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1、昆 明 学 院 2014 届毕业设计（论文）设计（论文）题目 拟南芥ESB1基因转化农杆菌及其鉴定 子课题题目 姓 名 王明仙 学 号 201014010151 所 属 院（系） 生命科学与技术系 专业年级 2010级生物科学1班 指导教师 杨红玉 教授 2014 年 5 月拟南芥ESB1基因转化农杆菌及其鉴定摘要灰霉病是作物生产上一种世界性的主要病害，菊花灰霉病在菊花生长期容易发生，严重时可引起大量落叶，影响植株开花，降低观赏价值。本研究将对灰霉病有抗性作用的拟南芥ESB1基因导入农杆菌及其对导入后的鉴定，以及菊花对抗生素的敏感性实验研究，期望对后期农杆菌介导转化菊花，培育抗病性强、优质、高
2、产的转基因菊花新品系奠定技术基础。本研究采用冻融法将拟南芥ESB1基因导入根瘤农杆菌中，通过PCR反应，检测ESB1基因是否成功转入农杆菌，以及进行菊花对潮霉素的敏感性实验，确定临界耐受浓度，建立菊花转化受体系统。经PCR检测后表明ESB1基因成功转入农杆菌；菊花对潮霉素的敏感性临界浓度为30mg/L。关键词：ESB1基因；根瘤农杆菌；遗传转化；切花菊 AbstractGrey mould is a worldwide major diseases on crop production,Chrysanthemum mould in chrysanthemum growing prone, se
3、rious when can cause a lot of fallen leaves, influence plant flowering, reduce the ornamental value.ESB1 affected the resistance of Arabidopsis thaliana to the grey mould disease. This study leading the ESB1 into Agrobacterium tumefaciens and to identify;Chrysanthemum to antibiotics sensitivity expe
4、riment research.Agrobacterium tumefaciens taken as the transformation vector, expected to cultivate strong disease resistance, high quality and high yield of transgenic chrysanthemum new strains technology foundation.This study adopts the method of freezing and thawing will Arabidopsis ESB1 genes in
5、to Agrobacterium in root nodules, by PCR reaction, detecting ESB1 gene is successfully transferred into Agrobacterium, and chrysanthemum to hygromycin sensitivity experiments, determine the critical concentration of tolerance,chrysanthemum transformation receptor system is established.After PCR dete
6、ction show that successfully transferred into Agrobacterium ESB1 gene;The critical concentration of hygromycin sensitivity in 30 mg/L.Keywords:ESB1 gene;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation;Cut Chrysanthemum目录第一章 引言11.1 切花菊基因工程研究进展11.1.1 菊花简介11.1.2 切花菊发展历史与现状11.1.3 切花菊发展前景21.1.4 切花菊基因工程研
7、究进展21.2 农杆菌介导法转化植物的原理及研究进展31.3 拟南芥ESB1基因研究概况41.4 拟南芥ESB1基因与菊花灰霉病41.5 本研究的目的和意义5第二章 拟南芥ESB1基因转化农杆菌62.1 材料与方法62.1.1 实验材料62.1.2 实验方法72.2 结果与分析82.3 讨论9第三章 转化农杆菌的PCR鉴定103.1 材料与方法103.1.1实验材料103.1.2 实验方法103.2 PCR反应产物的检测113.2.1 制备1.0%琼脂糖凝胶113.2.2 胶板制备113.2.4 电泳123.2.5 观察照相123.2.6 保存123.3 结果与分析12第四章 切花菊愈伤组织对
8、潮霉素的敏感性134.1 材料与方法134.1.1 实验材料134.1.2 实验方法144.2 结果与分析154.3 讨论16结论16参考文献17附录18谢辞19III第一章 引言1.1 切花菊基因工程研究进展1.1.1 菊花简介 菊花（Chrysanthemum morifolium）为菊科（Compositae）菊属(Chrysanthemum)多年生宿根半木质化草本花卉，是由野菊经过多年人工精心栽培，选择培育出的名贵观赏花卉，也称为艺菊。菊花原产于我国，古代也叫鞠、黄花、金蕊、节花1。菊花耐寒，喜欢深厚肥沃、排水良好的沙质壤土，忌积涝。其栽培历史悠久，名贵品种极多，叶、花型、瓣型有很大变
9、化，是色、香、姿、韵俱佳的中国传统名花，也是世界上著名的观赏花卉之一，具有极高的观赏价值和广阔的应用前景2。随着花卉业的发展，人们对高质量的新奇菊花品种种苗及切花的需求与日俱增，因此，育种工作者寻求不同的育种途径，不断采用新方法和技术，以期培育出观赏性更强的切花菊新品种。菊花应用形式多样，按其应用分类，可分为切花菊、盆栽菊、地被菊和造型艺菊等。1.1.2 切花菊发展历史与现状 菊花是原产于我国的传统名花，它不仅色彩艳丽，姿态万千，而且具有冷傲高洁、傲霜怒放、凌寒不凋的品格，因此与梅、兰、竹并称为花中四君子3。我国菊花自周朝起就有文献记载，迄今已有3000余年的悠久历史。公元729-748年，我
10、国菊花最先传入日本，受到日本人民的高度赞赏，并成为日本最高贵的花卉之一，同时菊花还被定为日本皇族的国花。1688年，我国的菊花由荷兰商人引入欧洲，19世纪中期又从英国传入北美，此后我国菊花遍及全球。菊花起源于我国，各种菊花技艺堪称一绝，如地被菊、盆栽标本菊、大立菊、悬崖菊、案头菊、菊塔、菊门、小菊盆景等4，其花文化之悠久，内容之丰富，令世人惊叹，但是，切花菊生产却在欧美、日本等国家得到了发展和壮大。国际上切花的种植分为三大板块，供应欧洲市场的在非洲种植，供应美洲市场的在哥伦比亚和厄瓜多尔种植，供应亚洲市场的在中国种植。近年来，切花菊已发展成为国际商品花卉总产值中最高的花种。20世纪八十年代，国
11、内切花菊产业也以异军突起之势，蓬勃发展。1.1.3 切花菊发展前景花卉业是世界上最具活力的产业之一。如今，世界花卉业以年平均25%的速度增长，远远超过世界经济增长的平均速度。日本是世界上切花菊生产大国，占世界切花菊产量的50%以上，但因劳动力成本较高、土地资源匮乏、冬天温度较低等影响，日本国内菊花生产量远远不能满足其需求，菊花的生产逐渐转向气候适合、生产成本较低的发展中国家。世界花卉的稳步增长及产业转移，为我国花卉业进一步发展创造了良好的外部环境。我国不仅是世界上最大的花卉生产基地，同时也正成长为新兴的花卉消费市场。我国进入“工业反哺农业”的阶段，使得花卉产业地位不断提升，而菊花已发展成为国际
12、商品花卉总产值最高的花种，其经济、社会和生态效益必将明显显现。切花菊产量居四大切花之首，具有花型多样、色彩丰富、用途广泛、耐运耐贮、瓶插寿命长、栽培繁殖容易、能周年供应、成本低、高产等优点，综合国内外发展和其本身特点，切花菊产业必将拥有广阔的发展前景。1.1.4 切花菊基因工程研究进展基因工程育种是20世纪70年代初期才发展起来的一门技术。即采用分子生物学技术手段，将各种外源基因导入生物细胞、组织或器官以达到人们的预期效果5。现代生物技术为植物育种工作者创造了新的遗传变异和育种资源，其目的是应用基因工程将有经济价值的外源基因整合进入受体细胞的基因组内，并得到有效表达，以实现定向改良植物性状、创
13、造新品种，提高植物的产量和质量。80年代以来，已逐渐把此技术应用到高等植物的物种改良和新品种的培育上。与传统育种手段相比，基因工程具有其独特的优势：可以定向修饰花卉的某个或某些目标性状并保留其原有性状；通过引入外来基因可扩大其基因库。转基因技术的发展为切花菊育种提供了一条新的途径。菊花转基因研究多致力于改变花色、花形、花期、株型和抗病虫等方面10。1985年Horseh等首创叶盘转化法11，1987年Sanford等利用基因枪技术开创了新的育种方法，从而为进一步利用新的基因资源改良菊花品种提供了新的手段和途径。自Lemieux第1次成功的利用农杆菌介导法诞生第l株转基因菊花以来，随着菊花遗传转
14、化体系的健全、外源基因在植物细胞中的表达及转化方法的完善等，定向修饰菊花的某些目标性状并保留原有性状，使其在花色、抗性、花型、花期等方面得到极大的改观和发展14。外源基因主要有改变花色基因 Lc、CHS，抗性基因 bt、NP-I、TSWV，改变形态基因 GAI、Rolc、PHYB-1，成花基因 LFY、FT等9、10。其中有部分转基因苗表现出了目的性状并进入大田实验，但很大一部分出现了基因沉默。傅荣昭等将兔防御素NP-1基因导入菊花，获得了抗卡那霉素植株5。Mitiouchkina等利用农杆菌介导的方法，将rolC基因转入切花菊品种White Giant中，利用rolC基因对切花菊形态的改变，
15、得到了株型、分枝状况、花朵和花瓣都改变的菊花新品种11、13。 向太和等利用菊花叶片转入rolC基因，得到了矮化的菊花转基因植株2。提高抗性是菊花育种的重要目标，Y.Takatsu等把大米几丁质酶基因RCCZ转入菊花中，提高了对病菌的抗性。Takatsu等将水稻几丁质酶基因用农杆菌介导法转移到菊花中，获得了3株经ELISA检测对菊花灰霉病(Botrytis cinerea)有极强抗性的植株。荷兰CPRO-DLO从菊花中成功地分离一种启动子，保证了菊花转化植株的基因的高度表达。然后将带有苏云金杆菌（Baciilus thubergiensis）的毒素基因的启动子导入菊花中，培育出抗beet ar
16、my worm的菊花新类型。Yepes将含有马铃薯斑点萎蔫病毒TSWV(N)核壳基因和NPTII的二等分质粒PBIN19裹在钨微粒表面轰击菊花品种Blush、Dark Bronze Charm、Iridon、Tara的叶片和茎段外植体，获得了很高的转化效率(89%)12。Mitiouchkina等将从金鱼草分离到的CHS基因以反义方向转入切花菊品种Parliament中，获得花颜色变浅的新品种13。 此外，对于菊花组培有大量成功的研究报道，可以建立起高效的遗传转化再生体系。迄今为止有关切花菊的快繁、不同外植体的再生、体细胞胚胎再生、以农杆菌介导的遗传转化体系建立等生物技术方面在菊花的研究上已经
17、得到广泛的应用。但菊花转化效率低、优化菊花遗传转化体系等问题仍有待解决。1.2 农杆菌介导法转化植物的原理及研究进展 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)被认为是唯一的有内部基因转移能力的有机体8。是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA，在农杆菌侵染宿主植物时，这段DNA可以转移进植物细胞，并稳定地保留在植物细胞染色体中，变为植物细胞新增加的一段基因，最终能通过有性世代遗传给子代。 20世纪50年代，Braun-AC研究发现，土壤中的根癌农杆菌引起的植物冠瘿瘤因其无限增长的
18、特性而具备用于转化的机制6。随后细胞中冠瘿碱的发现证明农杆菌的基因已经整合到植物细胞中，因而使得农杆菌转化成为可能。 农杆菌和植物细胞相互作用可以分为以下几个阶段：识别，有毒基因表达，连接宿主细胞，毒性因素和T-DNA进入到宿主细胞，染色体与T-DNA整合7。农杆菌介导的基因转化方法，使外源基因的整合变得容易，基因转移后又具有很高的稳定性。农杆菌介导的植物转化是一个很复杂的过程，包括许多步骤及与微生物和宿主因素的协同操作。关于植物-农杆菌蛋白互作的不断报道，还有许多要学会理解的整个转化过程的细节。显然，深度研究植物-农杆菌的互作，不仅可以增加我们对于宿主浸染病原菌的过程的理解，而且也将加速抗性
19、植株产生的步伐。1.3 拟南芥ESB1基因研究概况 灰葡萄孢（Botrytis cinerea）被认为是世界上重要的植物致病真菌，它能侵染200多种作物引起灰霉病，在世界范围内给农业生产造成严重的经济损失。拟南芥-灰霉菌作为植物-病原菌互作的模式研究材料，为研究植物抵抗腐生型真菌侵染抗性机制提供理论基础。本实验室在前期研究中利用遗传筛选系统获得一个拟南芥对灰葡萄孢菌增强敏感的 T-DNA 插入突变体，命名为 esb1（Enhance sensitivity to Botrytis1），相应的突变基因命名为 ESB1。ESB1 基因突变导致植物对灰霉菌侵染和高浓度 NaCl 胁迫的敏感性增强。将
20、 ESB1 基因转入突变体植株中可以完全恢复其对灰霉菌侵染和NaCl 胁迫的抗性，说明 ESB1 基因是拟南芥对灰霉菌和高盐等生物和非生物抗性必需的。1.4 拟南芥ESB1基因与菊花灰霉病灰霉病是作物生产上一种世界性的主要病害，病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea），属于半知菌亚门，丝孢目，淡色孢科，葡萄孢属，是一种非专性的腐生型病原菌。灰葡萄孢被认为是世界上重要的植物致病真菌，它能侵染200多种作物引起灰霉病，在世界范围内给农业生产造成严重的经济损失。据观察菊花灰霉病在菊花生长期容易发生，主要为害菊花叶、茎、花等部位；严重时可引起大量落叶，影响植株开花，降低观赏价值；叶受害时在
21、叶片边缘会出现褐色病斑，表面略呈轮纹状波皱，叶柄和花柄先软化后外皮腐烂，花受害时影响开花和种子成熟；高温多雨、栽植过密、氮肥施用过多、土壤质地黏重等都会导致病害发生；当病菌侵染花器时，会产生水渍状褐色病斑，湿度大时，病部生浅灰黑色霉状物，即病菌分生孢子和分生孢子梗。因此，将从拟南芥中发现并克隆出的能够抵抗灰霉菌的ESB1基因通过农杆菌介导的叶盘法导入菊花中，为研究菊花抵抗腐生型真菌侵染抗性机制提供理论基础。1.5 本研究的目的和意义 花卉作为云南省的朝阳产业，也是本省的支柱产业之一。云南省的花卉产量自1994年以来就一直稳居全国第一，目前全国60%以上的花卉出自云南，同时切花菊在国际、国内市场
22、上非常畅销，是国际著名的四大鲜切花之一，占总鲜切花量的23，在花卉产业中占有很重要的地位8。加强菊花育种具有很高的经济效益和社会效益。随着花卉产业的发展，人们对切花菊的需求量越来越大。如何预防和治理菊花的各种病害，增加产量，是科研和生产中需要解决的重要问题之一。 ESB1基因的表达下调致使拟南芥植株对灰霉菌的敏感性增强，为了进一步了解该基因的功能，本研究前期构建了4x CaMV35S：ESB1cDNA（花椰菜花叶病毒），利用超强启动子驱动ESB1基因的cDNA序列，通过农杆菌介导的花序侵染法转入野生型拟南芥和叶盘法转入菊花，构建成出超表达植株，筛选出纯合转化株后，选取部分植株进行ESB1基因表
23、达量检测，并同时对选取的植株进行灰霉菌接种试验，以野生型拟南芥植株和菊花植株为参照，进一步了解ESB1基因的过量表达是否对灰霉菌抗性产生影响。 灰霉病是菊花大田栽培和生产上的重要病害，全国各栽培区广泛分布，严重影响菊花的观赏价值。因此，通过农杆菌介导的叶盘法将ESB1基因转入菊花中，培育抗病更强的新品种，研究转基因菊花抗灰霉病的机理，为菊花育种及抵抗病害提供理论依据。然而，在植物基因转化中，将携带外源基因的重组质粒导入农杆菌是利用农杆菌介导进行遗传转化的第1项关键技术1；所以，将拟南芥ESB1基因转入农杆菌及对其进行鉴定，为用农杆菌介导法进行菊花遗传转化提供了良好的载体系统。 第二章 拟南芥E
24、SB1基因转化农杆菌2.1 材料与方法2.1.1 实验材料2.1.1.1 菌株 受体菌为农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、表达载体pCAMBIAN1300-221，该表达载体上含有转化所用的ESB1基因，二者均为实验室保存。2.1.1.2 试剂 卡那霉素（Kan），庆大霉素（Gen），利福平（Rif），溶液P1、P2、P3，酵母提取物和蛋白胨为Sigma公司生产，购自北京拜耳迪生物技术公司。漂洗液WB（含无水乙醇），洗脱缓冲液EB，其他试剂为国产分析纯。2.1.1.3 培养基 YEB培养基（用于培养农杆菌） YEB培养基配方（农杆菌在28培养） 酵母
25、提取物 1.0 g/L 蛋白胨 5.0 g/L 牛肉膏 5.0 g/L 葡萄糖 5.0 g/L 硫酸镁 0.5 g/L 将pH调至7.0。若要配固体培养基，加入78g琼脂。2.1.1.4 仪器和设备高速冷冻离心机：Eppendorf centrifuge 5804 R恒温培养振荡箱：TS-100B Shaker incubator（上海天星实验仪器制造有限公司） TS-111B Shaker incubator（上海天星实验仪器制造有限公司）冰箱（Haier）、超低温冰箱368升立式（Czech Republic JOUAN SA）制冰机：SANYO ice maker SIM-F140AY6
26、5超纯水纯化系统：Milli-Q、Resistivity monitor（Biocel）压力蒸汽灭菌器：SYQ-DSX-280B（上海申安医疗器械厂） 超净工作台：Air Tech（苏净集团安泰公司制造）电子天平：METTLER TOLEDO AL204（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）磁力搅拌器、离心吸附柱、722型紫外分光光度计。2.1.2 实验方法2.1.2.1 高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型） （1）取15mL过夜培养的菌液（含有质粒的大肠杆菌菌液），加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm，离心1min（尽量吸除上清）。 （2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250L溶液P1
27、（含RNase A），涡旋振荡至彻底悬浮。 （3）向离心管中加入250L溶液P2，温和地上下翻转610次，使菌体充分裂解（此时菌液应变得清亮粒稠，所用时间不宜超过5min）。 （4）向离心管中加入400L溶液P3，立即温和地上下翻转610次，室温放置5min，室温13000rpm，离心10min，小心取上清。 （5）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱AC中，13000rpm，离心1min，弃滤液。 （6）向吸附柱AC中加入500L漂洗液WB（含无水乙醇），13000rpm离心3060s，弃滤液。 （7）重复步骤6一次，13000rpm离心3060s，弃滤液。 （8）将吸附柱AC放入收集管
28、中，13000rpm，离心2min，然后将吸附柱AC打开，室温放置35min，除去残留乙醇。 （9）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60100L洗脱缓冲液EB（6570预热），室温放置1min。13000rpm，离心1min，洗脱DNA，-20保存备用。2.1.2.2 农杆菌感受态细胞的制备（1） 挑取保留的GV3101原始菌种，划线于含利福平Rif（15g/L）和庆大霉素Gen（15g/L）的YEB平板上，28，200rpm恒温振荡培养12天。（2） 在平板上挑取单菌落接种到35mL含有Rif和Gen的YEB液体培养基中，28，250 rpm振荡培养过夜，摇至菌液
29、呈橘黄色。（3） 将摇好的菌液按1:100的比例加入到含Rif和Gen的YEB液体培养基中（取2000L菌液转接到200mLYEB液体培养基中），28，250 rpm振荡培养至浓度达到菌液呈橘黄色（OD600=0.6时转化效率最高）。（4） 取新鲜转接的培养菌液1.5mL，10000 r/min离心1min，集菌，弃上清。（5） 菌体沉淀以100L TSS缓冲液重悬。即得农杆菌感受态细胞。2.1.2.3 重组质粒转化农杆菌取10L纯化的重组质粒DNA，加入100L感受态细胞，轻拍混匀，冰浴5min，转入液氮冷冻8min（5min），迅速37（28）水浴5min，加入800L YEB液体培养基（
30、此步骤在超净工作台上进行），28，250 rpm/min预表达45h，将菌液移至含卡那霉素(Kan）的YEB固体培养基表面，涂布整个平板，28振荡培养12天，直至长出菌斑。注：上述实验步骤中，液氮冷冻8min（5min），迅速37（28）水浴，是进行两组对照，即一组进行液氮冷冻8min，迅速37水浴，其他条件不变；另外一组是液氮冷冻5min，迅速28水浴，其他条件不变。2.2 结果与分析 拟南芥ESB1基因通过液氮冻融法转入农杆菌，随机挑取单菌落，接种到YEB固体培养基上，28振荡培养2d后观察到，在YEB固体培养基表面长出黄色农杆菌菌落。（如图2.1，此图为单菌落的扩大培养。） 图2.1 转
31、化后的农杆菌 2.3 讨论 植物基因工程发展至今，已成为植物遗传育种以及质量性状改良的有效途径之一。现今，用于植物转基因技术的方法很多，主要有：农杆菌介导法、化学法、基因枪法、电击法、激光法、超声波法等方法。其中，农杆菌介导法以其操作简单、成本低、转化效率高、拷贝数少、可转移较长的基因片段等优点成为广泛使用及最为成功有效的转化方法。农杆菌介导法是一种天然的植物基因转化系统。目前，所得到的转基因植株中有85%都是通过农杆菌介导法而得到的。但是，农杆菌介导的植物遗传转化中转化率仍然是一个需要解决的问题。本研究中，拟南芥ESB1基因导入农杆菌后，在YEB固体培养基表面成功长出黄色农杆菌菌落。可以将其
32、用于后续的实验研究。第三章 转化农杆菌的PCR鉴定3.1 材料与方法3.1.1实验材料3.1.1.1 材料以转化后的农杆菌作为模板。3.1.1.2 仪器和设备 普通热循环PCR仪：BIO-RAD Ordinary thermal Cycler 582BR Bio-rad水平电泳设备及Wealtec Corp.ELITE 300 PLUS电源Wealtec Corp.GES cell complete system凝胶成像系统：UVP Bioimaging system G6制冰机：SANYO ice maker SIM-F140AY65高速冷冻离心机：Eppendorf centrifuge
33、5804 R超低温冰箱：Thermo scientific Reco VALUE series ULT1386-3-V移液器及吸头、硅烷化的 PCR 小管。3.1.1.3 试剂 （1）PCR反应体系所需试剂：10PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，在25下 pH9.0， 1.0 Triton X-100。 MgCl2 ：25mmol/L。 4 种 dNTP 混合物：每种 2.5mmol/L。 Taq DNA聚合酶 5U/L。 T4 DNA连接酶及连接缓冲液。（2） 电泳所需试剂： 琼脂糖、EDTA、EB、液氮、甘油。 3.1.2 实验方法以转化后
34、的农杆菌为模板，以Forward Primer(ESB1CDS200)：5-CTGCAGATGC TTCGGAAGTCGGTTCTCG-3和Reverse Primer(ESB1CDS200)：5-ACTAGTTGAT GGCATGTCCGGCTTAGCT-3为特异性引物，进行PCR扩增反应，其反应体系如下（见表3.1）(单位：l)表3.1 PCR反应体系各组成分体积（L）Master MixForward PrimerReverse Primer水模板Total Vol. 12.5118.5225 PCR反应条件： 94 3min 预变性 94 30s 变性 56 45s 退火 35Cycl
35、e 72 1min30s 延伸 72 5min 延伸 4 保存3.2 PCR反应产物的检测3.2.1 制备1.0%琼脂糖凝胶 称取0.8g琼脂糖于250mL锥形瓶中，加入80mL EDTA，摇匀，置于微波炉中加热2min至琼脂糖全部融化，取出，再加入10LEB，混匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。3.2.2 胶板制备选择合适的水平式电泳槽并安装好，检查稳压电源与正负极的线路。选择孔径大小合适的点样梳子，将梳子垂直架在电泳槽固定位置。将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液小心地倒入电泳槽中，使胶液缓慢展开，直到形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直地轻轻拔出梳子。3.2.3 加样用10L微量移液器分
36、别将样品全部加入胶板的样品槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）3.2.4 电泳加样后的凝胶板立即通电进行电泳，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，电泳30min。3.2.5 观察照相以DNA Marker DL5000为分子量参照物，在紫外凝胶成像系统下观察谱带并照相，确定目的片段的大小。3.2.6 保存将正确的菌液加入总体积20%的甘油，液氮速冻，一80超低温冰箱保存备用。3.3 结果与分析以ESB1基因的上、下游引物为特异性引物，重组质粒DNA为模板，作为正对照，进行ESB1基因的扩增。用同样的引物，以筛
37、选出的农杆菌单菌落为模板，进行PCR扩增。然后将PCR扩增产物上样于琼脂糖凝胶板上进行电泳分析。在3个电泳结果中，1泳道为正对照，2、3泳道为需要鉴定的农杆菌样品。3个样品都扩增出了600bp左右的特异条带。2、3泳道的条带与正对照的条带大小一致，表明ESB1基因成功导入农杆菌，可以用于后续的实验研究（见图3.1）。 图3.1 农杆菌GV3101中ESB1基因的PCR检测 M: DNA Maker5000 1：正对照 2-3：样品 第四章 切花菊愈伤组织对潮霉素的敏感性 在农杆菌介导的遗传转化中，卡那霉素和潮霉素常被用作抗性选择标记。本试验所用质粒载体上构建有目的基因ESB1和抗性筛选标记潮霉
38、素磷酸转移酶基因Hyg。因此，用潮霉素作为选择标记。如果转化的细胞对潮霉素具有抗性，在含有潮霉素的选择培养基上就会存活下来，而非转化细胞无抗性则会死亡而遭淘汰。在目的基因的转化过程中，先对未转化的受体材料进行潮霉素敏感性试验，研究潮霉素对受体材料菊花的影响，确定潮霉素的适宜浓度，对进一步进行菊花的遗传转化研究具有重要意义。4.1 材料与方法4.1.1 实验材料4.1.1.1 植物材料 以2025d生长健壮的菊花无菌苗中上部分充分展开、均匀一致的幼嫩叶片为材料。4.1.1.2 生化试剂 6-苄基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、蔗糖、琼脂粉、潮霉素（Hyg），其他无机和有机试剂为进口sigm
39、a或国产分析纯产品。4.1.1.3 主要仪器和设备超纯水纯化系统：Milli-Q、Resistivity monitor（Biocel）压力蒸汽灭菌器：SYQ-DSX-280B（上海申安医疗器械厂） 超净工作台：Air Tech（苏净集团安泰公司制造）恒温培养振荡箱：TS-100B Shaker incubator（上海天星实验仪器制造有限公司） TS-111B Shaker incubator（上海天星实验仪器制造有限公司）数显酸度计：PHS-3C（杭州奥立龙仪器有限公司）HPG-400H人工气候箱、电磁炉、1000mL锥形瓶、玻璃瓶、移液器、手术剪、镊子。 4.1.1.4 培养基用于潮霉素
40、筛选的培养基为SH基本培养基（SH+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.3g/L琼脂粉），灭菌前调pH到5.8。4.1.2 实验方法4.1.2.1 培养基的配制（见表4.1）表4.1 SH培养基配方组成成分用量备注大量元素微量元素有机物质肌醇铁盐6-BANAA蒸馏水100mL10mL10mL10mL10mL500L1000L定容至1L调pH至5.8 注：培养基各物质成分见附录于上述调好pH的液体中再加入30g蔗糖和6.3g琼脂粉，置于电磁炉上加热煮沸，趁热倒入玻璃瓶中，每个瓶中用量筒量80mL，然后用封口膜密封。密封完毕后将所有瓶子以及用报纸包好的镊子、手术剪
41、等工具，一同放入高压蒸汽灭菌锅中，121 灭菌30min。4.1.2.2 不同浓度抗生素Hyg的SH培养基配制将刚刚灭菌完毕的倒有SH培养基的瓶子和镊子、手术剪等一同取出，镊子和手术剪放入高温烘箱中备用，倒有SH培养基的瓶子迅速放在超净工作台上，紫外灯照射1015min。紫外照射完毕后，打开离子风，用75%酒精擦拭双手，点燃酒精灯。然后立即打开玻璃瓶的一部分封口膜，迅速用移液器加入事先配制好的不同浓度的潮霉素，再盖好封口膜密封好。随后摇动玻璃瓶，使抗生素充分、均匀地接触培养基，最后用记号笔在玻璃瓶壁上标注日期、抗生素名称及浓度。4.1.2.3 菊花无菌苗抗生素Hyg敏感性试验ESB1基因过量表
42、达载体是潮霉素抗性的，所以在转化前需要对所转的菊花品种先进行抗性浓度的筛选，比较抗生素Hyg不同浓度对菊花叶片外植体再生的影响，在前人研究的基础上，Hyg设0、15、20、30、35、40mg/L6个梯度处理。以SH+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA为基本培养基，在超净工作台上，用镊子取2025d生长健壮的菊花无菌苗中上部分充分展开、均匀一致的幼嫩叶片，用手术剪将其切成0.5cm2 大小的方块，接种于含不同浓度抗生素Hyg的SH分化培养基中，每处理接种15个外植体，重复三次实验。观察不同浓度抗生素Hyg对菊花叶片再生的影响，确定菊花叶片对抗生素Hyg的敏感性，并根据不同浓度的抗
43、生素Hyg对叶片再生的抑制程度确定菊花遗传转化的Hyg临界耐受浓度。4.2 结果与分析 本实验设计了0、15mg/L l、20mg/L 、30mg/L、35mg/L、40mg/L6个浓度梯度，接种情况如下（见表4.2、图4.1）：表4.2 不同抗生素Hyg浓度梯度的筛选结果处理Hyg添加浓度（mg/L）外植体数（片）死亡数（片）生长情况C00150良好C115158叶片变黄C220159叶片变黄C330159死亡C4351511死亡C5401513死亡ADBFEC A.0 mg/L B.15mg/L C.20mg/L D.30 mg/L E.35 mg/L F.40mg/L 图4.1 不同潮霉
44、素添加浓度下，菊花外植体生长情况从转接第二天开始观察记录，发现从第5d开始部分菊花叶片出现黄化现象，10d后处理只有C0的叶片能较好生长，在处理C1C2之间，其生长受到明显的抑制，大部分叶片变黄，处理C3及之后的菊花叶片全部呈枯死状。由此可见，菊花叶片对Hyg较为敏感，并选择以30mg/LHyg为菊花转化体的筛选压力。4.3 讨论菊花遗传转化主要采用农杆菌介导的方法，在转基因过程的继代筛选中，需要添加相应的抗生素，用以确保较高的转化效率。进行抗生素的筛选有两个目的：第一是抗生素的选择标记，其作用是筛选转化体。如果抗生素浓度过高，会导致转化体细胞被毒害致死，进而抑制相邻活细胞的活性，最终难以获得转基因植株；如果浓度过低，则容易导致大量的嵌合体及假阳性植株的产生，增加后期分子检测的工作量。第二个目的是作为抑菌剂，用来防止农杆菌的过渡滋生而导致外植体死亡。这里需要注意，抑菌剂浓度的确定既要能够完全抑制农杆菌的滋生，又不能影响到植物细胞的正常生长。此外，不