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1、本科生毕业（学位）论文药用植物种质资源鉴定中的分子标记技术胡山伟(1210055116)指导教师姓名：王春波职 称：副教授单 位：生命科学系专 业 名 称：生物技术论文提交日期： 年 月 日论文答辩日期： 年 月 日学位授予单位：黔南民族师范学院 答辩委员会主席: 论 文 评 阅 人: 年 月 日12目录摘要3关键词31 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)随机扩增多态性DNA42 RFLP分子标记的应用63 其他分子标记技术73.1 AFLP(扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism)73.2 微
2、卫星标记(Simple Sequence Repeat，SSR)73.3 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)83.4 序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)93.5 数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）93.6 SRAP分子标记（Sequence Related Amplified Polymorphism,）9参考文献9药用植物种质资源鉴定中的分子标记技术胡山伟（1210055116）（黔南民族师范学院生命科学系，贵州 都匀 558000）摘要：种
3、质资源又称遗传资源,基因资源,品种资源。种质的鉴定对确认原物种,正确保存和利用现今存在的种质和保证药效,研究和开发新药和寻找新药材具有重要作用。所以药用植物种质资源研究的基础就必然是种质鉴定。随着生物技术的发展，分子标记是继细胞标记,生化标记之后发展起来比较理想的遗传标记方法,近年来发展迅速。由于NDA分子鉴定技术在种质资源鉴定中的重要性。种质资源能够快速的发展离不开DNA分子标记技术。关键词：种质资源;药用植物;鉴定;分子标记技术Molecular marker technology in medicinal plant germplasm resources appraisalHu Sha
4、n-Wei(1210055116)(Life Science Department, Qiannan Normal College For Nationalities, Duyun 558000, Guizhou)Abstract:the germplasm resources, also known as genetic resources, genetic resources, variety resources.Germplasm identification to confirm the original species, the correct preservation and ut
5、ilization of germplasm and ensure effectiveness of the existence of today, research and development of new drugs and looking for a new medicine plays an important role. So the basis of the medicinal plant germplasm resources research is necessarily germplasm identification. With the development of b
6、iotechnology, molecular marker is the cell markers, biochemical markers after an ideal genetic markers in the developed method, has been developing rapidly in recent years. Due to the importance of DNA molecular identification technology in germplasm identification. Germplasm resources to rapid grow
7、th cannot leave the DNA molecular marker technology.Key words:Germplasm resources:Medicinal plants:Appraisal:Molecular marker techniques一切用于药物开发的所有植物物种就叫药用植物种质资源。是中医药产业的源头，对我国中医药的发展有着非常重要的作用。利用DNA分子鉴定技术可以提高药效成分的含量，改变遗传性状，保护濒临灭绝的植物，提高抗虫害能力。对于保护花、果入药的药用植物有着重大意义。DNA分子鉴定技术就叫DNA分子标记技术。是指通过分析遗传物质的多态性来鉴别生物
8、内在核苷酸排列顺序以及其外在性状表现规律的技术。利用DNA分子标记对药用植物开发利用有着重大的研究意义。DNA分子标记技术主要有以下几种。1 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)随机扩增多态性DNA 运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。虽然RAPD技术的出现的时间不是很长，但是因为它独特的检测DNA多态性的方式和迅速、简便的特点，从而使这项技术已渗透于基因组研究的各个方面。PCR技术作为RAPD的基础，通过对PCR产物检测即可
9、检出基因组DNA的多态性。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。 RAPD，就是随机扩增多态性DNA技术，其实，不相同的基因组DNA总是存在一定的差异，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。一定条件下，在理论上基因组的复杂性和扩增的条带数有着紧密的联系。所以特定的引物，基因组所产生的扩增条带数也越多，复杂性就越高。如图（1）是RAPD分子标记的实验操作流程图（1）随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)实验操作流程90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，很多方面的研究都利用
10、这项技术，但是这项技术还有很多不足之处，在构建遗传图谱的过程中就存在问题。目前，在实践中，主要利用了以下2种方法。利用单倍体利用胚乳进行RAPD分析，可以克服构建遗传图谱中这些困难。可以将RAPD条带作为单剂量标记。(1)RAPD在系统学研究中存在的问题随着RAPD的发展，许多植物都可以利用他作亲缘关系的分析。但有人对其结果的可靠性提出不同的看法，主要有以下几点：因为基因组的RAPD位点不能被全部检查出来，所以会造成假象。根据这种情况，可以认为，RAPD可以应用于种间乃至近缘属之间关系的研究，但有一定的局限性。如果单独的用一个个体或者种来研究群体特异性的条带，会存在很大的偏差。所以，最好能找到
11、群体特异或种特异性的条带。一些RAPD产物的出现存在相关关系，所以在表征分析中要注意。即一个位点与另一个位点相连锁。所以，用RAPD作系统分析时应结合其他方法，这样才能使别人信服，才具有科学性。(2)在标记、定位目的基因中存在问题因为RAPD标记探测的是整个基因组，所以导致定位和标记目的基因这项技术发展较为缓慢。如果一个群体的性状发生了，RAPD是不可能全部检测出的，因为可能是由基因组中很大范围内的基因引起的。而且RAPD检出的多态性又不一定是性状变异的标志(可能扩增于非编码区)。另一困难是RAPD扩增的特异性片段有些为重复序列，转化为RFLP探针有一定困难。假如RAPD标记和基因位点或性状联
12、系不起来，其作用就没多大用处。为此人们作了以下探索。从理论上来讲，利用一些特殊的材料，比如易位系、等位基因系、近交重组系等。除了目的基因及邻近区域外，其它部分可以说是完全一致。但是如果检测出多态性，差异必定在目的基因及邻近区中，也就是说RAPD标记在这个范围内与目的基因连锁。但是要获得这些材料比较困难，用RAPD找到的与目的基因连锁的标记与目的基因在距离上还相当远。BSA（Bulked Segregant Analysis）又称混合群体分离分析法，是利用极端性状进行功能基因挖掘的一种方法。以植物株高性状为例，收集株高处于两个极端的样本分别混池测序，通过全基因组扫描，找到AF具有显著差异的位点，
13、然后通过相关研究结果，对这些位点进行筛选，找到影响株高的功能位点。(3)纯度和外源基因检验问题由于RAPD条带的灵敏和重复性，纯度的检验研究还没有应用到现实中。但通过对大米，玉米等植物的实验，RAPD技术可以鉴定物种。不论哪一种技术都有它的不足和优势，RAPD技术也是如此。只要用心去专研，就会有所进展，RAPD更是如此，相信继续对RAPD进行研究一定会有所发现，使这项技术得打完善。并在人类认识自然生命现象中发挥更大的作用。2 RFLP分子标记的应用RFLP(Restriction Fragment length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性）虽然作为第一代分子生物学标记
14、，但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP标记限制性片断长度多态性标记，作为遗传分析的工具，开始于1974年，从20世纪80年代开始于植物，是较早应用于基因标记的一项分子技术，为了把多态性片段检测出来，需要将凝胶上的DNA变性通过，通过southern转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜等支持膜上，使DNA单链与支持膜牢固结合，在用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，通过放射自显影显示出杂交带，即检出RFLP。图（2）就是限制性内切酶片段长度多态性示意图图（2）限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment length Polymorphism)示意图R
15、FLP的特点：具有共显性，可以区别纯合基因型和杂合基因型，也可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。缺点是对DNA质量要求高，需要量大，操作复杂，通常要接触放射性。分化进化水平上存在的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样的可用于在不同环境中微生物多样性的研究。RFLP的主要技术特点：（1）特异性。（2）核基因组的表现为共显性遗传，细胞质表现为母性遗传。（3）RFLP标记可区分纯和基因和杂合基因，所以不受杂交方式的影响。（4）互不干扰。（5）结果稳定可靠。3 其他分子标记技术3.1 AFLP(扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorp
16、hism)AFLP技术是一项新的分子标记技术，AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增。选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。如图（3）就是AFLP技术原理示意图。图（3） AFLP(扩增
17、片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism）原理示意图AFLP技术的主要特点分析所需DNA量少。可重复性强。多态性强。分辨率高。放射性危害低。适用性广。 稳定的遗传性。因为AFLP的这些优点，使得AFLP迅速成为迄今为止最有效的分子标记。3.2 微卫星标记(Simple Sequence Repeat，SSR)微卫星标记是指由1到6个bp的碱基序列为核心呈串联重复状散在分布于整个基因组的DNA序列。作为第二代遗传标记，微卫星标记在构建饱和遗传图谱起作重要作用。微卫星DNA主要的特点广泛随机地分布于真核生物基因组中。多态性。卫星DNA多位于基因组
18、的保守区域，不同物种间的微卫星DNA侧翼序列具有较高的相似性。为共显性遗传。3.3 单核苷酸多态性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)标记是在1996年发展起来的第三代遗传标记，其多态性是由单个碱基的差异引起的，包括单个碱基的替换，插入和缺失。SNP在基因组中的数量比微卫星的多，分布更广，且遗传稳定，可实现大规模的自动化检验。如图（4）就是单核苷酸多态性分析示意图。图（4）单核苷酸多态性分析(single nucleotide polymorphism，SNP)示意图3.4 序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)ST
19、S是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。这项技术的最大优点是它产生信息非常可靠，不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。3.5 数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）数目可变串联重复序列又称小卫星DNA(Minisatellite DNA），是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：限制性内切酶的
20、酶切位点必须不在重复序列中，以保证序列的完整性。内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。小卫星标记的多态信息含量较高，缺点是数量有限，而且有限制性。也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。3.6 SRAP分子标记（Sequence Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性） SRAP标记是2001年提出
21、的，它的原理是上游引物对外显子进行扩增，下游对内含子扩增。目前它在植物研究是比较成功的应用，比如在马铃薯、黄瓜和小麦等。 80年代以来，由于分子生物学的迅猛发展，分子遗传标记方面的研究取得了巨大进展，为人类医学，动植物育种以及遗传图谱的构建战略和技术带来了革命性的变化。分子遗传标记已逐渐成为新的研究热点。 总之，DNA分子标记技术为药用植物的亲缘关系鉴定、药效成分提升、即将灭绝物种的保护、复方质量分析、基因定位与分离、资源评价等方面提供了有价值的理论根据和科学基础，为药材的鉴定提供了保障，加快了我国药用植物的研究进展。参考文献：1肖小河, 刘峰群, 史成和等. 国产姜黄属药用植物RAPD分析及
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