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1、第十六章 翻译翻译即mRNA指导下的蛋白质生物合成1.蛋白质生物合成的一般规律一. 模板：mRNA；载体：tRNA；底物：AA；场所：核糖体。二. 极性：多肽链的延伸方向是NC，即沿着模板mRNA的53。证明：体外翻译系统+同位素示踪+放射自显影。体外翻译系统指仅含有蛋白质生物合成的一切物质的体外系统（不是整个细胞），目前使用的最好的是小卖麦胚、大肠杆菌、网织红细胞三者的抽提物。三. 遗传密码：mRNA（或基因）上的核苷酸序列（碱基序列）与蛋白质中的AA序列之间的对应关系。1. 密码子mRNA（或基因）上的3个连续碱基决定一个AA，这3个连续碱基就是密码子。密码子与AA的具体对应关系见P496
2、，这一关系的发现有赖于核糖体结合技术，在体外翻译系统中加入人工合成的三聚核苷酸，充当mRNA，再掺入一种放射性同位素标记的AA，如果这个三聚核苷酸正好是该AA的密码子，则会形成核糖体-三聚核苷酸-*AA-tRNA的四聚体，用硝酸纤维滤膜很容易将这个四聚体分离出来（如果有的话），检查放射性就知道有没有。密码表中的几个重要密码子（8个）：起始密码：也就是第一个密码子，无论原核还是真核都是AUG，原核生物对应的是fMet，真核生物对应的是Met。极少数原核生物用GUG，对应fMet。不作起始密码时，也就是处于中间时，AUG对应的是Met，GUG对应Val。终止密码：UAA、UAG、UGA，它们是空密
3、码，不对应任何AA。易记密码：AAA：LysGGG：GlyCCC：ProUUU：Phe2. 密码子的主要性质简并性：1种AA可以有几个密码子，但一个密码子只能决定一种AA，例如：Leu：CUA/CUG/CUC/CUU，其意义是减少突变的影响。这样根据mRNA（或基因）的碱基序就能决定唯一的一条多肽链，反过来就不可以。密码子中间的一个碱基通常决定了AA的性质：嘧啶-疏水AA；嘌啉-亲水AA；记作苏蜜一号西瓜。通用性与例外：一切生物包括真核、原核、病毒都使用同样的遗传密码，只有线粒体例外，如果细胞核产生的mRNA进入到线粒体中，将合成出怪异的蛋白质。不重叠、不跳跃：从起始密码AUG开始，一直都以三
4、联体连续阅读，中间不重叠、不跳跃，见P497，这叫开放的阅读框架。3. 密码子和反密码子之间的作用-摆动学说反密码子是tRNA的反密码环上的特定三联体，见P148tRNA的三叶草模型。请注意反密码子与密码子的配对也要反向平行。密码子和反密码子之间的作用遵循Creck提出的摆动学说原则上要求碱基配对：请注意反密码子与密码子的配对也要反向平行。例如密码子AGC就要与反密码子GCT配对：密码子（mRNA） 5-AGC- 3反密码子（tRNA） 3-TCG- 5密码子的前两个碱基要求与反密码子严格配对，最后一个碱基可以不严格配对。摆动学说的意义：便于mRNA 与tRNA分离。2.参与蛋白合成的重要物质
5、一. 核糖体：是蛋白质合成的场所1. 组成：rRNA 原核5S、16S、23S三种真核5S、 5.8S 、18S、 28S四种蛋白质 多种2. 形态亚基：大亚基 原核50S真核60S小亚基 原核30S真核40S单核糖体：1个大亚基+1个小亚基，原核70S（50+30），真核80S（60+40），S不能简单的相加。见P503或讲义P49草图多聚核糖体：由一条mRNA串起来的多个核糖体，见P509或讲义P49草图。3. 功能结合mRNA：夹在大亚基和小亚基之间，见P504或讲义P49草图。结合氨酰tRNA、肽酰tRNA：在大亚基上，见讲义P49草图。A位：结合氨酰tRNA的部位，Amino，第一个
6、氨酰tRNA例外。P位：结合肽酰tRNA的部位，Peptide，fMet-tRNAfMet例外。E位：结合空载tRNA，Exit形成肽键：由肽酰转移酶作用，最新的发现表明此酶由rRNA（原核23S）来充当。二. 成熟的mRNA1. 原核生物的成熟的mRNA特点：没有5端帽子和3端尾巴，但有SD序列，即夹在5端点和起始密码之间的一段不翻译序列，富含嘌啉，这是保证原核生物翻译正确起始的结构，SD序列可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，决定翻译的正确起始。故在基因工程中要加上SD序列。2. 真核生物的成熟的mRNA特点：有5端帽子和3端尾巴，但没有SD序列，正确的起始靠5端帽子。三.
7、 AA、tRNA、氨酰tRNA合成酶基本AA只有20种，而tRNA的种类多得多，所以tRNA也有简并性，即一种AA可以被几种tRNA来运载。氨酰tRNA合成酶的专一性很强，它能准确的辨认某种AA与带有该反密码子的tRNA，并在两者之间形成酯键，形成的部位是，AA的羧基与tRNA的3端的CCA-OH，反应式为氨酰tRNA合成酶 AA + tRNA - AA-tRNAATPAMP+PPi 消耗2分子ATP。原核生物起始时的fMet-tRNAfMet与中间的Met-tRNAMet是由同一种酶催化的。四. 其它因子起始因子：IF，Initiation Factor延伸因子：EF，Elongation
8、Factor终止因子：RF，Release Factor3.蛋白质合成的过程AA的活化、起始、延伸、终止、肽链后加工一. AA的活化形成氨酰tRNA，见氨酰tRNA合成酶的反应式，20种基本AA都需要活化。特殊情况：原核生物起始密码AUG对应的AA活化形式是fMet-tRNAfMet二. 翻译的起始1.正确的起始机制：识别起始密码AUG，AGCUAUGAAUGGGAUGGUAGGAAC？原核生物靠5端的SD序列，可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，其后第一个AUG就是起始密码。真核生物靠的是5端帽子结构，帽子后面的第一个AUG就是起始密码。2. 原核生物起始的过程：在IF的作用
9、下，核糖体、mRNA、fMet- tRNAfMet形成70S的三元复合物，见P504，其中，mRNA夹在核糖体的大小亚基之间，fMet- tRNAfMet位于大亚基的P位上而不是A位（核糖体误将fMet当作肽），tRNAfMet上的反密码子与mRNA上的起始密码AUG相结合。见P504，这一过程要消耗1个ATP。三. 肽链的延伸1. 进位：在EF作用下，由GTP供能，第二个AA-tRNA进入核糖体大亚基的A位，见P5052. 转肽（形成肽键）：在肽酰转移酶（23SrRNA）的作用下，将“假肽酰”fMet从tRNAfMet身上转到第二个AA-tRNA的AA的氨基上，形成肽键，得到二肽酰tRNA：
10、fMet-AA-tRNA，以及空载的tRNAfMet，见P506，此步不需要能量。3. 移位：在移位酶的作用下，由GTP供能，核糖体沿着mRNA的53移动一个三联体密码的距离，使空载的tRNAfMet进入E位，准备退出；肽酰tRNA进入P位；第三个AA-tRNA进入A位。见P5074. 反复进行1.2.3.步，肽链沿着NC方向延伸。四. 翻译的终止1. 当肽链延伸到终止密码时，因为它是空密码，没有任何tRNA与之对应，故A位空出，RF进入A位，使肽酰转移酶变为水解酶，释放出肽链和tRNA。2. 生物体为了加强终止，通常设置了两个以上并排的终止密码。所以要合成含n个AA残基的肽链，mRNA至少含
11、有3n+6个核苷酸。五. 肽链的后加工1. 端点的加工原核生物N端去甲酰化、切除fMet。真核生物N端切除Met。N端甲酰化。使得成熟蛋白质的N端多样化。“凡是原核生物，蛋白质N端皆fMet”、“凡是真核生物，蛋白质N端皆Met”的说法是不对的。C端氨酰化。2. 信号肽、导肽的切除信号肽：分泌蛋白和膜蛋白，其N端有一段疏水AA（约2030个），保持着一级结构，能穿入或穿透细胞膜，就像针带线，当穿入或穿透细胞膜后就被水解掉。导肽：由细胞质合成的某些细胞器蛋白（如线粒体蛋白），其N端有一段碱性AA（约2030个），能穿透细胞器的膜，也像针带线，当穿透细胞器的膜后就被水解掉。3. 蛋白质内含子的切除
12、：例如切除胰岛素原的C肽。4. AA的修饰：P化（糖原磷酸化酶b的激活）、糖基化（糖蛋白）、OH化（羟脯氨酸）、GDP化（G蛋白）等5. 二硫键的形成，由此衍生出Cyss6. 与辅基相连：如血红素六. 真核生物与原核生物蛋白质合成的比较1. 核糖体不同：原核70S（50+30），真核80S（60+40）2. 起始AA不同：原核是fMet，真核是Met。3. 起始机制不同：原核SD序列，真核5端帽子。4. 起始复合物的形成过程不同。略。5. 真核生物过程更复杂，需要的因子更多。七. 蛋白质合成的抑制剂原核 绿霉素、红霉素、链霉素、四环素、新霉素、卡拉霉素真核 梭链孢酸、放线菌酮、蓖麻毒素、白喉毒
13、素、干扰素（抗病毒）原核与真核 嘌啉霉素、第十七章 基因工程、基因表达、核酸测序一.基因工程上个世纪七十年代发展起来的一项新技术，将成为本世纪最具前途的工业。把不同来源的基因按照设计蓝图重新整合成一个新的基因组（即DNA分子），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物，为人类服务。它的意义在于，借用工程设计的思想，克服了生物种间限制，定向创造新的物种。基因工程的一般步骤如下：见讲义草图P72，整理如下1. 根据需要提出设计2. 分离带有所需基因的DNA片段3. 改造作为载体的DNA4. 把2、3体外重组5. 把重组的DNA分子引入受体细胞6. 分离这些纯系增殖细胞7. 使外来基因在受体细胞
14、内表达一. 基因表达调控基因表达：基因如果进行了转录进而翻译，就叫基因表达，否则就叫基因不表达。基因表不表达，什么时候表达，都受到严格的调控。真核生物细胞的分化就是因为基因表达不同造成的。基因表达的调控可以分为DNA水平（拓扑异构和启动子的结构）、转录水平（操纵子模型、基因重排）、翻译水平三种水平。1. 操纵子学说之一-乳糖操纵子提出者：法国人，Jacob和Monod，诺贝尔奖金得主。乳糖操纵子的现象：E.coli中与乳糖利用有关的酶是半乳糖苷酶（LactZ）、透性酶（LactY）、转乙酰酶（LactX）三种，当培养基中不含有乳糖时，细胞基本上不产生这三种酶（5个/细胞），当培养基中加了乳糖时
15、，细胞产生很多这三种酶（5000个/细胞）。符合经济原则。乳糖操纵子模型：E.coli的DNA上有关乳糖操纵子的结构包括：见讲义草图P55调节基因I或R 产生有活性的阻遏蛋白，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。诱导物乳糖可以跟它结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。控制元件 启动子（P）：RNA聚合酶的驻地操纵基因（O）：能被有活性的阻遏蛋白结合，阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。结构基因 Z：产生半乳糖苷酶（LactZ）Y：产生透性酶（LactY）X：产生转乙酰酶（LactX） 乳糖操纵子模型的作用机理：培养基中不含有乳糖时，调节
16、基因产生的阻遏蛋白有活性，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。培养基中加了乳糖时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。见讲义草图P552. 操纵子学说之二-组氨酸操纵子现象：当培养基中不含有His时，细胞产生很多的His合成酶。当培养基中加了His时，细胞基本上不产生His合成酶。也符合经济原则。His操纵子模型：它与乳糖操纵子模型不同的地方在于，调节基因产生的阻遏蛋白是没有活性的，它需要结合His后才具有活性，这里His不是诱导物而是辅阻遏物。三. 核酸测序1. RNA的测序一般过程：目的RNA的分离提纯3
17、,5末端分析目的RNA降解为2套小片段，并分离各片段片段测序拼凑RNA的水解碱水解：高温稀氨水可以将RNA彻底水解，水解位置在NpNp，产物为3-NMP。酶水解：酶 类别 底物 特异性 产物磷酸单酯酶PMase 外切酶 DNA、RNA ，见P141pNNp 端点有游离的-OH牛胰核糖核酸酶RNase 内切酶 RNA 左边为Py，切点见P140-PypN- 3端Py核苷酸具有游离的3-PCMCT保护的RNase 内切酶 RNA 左边为C，切点见-CpN- 3端C核苷酸具有游离的3-P核糖核酸酶T1RNase T1 内切酶 RNA 左边为G，切点见P140-GpN- 3端G核苷酸具有游离的3-P核
18、糖核酸酶U2RNase U2 内切酶 RNA 左边为Pu，切点见P140-PupN- 3端Pu核苷酸具有游离的3-PRNA的末端分析，判断3,5末端核苷酸是什么。5末端分析：先用PMase去掉RNA端点核苷酸的游离磷酸根，露出-OH，再用多核苷酸激酶和放射性同位素P32（简记为- P32）标记过的ATP，将RNA5末端核苷酸的5位上接上- P32，这样就把5端核苷酸标记了。稀氨水彻底水解RNA，电泳，放射自显影，标准图谱，可知该核苷酸的种类。3末端分析：操作同上，在电泳图谱上找出核苷的位置。对照标准图谱，可知该核苷酸的种类。RNA片段测序：将这个RNA片段的5端进行标记（见）4种RNA内切酶进
19、行不同步的作用（解释:每个分子的作用位点都不同）电泳分离各产物放射自显影直读核酸序列 例如：*AGCUAGCU5-*多聚核苷酸长度 RNase CMCT+ RNase RNase T1 RNase U2 直读5-1 *A A2 *AG *AG G3 *AGC *AGC C4 *AGCU U5 *AGCUA A6 *AGCUAG *AGCUAG G7 *AGCUAGC *AGCUAGC C8 *AGCUAGCU U 思考题：？5-*多聚核苷酸长度 RNase CMCT+ RNase RNase T1 RNase U2 直读5-1 * 2 * 3 * * 4 * * 5 * * 6 * * 7 *
20、 8 * 2. DNA的测序 DNA测序的一般程序：DNA 限制性内切酶- DNA片段(2套) 变性、电泳- DNA单链 加减法、化学裂解法- 片段定序 片段重叠法- 拼凑DNA序列化学裂解法进行DNA单链片段定序将这个DNA单链片段的5端进行标记（同上）用4种特异性化学试剂进行不同步断裂（解释）电泳分离各产物放射自显影直读DNA序列4种特异性化学试剂：断裂是通过破坏核苷酸来实现的。硫酸二甲酯（DMS）：断裂对象是G，G甲酸：断裂对象是嘌啉，A和G，GA肼：断裂对象是嘧啶，C和T，CTNaCl+肼：断裂对象是C，C例如：*AGCUAGCU5-*多聚脱氧核苷酸长度 硫酸二甲酯（DMS） 甲酸 肼 NaCl+肼 直读5-0 * A1 *A *A G2 *AG *AG C3 *AGC U4 *AGCU A5 *AGCUA *AGCUA G6 *AGCUAG *AGCUAG C7 *AGCUAGC U 思考题：？5-*多聚脱氧核苷酸长度 硫酸二甲酯（DMS） 甲酸 肼 NaCl+肼 直读5-0 * 1 * 2 * * 3 * * 4 * * 5 * * 6 * 7 *