成的杆状构型(图3-15)。图3-15 马铃薯纺锤形块茎病类病毒(PSTV)的结构类病毒RNA能自我复制，但不能编码蛋白质，迄今已知的类病毒只存在于高等植物中，其核酸都是RNA型，如马铃薯纺锤形块茎病类病毒、柑橘裂皮病类病毒(CEV)、鳄梨白斑类病毒(ASBV)等。类病毒的传染力很强，但大多数呈不显性感染。Singh氏等(1973年)发现11个科的138种植物能够感染类病毒，但只有茄科和菊科的12种植物呈现症
47、状。类病毒感染的第二个特点是潜伏期很长，马铃薯在感染后几个月甚至第二代才出现块茎呈纺锤形的症状，严重减产。二、卫星病毒卫星病毒(satellite virus)是一类基因组缺损、需要依赖辅助病毒，基因才能复制和表达，才能完成增殖的亚病毒。如大肠肝菌噬菌体P4，缺乏编码衣壳蛋白的基因，需辅助病毒大肠杆菌噬菌体P2同时感染，且依赖P2合成的壳体蛋白装配成含P2壳体13左右的P4壳体，与较小的P4 DNA组装成完整的P4颗粒，完成增殖过程。丁型肝炎病毒(HDV)必须利用乙型肝炎病毒的包膜蛋白才能完成复制周期，常见的卫星病毒还有腺联病毒(AAV)、卫星烟草花叶病毒(STMV)、卫星玉米白线花叶病毒(SMWLMV)、卫星稷子花叶病(SPMV)等。三、卫星RNA卫星RNA(sat-RNA)是一类寄生于辅助病毒壳体内，虽然与辅助病毒基因组无同源性，但必须依赖于辅助病毒才能复制的RNA分子片段。有人也称之为拟病毒(virusoid)。如