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1、09硕二基础学习小组DNA复制、DNA损伤修复、逆转录、转录一、DNA的复制1. DNA复制的一般特点：DNA复制是半保留复制（1985年，Meselson和Stahl的实验，明，该结论。他们使用一种含N15的氯化铵的细菌培养液，研究大肠杆菌的DNA复制过程。）DNA复制的生长点形成复制叉（复制叉指的是DNA双链解开分成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形结构）DNA复制是双向复制 （双向复制是指复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉。在原核生物中，其DNA为环形DNA，只有一个复制起点，产生的两个复制叉在环形染色体和起点相对位置（起点旋转180）汇合后
2、，复制完成。在真核生物中，每个染色体都有多个起始点，每个起点的复制叉遭遇到邻近的复制起点所形成的复制叉后停止复制）DNA复制为半不连续复制（同一个复制叉上只有一个解链方向，就是从5到3。而在复制时，一条链的合成方向和复制叉前进的方向相同，可以连续复制，成为前导链，但是另一条链的和成方向与复制叉前进的方向相反，不能顺着解链方向连续延长，只能待模板链解开至足够长度，才从5到3开始复制，在延长过程中，又要等待下一段有足够长度的模板，再次生成引物而延长，称为后随链。后随链所形成的一个个小片段称为冈崎片段。）复制起点由多个短重复序列组成（复制起点是指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列，其一般特征为由
3、多个短序列组成；能被多亚基的复制起始因子识别和结合；一般富含AT）DNA复制必须有引物（多数DNA复制使用RNA引物，提供只有的3-OH末端，通过加入核苷酸不断延长。少数以DNA或者核苷酸为引物）DNA复制需要多种酶参与（A解旋要解旋酶，暴露复制模板链B延长只能利用引物3-OH开始延伸C连接冈崎片段必须利用DNA连接酶）DNA复制具有高度忠实性2. DNA聚合酶的特征DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板连接处（其中模板指引合成方向，引物提供3端吸引底物的5-P形成磷酸二酯键）DNA聚合酶的活化中心催化DNA合成（DNA聚合酶具有监控进入的dNTP形成A：T或者G：C配对的能力，还能区分rN
4、TP和dNTP）3. DNA聚合酶的分类l 原核生物的DNA聚合酶分别有DNA-pol，DNA-pol，DNA-pol，而且他们都有3-5核酸外切酶的活性。DNA-polDNA-polDNA-pol分子量（kd）108120250组成单肽链还不清楚多亚基不对称二聚体分子数400？205-3核酸外切酶有无无基因突变后的致死性可能不可能可能其中，1. DNA-pol是复制中真正起催化作用的酶，由a，组成核心酶，两边的起夹稳模板链并使酶沿模板滑动的作用。由六个亚基构成y-复合物，负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基加载于DNA上，使DNA聚合酶三具有持续合成能力。2. DNA-pol的二级结构以a-螺
5、旋为主，可划分为A到R共18个a-螺旋，其中I到O容纳DNA链，H到I是无结构的氨基酸残基，把DNA链包裹起来，使其向一个方向滑动。但是，DNA-pol的主要作用是对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行修补。3. DNA-pol基因发生突变，细菌仍能存活，推想他是其他两种酶缺失情况下暂时其作用的酶。l 真核生物的DNA聚合酶至少有15种，但常见的有5种，都有5-3核酸外切酶的活性。DNA-polay分子量16.54.014.012.525.53-5核酸外切酶活性无无有有有功能起始引发，引物酶活性低保真度的复制线粒体DNA复制延长子链的主要酶，解螺旋酶活性填补引物空隙，切除修复，重
6、组4. 复制保真性的酶学依据：A核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正 B 复制的保真性依赖聚合酶对碱基的选择功能C靠模板的指引，子链延长严格遵照碱基配对规律。5.原核生物的DNA生物合成l 复制起始：DNA解链形成引发体1. DNA解旋：解旋的过程主要由DnaA，B，C三种蛋白共同参与。有相同亚基组成的四聚体DnaA辨认并结合与串联重复序列即AT区，然后几个相同的DnaA蛋白结合成类似核小体。DnaB在DnaC蛋白的协同下，结合和沿解链的方向移动，并且逐步置换出DnaA。此时，就形成了复制叉。同时，SSB（单链DNA结合蛋白）在一定时间内使复制叉保持适当的长度，利于核苷酸依据模板参
7、入。2. 引发体和引物：引物由引物酶催化合成的短链RNA分子。引发体就是含有解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA的开始复制区的复合结构。其作用过程：引发体的蛋白质组分在DNA链上移动（ATP供能），在适当的位置，引物酶催化生成引物，留有3-OH末端，此时进入DNA复制延长。l 复制延长的过程，前导链连续复制，后随链不连续复制1. 复制延长是指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或者延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。2. 冈崎片段的形成原因，是因为后随链的子链延长方向与解链的方向相仿，需要等待复制叉解开至相当长度，生成新的引物，然后又在引物3-OH末端上
8、延长。l 复制的终止过程：切除引物，填补空缺和连接切口1. 多个引物的水解需胞核内的RNA酶，留下的空隙由DNA-pol催化，从5-3用dNTP为原料申城相当于引物长度的DNA链。最后，大缺口又连接酶连接起来。6. 真核生物的DNA生物合成l 真核生物复制的起始与原核基本相似，但是作用的酶类是A：DNA-pola合成RNA-DNA引物（首先合成RNA引物，再利用其DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA短序列，形成RNA-DNA引物）B：复制蛋白A（RPA）相当于SSB，可促进DNA进一步解旋，一定条件下激活POLa或者引发酶活性 C ：复制因子C（RFC）含5个亚基（其中p140的存在，其
9、ATPase活性才能被PCNA激活），他的主要功能是促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链。D：增殖细胞核抗原（PCNA）是是可滑动的夹子。RFC可将PCNA三聚体装载于DNA并可卸载下来。同时，PCNA是协调DNA复制，DNA损伤修复，表观遗传和细胞周期调控的核心因子。E：DNA聚合酶合成前导链和后随链。F：DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板G：真核复制叉有一个POLa和2个pol复合物l 引发和延伸发生DNA聚合酶a转换1. 引发体组装：识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后，POLa|引发酶复合物结合于复制起点。2. 引发和延伸发生DNA聚合酶a转换：其机制为POLa|引
10、发酶产生RNA-DNA引物，接着RPC识别其iDNA的3端，取代POLa|引发酶，然后PCNA结合DNA并引入POL。POLa被取代的原因是POLa不具有持续合成能力。l 端粒酶参与解决染色体末端复制问题在染色体末端，有端粒取代引物RNA。而端粒酶（一种由RNA和蛋白质组成的核糖蛋白RNP）能够延伸其DNA底物的3端，以自己的RNA组分为模板，以染色体的3端后随链模板为引物将端粒序列（富含TG的序列）加于染色体的3端。l 线粒体DNA按D环方式复制；噬菌体DNA按滚环方式复制。7.DNA的损伤修复l 原核生物利用错配修复蛋白MutS二聚体沿着DNA运动，去现DAN骨架因非互补碱基对之间的不对称
11、而长生的变形，从而识别错配的核苷酸,结合MutL（在母链上）和MutH（在子链上）将错配的子链部分切除，再由DNA-pol填补，连接酶封口。l 真核细胞修复错配核苷酸利用的是MSH蛋白，以及与MutL同源的和PMS蛋白。l 化学或物理因素造成细胞DNA损伤：碱基丢失，碱基改变，和泛酸插入或缺失，DNA链断裂，DNA链间共价交联（具有两个功能基团的烷化剂）l DNA损伤的修复系统有1. 直接修复系统利用没简单的逆转DNA损伤（光复活修复系统，可见光能激活细胞内光裂合酶，将DNA中因紫外线而形成的嘧啶二聚体分解，但哺乳动物缺乏）2. 碱基切除系统修复切除受损碱基（碱基切除修复是最普遍的切除之一。3
12、. 核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形。核苷酸切除修复NER有4种蛋白质组成：UvrA，UvrB，UvrC和UvrD。在着色性干皮肤XP患者中，紫外线辐射产生的嘧啶二聚体几乎没有任何改变。4. 重组修复系统能够修复双链短链损伤。前提是还有一条链保持完整，且可用于修复DNA复制中的差错。5. 跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA。8.逆转录l RNA病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录。l 逆转录的过程分三步：首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA-DNA杂化链。然后杂化双链中的RNA被逆转录酶中的RNase活性的组分水解，被感染细
13、胞内的RnaseH也可水解RNA链。RNA分解后剩下的单链DNA再作为模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。l 逆转录酶的三种活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合活性和RNase活性，需要锌离子为辅助因子。l 合成方向也是5-3l 逆转录病毒在宿主细胞的繁殖：逆转录成双链cDNA双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒原病毒DNA转录产生病毒RNA病毒RNA经翻译和包装形成逆转录病毒颗粒。9.NRA的生物合成l 原核生物转录的模板和酶1. 能转录出RNA的DNA片段称为结构片段2. 所谓的不对称转录是指A一条链作为模板指引转录，另一条不转录B模板链（DNA双链中按碱基配对规律指引转录生成
14、的RNA单链的DNA链）并非总是在同一单链上。3. RNA聚合酶，能催化NTP之间形成3,5磷酸二酯键合成RNA，还需要镁离子和锌离子辅助。而且该合成不需要引物，只需要DNA特殊序列启动子（RNA聚合酶在转录起始上游的结合序列），就能启动RNA合成。4. RNA聚合酶有多个亚基组成，分别有a2，和组成。其中a2（）亚基合称为核心酶，加上能够辨认转录起点的亚基统称为全酶。转录起始需要的是全酶，但是转录延长阶段则仅需要核心酶。其中亚基是RNA聚合酶与DNA模板相结合相依附的组分，a亚基决定转录哪些类型和种类的基因。全酶的前三个亚基都参与整个转录过程。5. RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录
15、因为转录是不连续，分区进行的，所以每个转录区段可视为一个转录单位称为操纵子，而操纵子包括若干个结构基因及其上游的调控序列。其中，调控序列中的启动子就是RNA聚合酶结合到模板DNA的部位（控制转录的关键所在）l 原核生物的转录过程1. 转录起始先形成RNA聚合酶全酶，模板和转录5端首位的四磷酸二核苷（GTP或者ATP）组成的转录起始复合物。其主要过程是：由因子辨认DNA的启动子-由RNA聚合酶与之结合-DNA双链打开10-20个碱基对，形成转录空泡-RNA聚合酶按照模板链的序列指引，以NTP为底物进行相应的碱基配对-当最初的两个核苷酸相连在一起时，形成转录起始复合物，同时因子脱落，等再次与核心酶
16、结合。2. 转录延长：因子脱落后，核心酶向模板链下游移动，在核心酶的催化下，与DNA模板链互补的NTP逐个聚合到新生的RNA链上，形成核心酶-DNA-RNA转录复合物。3. 转录终止有两种机制：一是依赖因子的转录终止，其作用机制尚不清楚，他是一种具有6个相同亚基的蛋白质，能和新生成的具有-依赖转录终止区序列RNA作用，并以5到3方向移动，移动到转录复合体后，终止转录。二是不依赖因子的转录终止，其特征为A有几个连续的尿嘧啶B是在这几个连续的U序列之前有一段富含G和C，并有可以自身互补的碱基的序列。真核生物的转录过程1. 真核生物的转录需要三种酶：RNA-pol。其中酶催化和车工45SRNA，对鹅
17、膏藫碱反应耐受。酶催化合成mRNA前体hnRNA，此酶对鹅膏藫碱反应极敏感。3酶催化合成5SRNA，tRNA和snRNA，此酶对鹅膏藫碱中度敏感。其中酶中最大的亚基称为RBP1，末端有一段共有序列，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Por-Ser的重复序列，称为羧基末端结构域（CTD）2. 转录起始需要启动子，RNA聚合酶和转录因子参与（1） 在转录起始点上游参与转录调控的DNA序列称为顺式作用元件，其包括启动子，启动子上元件和增强子（能结合特异基因调节蛋白，促进邻近或者远隔特定基因表达的DNA序列）等。在真核生物中，也需要RNA聚合酶对起始区上游DNA序列作辨认和结合，生成起始复合物
18、。而在上游中的有被称为Hognest盒或TATA盒的共同的TATA序列（启动子的核心序列）。（2） 转录因子：能直接，间接辨别和结合转录上游区段DNA的蛋白质称为反式作用因子。而在反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的称为转录因子。（3） 转录起始前复合物是由RNA聚合酶，各种转录因子和转录起始区结合的复合物。1. 转录延长，过程与原核生物大致相似，但是有核膜相隔。没有转录和翻译的同步现象。而且转录延长发生在核小体的移位和解聚。2. 转录终止：在下游，常有一组共同序列AATAAA，再下点就是重复的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。在转录经过修饰点时，mRNA被切断，随即加上POLA
19、及5帽子结构。l 真核生物转录后的修饰（转录生成的RNA只是初级的转录产物，不具有活性）1. 真核生物mRNA的转录后加工（mRNA的前体是hnRNA）（1） 首尾修饰5末端加帽子：经过磷酸解，磷酸化和甲基化，使其第一个核苷酸生成7-甲基鸟苷三磷酸鸟苷（帽子结构）。在尾端，在多聚腺苷酸聚合酶的作用下，在3末端有ATP聚合形成多聚腺苷酸（尾）（2） mRNA剪接的过程是切除内含子（断裂基因的非编码序列），连接外显子（断裂基因中的编码序列），此过程需要snRNA参与。2. tRNA的加工：包括5和3末端多余的核苷酸的切除，内含子的剪接，稀有剪辑的生成和3末端加上CCA-OH3序列。3. rRNA的转录后加工：rRNA基因纵向串联并重复排列，转录生成的SrRNA要经过剪接，才能成为5.8S,18S，28S三种有功能的rRNA4. RNA的加工可采用自我剪接的形式，这些rRNA都具有茎环状结构组合成的锤头二级结构，但在某些序列张必须有特定的碱基。仅供参考，不足之处，恳请指正