9内膜系统与膜运输.doc

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1、9内膜系统与膜运输9.1 细胞质膜系统及其研究方法9.1.1 膜结合细胞器与内膜系统9.1.2 内膜系统与蛋白质分选9.1.3 膜结合细胞器和内膜系统的研究方法9.2 内质网9.2.1 形态结构和化学组成9.2.2 光面内质网的功能9.2.3 粗面内质网的功能蛋白质转运9.3 高尔基复合体9.3.1 高尔基体的形态结构和极性9.3.2 高尔基体的功能9.4 溶酶体9.4.1 溶酶体的形态结构9.4.2 溶酶体的发现与溶酶体的酶类9.4.3 溶酶体的类型9.4.4 溶酶体的功能9.4.5 溶酶体的生物发生9.5 细胞的分泌与内吞作用9.5.1 细胞分泌9.5.2 吞噬作用与内吞作用9.6 小泡运

2、输的分子机理9.6.1 运输小泡的类型和分选信号9.6.2 披网格蛋白小泡形成的机理9.6.3 COP-被膜小泡形成的机理9.6.4 小泡的定向运输、停靠和融合机理9.6.5 膜的生物发生学习指导录像9内膜系统与膜运输真核细胞在进化上一个显著特点就是形成了发达的细胞质膜系统, 将细胞分成许多膜结合的区室,包括细胞核、内质网、高尔基体、溶酶体、内体和分泌泡等。虽然这些区室具有各自独立的结构和功能，但它们又是紧密相关的，尤其是它们的膜结构是相互转换的，这种转换的机制则是通过蛋白质分选(protein sorting)和膜运输实现的(图9-1)。图9-1 内膜系统和膜运输9.1 细胞质膜系统及其研究

3、方法9.1.1 膜结合细胞器与内膜系统关于真核细胞中具有膜结构的细胞器的总体描述通常有三个概念: 膜结合细胞器(membrane-bound organelles)或膜结合区室(membrane-bound compartments) 细胞质膜系统(cytoplasmic membrane system) 内膜系统(endomembrane systems)虽然这三个概念都是指真核细胞中具有膜结构的细胞器,但是在含义上仍有一些差别。 膜结合细胞器的种类和功能 膜结合细胞器种类与数量原核细胞内只有一个区室就是胞质溶胶(cytosol)。真核细胞内有许多膜结合的区室，但与胞质溶胶相比, 所占比例都

4、很小(表9-1)。表9-1 肝细胞中主要膜结合细胞器的体积比细胞器每细胞所含数量细胞内的百分比胞质溶胶154线粒体170022内质网112细胞核16高尔基体13过氧化物酶体4001溶酶体3001内体2001 膜结合细胞器的功能膜结合细胞器在细胞的生命活动中具有重要作用(表9-2)。表9-2 真核细胞膜结合区室的主要功能细胞器(区室)主要功能胞质溶胶代谢的主要场所；蛋白质合成部位细胞核基因组存在场所，DNA和RNA的合成地内质网大多数脂的合成场所，蛋白质合成和集散地高尔基体蛋白质和脂的修饰、分选和包装溶酶体细胞内的降解作用内体内吞物质的分选线粒体通过氧化磷酸化合成ATP叶绿体进行光合作用过氧化物

5、酶体毒性分子的氧化在这些膜结合的细胞器中,线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和细胞核等的独立性很强,并且有特别的功能；其他几种膜结合细胞器,如内质网、高尔基体、溶酶体和小泡,虽然有不同的结构和功能,但是它们都参与蛋白质的加工、分选和膜泡运输,形成了一个特别的细胞内系统。 膜结合细胞器在细胞内的分布膜结合细胞器在细胞内是按功能、分层次分布的(图9-2)。 图9-2 动物细胞中膜结合的细胞器及分布细胞内的空间为胞质溶胶,里面被一些膜结合的细胞器分隔成许多区室,每个区室至少有一层单位膜包裹,如细胞核、高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体等。如何理解膜结合细胞器在细胞内是按功能、分层次分布的? 内膜系统的动态性

6、质内膜系统的最大特点是动态性质(图9-3), 内膜系统中的结构是不断变化的，其各自的位置是处于流动状态。正是这种流动状态,将细胞的合成活动、分泌活动和内吞活动连成了一种网络结构, 在各内膜结构之间常常看到一些小泡来回穿梭，这些小泡分别是从内质网、高尔基体和细胞质膜上产生的，这就使内膜系统的结构处于一个动态平衡。图9-3 真核细胞中生化合成、分泌和内吞作用的动态网络内膜系统将细胞中的生化合成、分泌和内吞作用连接成动态的、相互作用的网络。在内质网合成的蛋白和脂通过分泌活动进入分泌小泡运送到工作部位(包括细胞外);细胞通过内吞途径将细胞外的物质送到溶酶体降解。内膜系统的动态特性是怎样引起的? 膜结合

7、细胞器的进化及其意义原核细胞没有膜结合细胞器, 真核细胞是由原核细胞进化而来, 那么, 膜结合细胞器是如何进化的呢?其意义何在? 内膜系统的进化真核细胞的膜结合细胞器的进化有两种途径，一种是线粒体和叶绿体的进化模式，即内共生途径。对于内膜系统来说，则是通过细胞质膜的内陷分化途径形成的。图9-4是关于核膜和内质网膜进化的可能途径的假说。细菌中的DNA是同膜结合在一起的，通过质膜的内陷将DNA包裹在一个膜结构中，并逐渐形成两层核膜。在古代的细菌中一些核糖体也是附着在质膜上，随着质膜的内陷和核膜的形成，核糖体就结合在核膜的外膜上逐渐进化形成内质网。这一模型较好地说明了为什么核膜是双膜结构,而且在外膜

8、上有核糖体的存在。图9-4 核膜和ER膜进化的可能途径 内膜系统形成的意义内膜系统的形成对于细胞的生命活动具有十分重要的意义。内膜系统的形成, 使得真核细胞内部结构复杂化了, 正是这种复杂化, 保证了细胞生命活动的顺利进行。请说明内膜系统的形成对于细胞的生命活动具有哪些重要的意义?9.1.2 内膜系统与蛋白质分选(protein sorting)蛋白质是由核糖体合成的，合成之后必须准确无误地运送到细胞的各个部位。在进化过程中每种蛋白形成了一个明确的地址签(address target), 细胞通过对蛋白质地址签的识别进行运送, 这就是蛋白质的分选(protein sorting)。细胞中蛋白质

9、的运输有两种方式:共翻译运输和翻译后运输,内膜系统参与共翻译运输,是分泌蛋白质分选的主要系统。为什么说蛋白质的合成和分选运输是细胞中最重要的生命活动之一? 蛋白质分选定位的时空概念所谓蛋白质分选定位的时空概念包括两种含义:合成的蛋白质何时转运?合成蛋白质在细胞中定位空间及转运中所要逾越的空间障碍是什么? 从时间上考虑,蛋白质的合成分选有两种情况:先合成,再分选和一边合成一边分选。为了适于蛋白质分选的时间上的需要,核糖体在合成蛋白质时就有两种存在状态:游离的或与内质网结合的。 从蛋白质定位的空间看,包括了细胞内各个部分,即使是具有蛋白质合成机器的线粒体和叶绿体也需要从细胞质中获取所需蛋白质(图9

10、-5)。图9-5 细胞质中蛋白质合成和空间定位路线细胞中各部位(包括细胞质)中的蛋白质都是来自胞质溶胶,不过内质网以上的细胞器,包括细胞核、线粒体、过氧化物酶体和质体所需蛋白是由胞质溶胶直接运送的。而从内质网以下的各种细胞器,包括内质网、高尔基体、溶酶体、内体、分泌泡、细胞质膜以及细胞外基质等所需的蛋白质虽然起始于胞质溶胶,但要经过内质网和高尔基体的中转。 蛋白质分选定位的空间障碍及运输方式从蛋白质定位的细胞内空间部位结构来看,可分为三种类型:没有膜障碍的,如胞质溶胶,包括胞质溶胶中的细胞骨架蛋白和各种酶及蛋白分子；有完全封闭的膜障碍,如线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体等；有膜障碍,但是膜上有

11、孔,如细胞核。根据三种不同的空间障碍, 合成的蛋白质通过三种不同方式进行运输定位(图9-6)。 核孔运输(transport through nuclear pore) 胞质溶胶中合成的蛋白质穿过细胞核内外膜形成的核孔进入细胞核，被运输的蛋白需要有核定位信号。 跨膜运输(across membrane transport) 胞质溶胶中合成的蛋白质进入到内质网、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等则是通过跨膜机制进行运输的，需要膜上运输蛋白(protein translocators)的帮助，被运输的蛋白要有信号肽或导肽。 小泡运输(transport by vesicles) 蛋白质从内质网转运到高

12、尔基体以及从高尔基体转运到溶酶体、分泌泡、细胞质膜、细胞外等则是由小泡介导的，这种小泡称为运输小泡(transport vesicles)。图9-6 膜结合细胞器的三种运输机制蛋白质在核孔运输和小泡运输中可保持折叠的形式,但在跨膜运输中必须解折叠,定位后再进行折叠。无论是何种运输方式都需要消耗能量。 信号序列指导蛋白质的正确运输 信号序列的作用虽然蛋白质可通过不同的方式和机制克服空间障碍, 定位到膜结合的细胞器中,但就其定位的准确性来说, 无论何种运输机制都是通过信号引导实现的,换句话说,信号序列决定蛋白质的正确运输方向(图9-7)。图9-7 信号序列在蛋白质分选中的作用(a)具有ER定位信号

13、序列的蛋白质被运输到ER中,而没有引导序列的蛋白质存在于胞质溶胶中。(b)通过重组DNA技术将引导序列与胞质溶胶的蛋白基因重组,表达的胞质溶胶蛋白被定位到ER, 相反,被剥夺了ER定位信号的蛋白质则只能存在于胞质溶胶中。该实验说明引导序列对所引导的蛋白质没有特异性。 信号序列特性通常为15-60个氨基酸长度，位于新生肽的N端。通过基因工程的方法证明信号序列指导的蛋白质运输和定位对蛋白质没有特异性,但不同的膜结合细胞器具有不同的蛋白质定位的信号序列(表9-3)。 表9-3 细胞内某些典型蛋白运输信号及功能功能信号序列组成输入内质网+H3 N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu

14、-Leu-Leu-Val- Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu- Gln-Leu-Thr- Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln滞留内质网-Lys-Asp-Glu-Leu-COO输入线粒体+H3 N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe- Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser- Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu- 输入细胞核输入过氧化物酶体-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Ser-Lys-Leu-说明: +H3N 代表氨

15、基端; COO代表羧基端。 信号序列的类型根据信号序列运输方向的不同分为三种类型，即入核信号、引导肽和信号肽。入核信号指导核蛋白的运输，引导肽指导线粒体、叶绿体和过氧化物酶体蛋白的运输，信号肽则指导内膜系统的蛋白质运输。9.1.3 膜结合细胞器和内膜系统的研究方法虽然电子显微镜能够获得高度清晰的细胞内膜系统的结构,但是不能研究单个膜结合细胞器的结构和功能。离心分离技术、同位素示踪技术和突变技术是有效的研究内膜系统的方法。 放射自显影术(autoradiography)胰腺系统中胰泡细胞具有最发达的内膜系统, 主要功能是合成消化酶类。这些酶类合成之后要从胰腺系统经由导管分泌到小肠中行使功能。这些

16、酶是如何分泌出去的? Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自显影技术证明了蛋白质分泌起始于内质网,经高尔基体到达细胞外。Jamws Jamieson 和George Palade是如何用同位素示踪技术研究胰泡细胞中蛋白质分泌的? 差速离心分离与功能分析 微粒体(microsomes)分离虽然放射自显影技术证明了分泌蛋白合成的起始部位，但不能证明合成分泌蛋白的是何种细胞器。Albert Claude和Christian De Duve发展了细胞组份分离技术，分离到了具有蛋白质合成和分泌功能的结构。这些结构称为微粒体(图9-8)。图9-8 通过差速离心分离微粒体用机械

17、匀浆将细胞破碎,各种膜细胞器破碎,并且重新自我融合形成各种球形膜泡,通过较高速度离心除去细胞核、线粒体、过氧化物酶体等细胞器。收集悬浮液再用较低速度离心,然后用电子显微镜检查离心后分开的两部分结构。发现上层的囊泡表面是光滑的,沉淀下的囊泡表面有核糖体颗粒。 微粒体的功能研究通过差速离心分离的微粒体不仅保留了膜的结构特征,同时还具有活细胞中的生物活性和功能。如来自高尔基体的囊泡具有将蛋白质和脂进行糖基化修饰的作用。用从这些囊泡中分离的特殊蛋白作为抗原制备抗体,然后将制备的抗体与特定的颗粒如金颗粒结合,再通过免疫电镜技术就能够对用作抗原的酶进行定位,通过这些研究详细揭示了高尔基体在复杂的糖装配中的

18、具体过程。 用突变体研究内膜系统的功能为了研究编码与分泌途径相关蛋白的基因,科学家们筛选了一些突变体,在这些突变体中,内膜结构不正常。如获得的涉及ER出芽小泡形成基因发生突变酵母突变体的ER就特别大; 若是涉及与高尔基体融合的基因突变,这种酵母突变体中就会积累大量的分泌泡。通过对酵母突变体的研究, 揭示了小泡运输的过程(图9-9)。图9-9 与分泌相关的不同酵母突变体野生型是分泌正常的酵母,A、B、C、D、E是五类不同的sec基因(secretory genes)突变,代表了蛋白质分泌的五个过程。A:分泌蛋白不能进入内质网,B: 内质网出芽缺陷,C:分泌小泡不能与高尔基体融合:D:高尔基体不能

19、形成分泌泡;E:分泌泡不能与质膜融合。目前已经分离和克隆了几十个与分泌途径相关的基因,通过序列分析,表明这些基因与哺乳动物分泌基因具有同源性, 推测哺乳动物的细胞分泌过程与酵母相似。在蛋白质的合成与分泌的研究中分别使用了同位素示踪技术、分离技术和突变体研究技术, 说明这些技术的研究结果各说明了什么问题?9.2 内质网(endoplasmic reticulum, ER)内质网是由K.R.Porter和A.D.Claude等在1945年发现的。他们在体外培养成纤维细胞时得到了薄层生长物，这种薄层生长的细胞不需要进行切片就可以在电子显微镜下进行观察，从而得到第一张培养细胞的电镜照片。发现细胞质不是

20、均质的, 其中可见有一些形状和大小略有不同的网状结构, 并集中在内质中, 所以建议称作内质网。原核生物没有内质网, 由细胞质膜代行其功能。9.2.1 形态结构和化学组成 形态结构内质网是由一层单位膜所形成的囊状、泡状和管状结构，并形成一个连续的网膜系统。由于它靠近细胞质的内侧，故称为内质网(图9-10)。根据内质网上是否附有核糖体,将内质网分为两类:粗面内质网和光面内质网。由于内质网是一种封闭的囊状、泡状和管状结构，它就有两个面，内质网的外表面称为胞质溶胶面(cytosolic space), 内表面称为潴泡面(cisternal space)。图9-10 细胞中内质网与细胞核、高尔基体的立体

21、结构 粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, RER)多呈大的扁平膜囊状, 在电镜下观察排列极为整齐(图9-11a)。它是核糖体和内质网共同构成的复合机能结构, 普遍存在于分泌蛋白质的细胞中, 其主要功能是合成分泌性的蛋白质、多种膜蛋白和酶蛋白。 光面内质网(smooth endoplasmic reticulum, SER)无核糖体附着的内质网称为光面内质网(图9-11b), 通常为小的膜管和小的膜囊状, 而非扁平膜囊状,广泛存在于各种类型的细胞中，包括合成胆固醇的内分泌腺细胞、肌细胞、肾细胞等。光面内质网是脂类合成的重要场所,它往往作为出芽的位点, 将内质网上

22、合成的蛋白质或脂类转运到高尔基体。图9-11 超薄和扫描电镜观察的内质网 (a) 粗面内质网;(b)光面内质网,上半部是超薄电镜照片,下半部是扫描电镜照片。另外还有两个概念:微粒体和肌质网,可将它们看成是特殊类型的内质网。 微粒体(microsome) 在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,在体外实验中,具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。 肌质网(sarcoplasmic reticulum) 心肌和骨骼肌细胞中的一种特殊的内质网,其功能是参与肌肉收缩活动。 胞质溶胶(cytosol)与细胞质内膜的形成将细胞质中可流动的部分

23、分成了两半:胞质溶胶和潴泡腔(cisternal space)。胞质溶胶属细胞质的可流动部分,并且是膜结合细胞器外的流动部分,它含有多种蛋白和酶以及参与生化反应的因子。细胞质是细胞内除细胞核以外的所有生活物质,包括可流动的部分和不可流动的部分,不可流动的部分包括线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和内膜系统的膜结构,可流动的部分包括胞质溶胶和内膜系统的潴泡腔。 内质网的化学组成 蛋白与脂 内质网是膜囊结构,所以构成内质网的主要化学成份是蛋白质和脂。内质网膜的化学组成与线粒体外膜很相似，磷脂占50%-60%, 蛋白质约占20%。在磷脂中:磷脂酰胆碱占55%-58%; 磷脂酰乙醇胺占20%-25%; 磷脂

24、酰肌醇及磷脂酰丝氨酸占5%-10%;鞘磷脂占4%-7%。 代谢酶系光面内质网存在许多代谢酶系(表9-4),主要有NADH-细胞色素P450还原酶、NADH-细胞色素B5还原酶、NADH-细胞色素C还原酶、ATP酶、5核苷酸酶、核苷焦磷酸酶、细胞色素b5、细胞色素P450、核苷二磷酸酶、-葡萄糖醛酸苷酶、酯酶以及合成甘油、脂酸、胆固醇的酶。表9-4 微粒体上检测到的光面内质网上存在的酶类催化类型酶作用部位碳水化合物代谢葡萄糖6-磷酸酶腔中-葡糖醛酸酶腔中葡糖醛酸转移酶腔中糖基转移酶胞质溶胶脂代谢脂肪酸CoA连接酶胞质溶胶磷脂醛磷酸酶胞质溶胶胆固醇羟基化酶胞质溶胶转磷酸胆碱酶胞质溶胶磷脂转位酶胞质

25、溶胶和腔中与药物脱毒相关的氧化酶细胞色素P-450胞质溶胶NADPH-细胞色素P-450还原酶胞质溶胶细胞色素 b5胞质溶胶 NADH-细胞色素b5还原酶胞质溶胶蛋白质的加工信号肽酶蛋白二硫异构酶腔中腔中 细胞色素P450与电子传递链内质网膜中有丰富的细胞色素P450。占微粒体膜蛋白的10%, 是跨膜蛋白。细胞色素P450是内质网电子传递链中的一个组成部分, 这条电子传递链中还含有NADPH-细胞色素P450还原酶和磷脂酰胆碱。参与这一电子转移的另一种重要的酶是细胞色素b5, 它也是还原酶,含有NADH。 标志酶内质网的标志酶是葡萄糖-6-磷酸酶。9.2.2 光面内质网的功能光面内质网具有很多

26、重要的功能,如类固醇激素的合成、肝细胞的脱毒作用、糖原分解释放葡萄糖、肌肉收缩的调节等。 糖原分解释放游离的葡萄糖肝细胞的一个重要功能是维持血液中葡萄糖水平的恒定, 这一功能与葡萄糖-6-磷酸酶的作用密切相关。光面内质网中的葡萄糖-6-磷酸酶将葡萄糖-6-磷酸水解生成葡萄糖和无机磷，释放游离的葡萄糖进入血液(图9-12)，供细胞之用图9-12 光面内质网在糖原裂解中的作用在肝细胞中,糖原裂解释放葡萄糖-1-磷酸,然后再转变成葡萄糖-6-磷酸,由于磷酸化的葡萄糖不能通过细胞质膜,光面内质网上的葡萄糖-6-磷酸酶将葡萄糖-6-磷酸水解为葡萄糖和磷酸后,葡萄糖就可穿过细胞质膜进入血液。光面内质网是如

27、何参与肝细胞维持血液中葡萄糖水平的恒定? 类固醇激素的合成分泌类固醇激素的细胞如肾上腺细胞、睾丸间质细胞和黄体细胞都有丰富的光面内质网，并在光面内质网上含有合成胆固醇和将胆固醇转化为激素的全套酶系；所以光面内质网能够合成胆固醇，然后将胆固醇氧化、还原、水解进一步转变成各种类固醇激素。类固醇激素的合成涉及多个途径中的酶，包括存在于胞质溶胶和光面内质网中的酶类。但是合成的起始物质是胆固醇前体物质甲羟戊酸(mevalonate),它的合成是由光面内质网中的HMG-CoA还原酶催化的。 脂的合成与转运 磷脂的合成细胞膜所需要的最重要的磷脂也是在光面内质网上合成的。在光面内质网上合成的磷脂先作为内质网膜

28、的构成部分，然后再转运给其他的膜。图9-13 是光面内质网合成磷脂酰胆碱的过程,反应中最先形成的磷脂被包埋在内质网的膜中,但朝向胞质溶胶；合成的终产物磷脂酰胆碱仍然存在于内质网膜中。催化反应的酶类既有存在于胞质溶胶中的,也有存在于内质网中的膜蛋白。图9-13 在光面内质网膜中合成磷脂酰胆碱首先，内质网膜中脂肪酸与胞质溶胶中的磷酸甘油结合,然后脱磷,并内质网膜中胆碱磷脂转移酶的作用下,将胞质溶胶中的CDP-胆碱与内质网膜中的甘油脂肪酸结合形成磷脂酰胆碱。新合成的磷脂酰胆碱朝向胞质溶胶一侧,但可在内质网膜中磷脂转位酶的作用下翻转到内质网的腔面。 磷脂转位蛋白与翻转酶(flippase)磷脂的合成都

29、是在内质网的胞质溶胶面，但在内质网上合成的磷脂几分钟之后就由胞质溶胶面转向膜的另一面，即内质网腔面, 磷脂的转位是由内质网膜中磷脂转位蛋白(phospholipid translocator)或称翻转酶帮助的。翻转酶催化的磷脂移动也是有选择性的,如能够翻转磷脂酰胆碱的翻转酶则不能催化其他的磷脂翻转, 这样保证了膜中磷脂分布的不对称。 磷脂交换蛋白(phospholipid exchang proteins, PEP)与磷脂转运内质网中的磷脂不断合成，使得内质网的膜面积越来越大，必须有一种机制将磷脂转运到其它的膜才能维持内质网膜的平衡, 这就是磷脂转运。磷脂的转运有两种方式。一种是凭借一种水溶性

30、蛋白, 叫磷脂交换蛋白的作用(图9-14); 另一种是以出芽的方式转运到高尔基体、溶酶体和细胞质膜上，详细机制在后面介绍。图9-14 膜磷脂转移的两种方式(a)通过小泡运输将内质网上合成的脂转运到其他内膜系统的膜上包括细胞核膜;(b)通过磷脂转运蛋白将内质网上合成的脂转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的膜中。 解毒作用(detoxification) 肝细胞解毒光面内质网能够对外来的有毒物质,如农药、毒素和污染物进行解毒。多数解毒反应与氧化作用有关,有些也涉及还原和水解,或者三者结合,使有毒物质由脂溶性转变成水溶性而被排出体外,此过程称为肝细胞的解毒作用, 主要在肝细胞的光面内质网中进行。 混

31、合功能的氧化酶(mixed-function oxidases)从肝细胞中分离的微粒体在氧和NADPH存在下,将一些有毒物质氧化, 并且每氧化一分子底物,要消耗一分子的氧,进而将NADPH转变成NADP+。由于这种反应的一个氧原子出现在产物中,其他则存在于水分子中,所以将催化这种类型氧化作用的酶称为混合功能的氧化酶。 细胞色素P-450 (cytochrome P-450)的羟基化作用微粒体的混合功能的氧化酶系统类似一条呼吸链，由几个组分组成，核心成员是细胞色素P-450。细胞色素P-450参与有毒物质以及类固醇和脂肪酸的羟基化, 羟基化涉及四个基本反应被氧化的物质同细胞色素P-450结合细胞

32、色素P-450中的铁原子被NADPH还原氧同细胞色素P-450结合底物结合一个氧原子被氧化,另一个氧原子用于形成水(图9-15)。被氧化的底物由于带上羟基,增强水溶性,容易被分泌排出。图9-15 混合功能氧化酶将底物羟基化的机制(1)被羟基化的底物与细胞色素P-450结合;(2)细胞色素P-450中的铁原子被NADPH所还原; (3)氧与细胞色素P-450结合;(4)底物被一个氧原子所氧化,另一个氧用于形成水。 Ca2+离子的调节作用肌质网是细胞内特化的光面内质网, 是贮存Ca2+的细胞器。肌质网膜上重要的膜蛋白是Ca2+-ATP酶, 光面内质网可构成心肌和骨胳肌肌原纤维周围的肌质网。当肌细胞

33、膜的兴奋信号传递到肌质网时则引起肌质网释放Ca2+, 从而导致肌细胞的收缩活动。当肌肉松弛时, 钙离子又重新泵回肌质网。所以肌质网实际上是作为钙库, 其内有钙结合蛋白, 每个钙结合蛋白可以结合30个左右的Ca2+。9.2.3 粗面内质网的功能蛋白质转运粗面内质网的主要功能是帮助膜结合核糖体合成的蛋白质转运。膜结合核糖体上合成的蛋白质与游离核糖体上合成的蛋白质去向是不同的,表9-5列出了这两类核糖体合成的某些蛋白。 表9-5 真核细胞中膜结合核糖体和游离核糖体合成的某些蛋白膜结合核糖体游离核糖体分泌蛋白可溶性胞质溶胶蛋白肽类激素脂锚定膜蛋白 生长因子(位于质膜的胞质面)消化酶类外周蛋白血清蛋白(

34、质膜的胞质面)细胞外基质蛋白核基因编码的线粒体蛋白释放到ER腔中的蛋白核基因编码的叶绿体蛋白RER中的酶类过氧化物酶体蛋白高尔基复合体的酶核蛋白溶酶体的酶整合膜蛋白ER膜的糖蛋白高尔基体的膜糖蛋白溶酶体膜糖蛋白质膜糖蛋白核膜糖蛋白脂锚定质膜蛋白质膜的外周蛋白(位于质膜的外侧面)由于粗面内质网上合成的蛋白质包括膜蛋白、内膜结构的腔池蛋白和分泌到细胞外的蛋白, 所以必须有极好的运输机制进行分选定位, 这就是信号肽假说。 信号序列的发现和证实 微粒体实验在George Palade用离心技术分离到有核糖体结合的微粒体,即发现膜结合核糖体(membrane-bounded ribosome)之后, 科

35、学家推测:膜结合核糖体合成的蛋白质首先要进入内质网的腔,然后通过选择性的分泌过程输出到细胞外,而游离核糖体上合成的蛋白质则留在细胞内使用。为了研究内质网上合成的蛋白质是否进入了内质网的腔, Colvin Redman 和 David Sabatini用分离的RER小泡(微粒体)进行无细胞系统的蛋白质合成, 证明了膜结合核糖体上合成的蛋白质进入了微粒体的腔。如何利用微粒体在无细胞蛋白质合成系统中的合成实验证明膜结合核糖体合成的蛋白质进入了微粒体的腔 Gnter Blobel等的建议为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的蛋白质插入内质网?对

36、此,美国洛克菲勒大学的 Gnter Blobel、David Sabatini 和Bernhard Dobberstein 等于1971年提出两点建议:分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列(signal sequence),可将多肽和核糖体引导到ER膜上;多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推测多肽是在合成的同时转移的。 信号序列存在的直接证据1972年,Csar Milstein和他的同事用无细胞系统研究免疫球蛋白(IgG)轻链合成时获得了信号序列存在的直接证据, 证明Blobel等的建议是正确的。他们用分离纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指导合成多肽,发现

37、合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链, 它有20个氨基酸,他们推测,这段肽具有信号作用,使IgG得以通过粗面内质网并继而分泌到细胞外。 信号序列的进一步证实G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在上述发现的基础上用分离的微粒体和无细胞体系进行了大量的实验,进一步证实了信号序列的存在及其作用。加与不加RER小泡,产物不同 当将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中进行翻译时, 如果不加粗面内质网(微粒体), 获得的翻译产物比从细胞中分泌出来的蛋白要长,若添加RER小泡,翻译的产物长度与从活细胞分泌的蛋白相同。因此推测信号序列在引导蛋白进入

38、内质网后被切除了,所以成熟的蛋白的N-端没有信号序列(图9-16)。图9-16 信号序列在分泌蛋白质运输中的作用(a) 在不含RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,其N-端有信号序列,故比从细胞中分泌出来的相同蛋白质肽链长;(b)在加有RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,信号序列在RER小泡中被切除,得到的产物与从细胞中合成分泌的相同。蛋白水解酶水解实验 在分泌蛋白进行体外翻译的无细胞系统中(含有RER小泡)加入蛋白水解酶,并不能使新生肽水解。但同时加入去垢剂,则能将蛋白质水解,提示新生肽链是边合成边运输的,因为去垢剂能够破坏内质网的膜,使合成的蛋白质暴露于蛋白水解酶遭到降解。若无去垢剂,多

39、肽在合成的同时就向内质网转运,所以不受蛋白水解酶的影响。多聚核糖体的离体翻译 从骨髓瘤分离多聚核糖体，用去垢剂处理，使之与内质网膜分离后，继续在无细胞体系(不含RER小泡)中进行翻译，发现:短时间温育，即可得到成熟的分泌蛋白(无信号序列),而长时间的温育，得到的产物N-端有信号序列,这一结果证明了信号序列的功能。为什么说多聚核糖体是研究内质网帮助蛋白质运输的好材料? 信号序列的一般特征及早期信号假说 信号序列的一般特征G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在研究中还发现信号序列具有一些共同的特性:长度一般为1535个氨基酸残基, N-末端含有1个或多个带正电

40、荷的氨基酸,其后是612个连续的疏水残基;在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网,进入内质网后通常被切除(图9-17)。图9-17 ER跨膜可切除信号的一般结构 早期的信号假说1975年, G.Blobel和 B.Dobberstein 根据对信号序列的研究成果,正式提出了信号假说(signal hypothesis),要点是:(1)分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核糖体;(2)合成的N-端信号序列露出核糖体后,靠自由碰撞与内质网膜接触,然后靠N-端信号序列的疏水性插入内质网的膜;(3)蛋白质继续合成,并以袢环形式穿过内质网的膜;(4)如果合成的是分泌的蛋白,除了信号序列被信号肽酶切除外,全部进入

41、内质网的腔,若是膜蛋白,则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在内质网膜上。 信号假说证明: 基因重组实验信号假说提出后得到许多实验的支持,其中最有力的一项实验结果是杂合蛋白研究的结果。黑猩猩的-球蛋白是一种在游离核糖体上合成并存在于胞质溶胶中的可溶性蛋白,科学家在编码该蛋白的基因上接上一段编码E.coli分泌蛋白-半乳糖透性酶(-lactamase)的信号序列DNA, 然后将该基因加入到无细胞的转录和翻译体系中,并加入从狗组织中分离的ER膜,研究结果发现,杂合蛋白出现在ER腔中,而且信号序列被切除了。这一研究结果不仅证实了信号假说的正确性,也揭示了信号序列的一个重要特性:信号序列没有特异性,

42、并且原核生物的信号序列在真核生物中也是有效的。 Blobel 于1972年提出信号序列的建议、1975年正式提出信号假说,揭示了细胞中不同蛋白质在合成后是如何找到自己的工作岗位的秘密,发现了蛋白质与生具来的“地址签”。这一发现开辟了一个全新的医学、细胞生物学和生物技术学的研究领域,基于他的贡献,使他获得了1999年诺贝尔医学奖。 新蛋白复合物的发现与信号假说的补充 信号识别颗粒(signal recognition partical, SRP)1981年,发现了信号识别颗粒(signal recognition partical, SRP),是一种核糖核酸蛋白复合体,沉降系数为11S，含有分子

43、量为72kd、68kDa、54kDa、19kDa、14kDa及9kDa的6条多肽和一个7S(长约300个核苷酸)的scRNA(图9-18), 它的作用是识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上。图9-18 信号识别颗粒(SRP)的组成 停靠蛋白 (docking protein, DP) 即SRP在内质网膜上的受体蛋白,它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合,使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。 蛋白质共翻译转运的机理:信号假说 新信号假说的基本内容补充修改后的信号假说比早期的信号假说更为合理, 这一假说的核心内容是: 核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽

44、)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。因此，核糖体同内质网的结合是功能性结合，具有功能性和暂时性，并受时间和空间的限制。正是由于这种结合保证了新合成蛋白的矢量释放。信号序列的两个基本作用是:通过与SRP的识别和结合, 引导核糖体与内质网结合; 通过信号序列的疏水性,引导新生肽跨膜转运。图9-19是修改后的信号假说的主要内容。图9-19膜结合核糖体体的蛋白质合成与转运补充修改后的信号假说的要点是什么? SRP、SRP受体功能的离体鉴定任何假说都要经受得起实验的检验。假说中的SRP、SRP受体的功能都已有体外实验的证明。请你设计一个离体实验证明SRP和SRP受体的

45、功能。 信号肽跨膜的能量来源研究证明SRP受体和SRP都是G蛋白,它们不仅将合成蛋白质的核糖体引导到内质网, 而且通过GTP-GDP的交换, 将内质网膜中的易位子(translocon)通道打开, 让信号序列与之结合(图9-20)。GTP 水解作为信号序列转运的能量来源。图9-20 GTP在蛋白质转运中的作用 膜蛋白的共翻译转运机理在粗面内质网上合成的蛋白质有两类:分泌蛋白和膜蛋白,膜蛋白的共翻译转运较为复杂,首先它要靠疏水区滞留在内质网上,另外膜蛋白分单次跨膜和多次跨膜;还有膜蛋白在膜上的定向问题,即羧基端和氨基端位于内质网膜的内侧(内质网腔面)还是外侧(胞质溶胶一侧),还是位于同一侧。 起

46、始转移信号(start-transfer signal)蛋白质氨基末端的信号序列除了作为信号被SRP识别外, 还具有起始穿膜转移的作用。在蛋白质共翻译转运过程中,信号序列的N-端始终朝向内质网的外侧,插入蛋白质转运通道后与通道内的信号序列结合位点(受体)结合,其后的肽序列是以袢环的形式通过运输通道。 内含信号序列(internal signal sequence) 与单次跨膜蛋白内含信号序列又称内含信号肽(internal signal peptides),它不位于N-末端,但具信号序列的作用,故称为内含信号序列。它可作为蛋白质共翻译转移的信号被SRP识别,同时它也是起始转移信号。由于内含信号序列是不可切除的,又是疏水性,所以它是膜蛋白的一部分,如果共翻译转运蛋白质中只有一个内含信号序列,那么合成的蛋白就是单次跨膜蛋白(图9-21)。图9-21 内含信号序列与单次跨膜蛋白的整合 内含信号序列首先作为信号序列与SRP一起将核糖体附着到内质网,然后作为起始转移信号与蛋白质转运通道结合引导新生肽的转移。在与转运通道