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1、SPR生物传感芯片新工艺研发的理论方案第一部分 SPR生物传感芯片研发技术背景1.1 SPR生物传感芯片的制备技术传感芯片是整个SPR系统的核心。SPR传感芯片可以是金属膜本身，但由于这种传感芯片没有选择性，只能在特定条件下采用，故常在金属膜表面固定一层具有分子识别功能的敏感膜。目前大多数SPR装置使用的都是金膜，迄今为止，有关金膜的修饰方法主要有如下几类：1.1.1 物理吸附技术将物质分子通过简单的物理吸附的方法吸附在传感芯片表面，分子与金膜之间通过疏水作用、静电作用、范德华力等结合在一起，这是SPR技术最初应用时采用的方法。该技术的特点是方法简单，适用于许多种类的物质分子。但是这个方法的缺
2、点也是明显的，即物质分子在芯片表面吸附的不牢固，时间长会脱落；难以形成稳定的分子；固定量也难以控制；生物分子在金表面容易丧失活性，尤其是在温度、酸碱度以及离子强度发生变化时更易失活；固定分子的取向也难以控制。1.1.2 LB膜技术LB膜技术是20世纪20-30年代由美国科学家Langmuir及其学生Blodgett建立的一种单分子膜堆积技术。它的基本原理是：将带有亲水头基和疏水长链的两亲性分子在亚相表面铺展形成单层膜，然后将这种气/液界面上的单层膜在恒定压力下转移到基片上，形成LB膜。按改变膜转移时基片表面相对于水面的不同运动方向，可以把LB膜的制备分成X、Y和Z三种方式。将基片表面垂直于水面
3、向下挂膜，使成膜分子的疏水端指向基片，称X法；将基片反向从水下提出挂膜，使成膜分子的亲水端指向基片，称Z法；将基片上下往返运动挂膜，使各层分子的亲水和疏水端依次交替指向基片，称Y法。LB 膜与其他膜相比具有以下特点： (1) 膜的厚度可以从零点几纳米至几纳米；(2) 高度各向异性的层状结构； (3) 理论上具有几乎没有缺陷的单分子层膜；LB膜法实质上是一种人工控制的特殊吸附方法，可在分子水平上实现某些组装设计，完成一定空间次序的分子组合。通过该方法可以将液面上有序排列的某些有机分子逐层转移到固定基片上，实现基片上的特定分子的高度有序排列。图1.1 LB膜的制备原理但是，LB膜自身存在着一些难以
4、克服的缺点，限制了它的实际应用。LB膜中的分子与基片表面、层内分子之间以及层与层之间多以作用较弱的范德华力相结合。因此，LB膜是一种亚稳态结构，对热、化学环境、时间以及外部压力的稳定性较差；膜的性质强烈依赖于转移过程。LB膜的缺陷多、成膜分子一般要求为双亲分子、设备的高要求以及成膜过程与操作的复杂性等严重限制了LB膜在生物传感器中的实际应用。1.1.3 分子自组装技术为了克服LB 膜的稳定性差和制备需要昂贵仪器等缺点，自组装膜应运而生。分子自组装成膜的基本原理是通过固-液界面间的化学吸附(表面化学反应)进行的：在表面活性剂的有机溶液中，浸入某种表面物质的基片，活性剂分子的反应基(头基)与基片表
5、面物质自动发生连续的化学反应，在基片表面形成由化学键连接的取向、紧密排列的二维有序的单分子膜，同层内分子间的作用力仍然为范德华力。巯基SH和Au之间有较强的相互作用，带有巯基的分子在金表面可以自发地形成有序结构，而且稳定性非常高。A u-S键极易自发形成并释放热量，硫醇、硫醚或二硫醚衍生物中的S原子与Au表面的强烈相互作用遵循软硬酸碱作用原理。形成Au-S键使得硫化合物在金表面形成的SAMs具有良好的稳定性、致密性、有序性。由于许多药物分子和生物提取物都含有SH基和SS基，利用A u-S键，可直接将连接有巯基的生物分子组装于金表面；也可先获得尾端带有功能基团的含硫化合物在金表面的SAM ，利用
6、尾端的功能基团直接或在活化剂(或偶联剂) 的作用下连接上生物功能分子, 从而实现生物功能分子与基底的稳定结合。选择不同的自组装分子，可以将传感芯片修饰成不同的表面：疏水或亲水的，带有正电或负电的，或者带有其他活性基团，在此基础上再固定其他分子。自组装技术已经广泛被用来在金属表面构建致密有序的分子层结构。 图1.2分子自组装单分子膜的制备原理1.1.4 交替沉积技术基于化学吸附的分子自组装多层膜是通过化学键连接在一起的，稳定性较好，有序度也较高，看起来是一种好的制备自组装多层膜的技术。但是，在实际操作中，快速、定量的化学吸附要求有高反应活性的分子和特殊的基底作保障，由于通常的化学反应的产率很难达
7、到100%，使得用这种自组装技术制备结构有序的多层膜并不容易。这就需要发展新的、更简单有效的超薄膜制备技术。1991年 ，在IIer等人的工作基础之上，Decher等人提出一种新的纳米复合薄膜制备技术，由于形成薄膜的驱动力是带相反电荷的组分之间的静电引力，因此这种技术被称为静电自组装薄膜技术(Electrostatic Self-assembly，ESA)。这种技术制备超薄膜的过程十分简单，以聚阳离子和聚阴离子在带正电荷的基片上的交替沉积为例，超薄膜的制备过程可描述如下（如图1-3 所示）：（1）将带正电荷的基片先浸入聚阴离子溶液中，静置一段时间后取出，由于静电作用，基片上会吸附一层聚阴离子。
8、此时，基片表面所带的电荷由于聚阴离子的吸附而变为负；（2）用水冲洗基片表面，去掉过量吸附的聚阴离子，并将沉积有一层聚阴离子的基片干燥；（3）将上述基片转移至聚阳离子溶液中，基片表面便会吸附一层聚阳离子，表面电荷恢复为正；（4）水洗，干燥。这样便完成了聚阳离子和聚阴离子组装的一个循环。重复（1）至（4）的操作便可得到多层的聚阳离子/聚阴离子超薄膜。尽管这种组装技术构筑的超薄膜的有序度不如LB 膜高，但与其它超薄膜的制备技术相比较，它仍具有许多的优点：（1）超薄膜的制备方法简单，只需将离子化的基底交替浸入带相反电荷的聚电解质溶液中，静置一段时间即可，整个过程不需要复杂的仪器设备；（2）成膜物质丰富
9、，适用于静电沉积技术来制备超薄膜的物质不局限于聚电解质，带电荷的有机小分子、有机/无机微粒、生物分子，如蛋白质、DNA、病毒、酶等带有电荷的物质都有可能通过静电沉积技术来获得超薄膜；（3）静电沉积技术的成膜不受基底大小、形状和种类的限制，且由于相邻层间靠静电力维系，所获得的超薄膜具有良好的稳定性；（4）单层膜的厚度在几个埃至几个纳米范围内，是一种很好的制备纳米级超薄膜材料的方法。单层膜的厚度可以通过调节溶液参数，如溶液的离子强度、浓度、PH值，以及膜的沉积时间而在纳米尺度范围内进行调控；（5）特别适合于制备复合超薄膜。将相关的构筑基元按照一定顺序进行组装，可自由地控制复合超薄膜的结构与功能。图
10、1-3 静电自组装多层膜的制备过程1.1.5 共价固定技术共价固定法已成为SPR研究中应用最广泛的固定方法，就是将物质分子通过化学键共价交联的方法固定在传感芯片表面。采用这种固定方法首先要在传感表面通过吸附或自组装固定一层物质，然后将要固定的配体固定其上。由于是通过共价键连接，因此固定分子的稳定性大大提高，而且方法也比较简单。根据固定时反应基团的不同可以分为几类：氨基交联法、醛基偶联法以及二硫键交换法等。其中，氨基交联法是应用最多的方法，用EDC/NHS活化传感片表面的羧基，活化的羧基与配体上的氨基自发的反应形成共价键，从而将生物分子交联到传感片的表面。根据具体要求，可选直接化学交联或亲和捕获
11、等方法。图1.2 化学键共价固定技术的制备原理1.1.6 分子印迹膜技术聚合物材料由于成本低、易加工、物理或化学性能修饰比较简单等优点，在传感器的发展中具有举足轻重的地位，目前已成为信息传感材料的主体。将聚合物材料以膜的形式通过适当的方式固定在SPR传感器的传感芯片表面作为敏感膜，不仅使SPR传感器具有特异识别性和高效选择性，而且还能够使SPR传感器获得较小的干扰以及重复使用性能，有效地提高了SPR传感器的灵敏度和稳定性。由于聚合物薄膜的优良特性，目前已逐渐被人们用作SPR传感器中传感芯片的敏感膜材料。分子印迹技术是近年来发展起来的一种合成对某一特定分子(印迹分子) 具有选择性的聚合物的方法。
12、 该方法已成为高分子聚合物中储藏分子信息的有效手段，可以使聚合物在分子水平(层次) 上对特定物质进行识别。其中从应用角度，分子印迹聚合物又可分为不同的类型，分子印迹膜正是研制传感器关键器件的最佳选择。分子印迹膜具有操作简便，耗能少，反应时间短，干净无污染等特点。同生物膜相比，又具有耐恶劣环境、稳定性高、易于处理和应用的优点。基于分子印迹膜的SPR传感芯片能选择性地识别结合印迹分子，并由信号转换器根据结合过程中光学参数的变化输出信号，而信号的强弱决定于印迹分子物质浓度的高低。图1.4 分子印迹膜修饰SPR传感芯片的制备原理由于“分子印迹”是一个综合性的概念，并易于操作，因此许多较宽范围和通用性的
13、应用战略已被提出，并加以实施。虽说方法的基本概念已经实现，同时一些高聚物也取得了实际应用，但这一技术仍处于发展之中，有很多问题急需要解决。分子印迹高聚物常可和天然抗体相比较。然而，它们间仍存在相当宽的空隙和差异。存在差异之一是接受键合目标分子的环境，或溶剂有所不同。迄今报告过的许多合成的印记高聚物，仅在有机溶剂中才能表现出它的功能。而天然抗体则是在水中工作的。近年来，化学家已将注意力指向非有机的即水基的体系，然而有关在水相体系中的印迹高聚物报告仍很有限，主要困难是在水中时，溶剂会妨碍印迹的实现：（1）在大量的水中时，模板和功能单体预组织中最受偏爱的氢键，就会因溶剂的竞争而破坏；（2）用于水中的
14、通用水溶性交联剂（如N，N-亚甲基双）不能充分地增强高聚物，因此所得的高聚物在用作敏感膜时，就会出现刚性不足的问题。1.1.7 基于某些分子间特异相互作用的固定技术还有一些固定方法是基于某些分子间特异性的相互作用，如生物分子的特异性识别。人们已经发展了基于生物素-亲和素、糖-凝集素（或伴刀豆球蛋白）、蛋白A-抗体Fc片段以及抗体-抗原、受体-配体和金属螯合作用等特异性相互作用而将分子捕获在传感芯片表面的固定方法，即首先固定其中一种分子，再将另一种分子或标记另一种分子的物质通过相互作用而固定。这种固定方法的优点是：（1）分子间的相互作用一般比较牢固，传感片可以重复利用；（2）由于捕获分子和配体的
15、间具有特异性的识别作用，因此在配体的固定的同时还可以起到一定的纯化作用，甚至可以从混合物中直接捕获配体分子而不需要纯化；（3）由于是在特定位点进行进行识别固定，配体分子以比较一致的取向而固定；（4）捕获分子的存在，使固定的配体远离了传感表面，减小了表面对分析物与配体结合的空间障碍；1.2 金表面寡核苷酸探针分子的固定技术目前，在金表面固定寡核苷酸探针分子的技术可以分为两种：一是修饰DNA的固定技术。在DNA的末端连接含硫化合物、生物素或氨基等，再通过这些基团将DNA探针固定在金表面；二是不修饰DNA的固定技术。由于在DNA的5端和3端分别存在可以利用的磷酸基团和羟基基团，可以在金表面修饰能与这
16、两种基团反应的功能性基团，如羧基、氨基或羟基等，通过化学反应将DNA共价固定在金膜表面。1. 含硫化合物修饰的DNA（HS-ssDNA或-SS-ssDNA）探针的固定（1） 探针直接处理金表面的固定技术（2） 通过胶体金的固定方法修饰DNA探针的固定金表面寡核苷酸探针分子的固定2. 生物素修饰的DNA（biotin-DNA）探针的固定（1）亲和素在羧基修饰的金表面固定技术（2）亲和素在生物素修饰的金表面固定技术（3）亲和素在负电聚合物修饰的金表面固定技术3. 氨基修饰的DNA（H2N-ssDNA）探针的固定1. DNA探针在羟基修饰的金表面固定技术不修饰DNA探针的固定2. DNA探针在氨基修
17、饰的金表面固定技术3. DNA探针在羧基修饰的金表面固定技术4. DNA探针在醛基修饰的金表面固定技术5. DNA探针在硅烷化的金表面固定技术1.2.1 修饰DNA的固定技术1.2.1.1 含硫化合物修饰的DNA（HS-ssDNA或-SS-ssDNA）探针的固定1.2.2 不修饰DNA的固定技术 1.3 BIAcore系列SPR芯片产品1) 传感芯片CM5用途最广的芯片传感芯片CM5表面覆盖了一层葡聚糖。带有化学基团如NH2，SH，CHO，OH，COOH的生物分子（Ligand）可通过化学反应，以共价键耦联的方式与葡聚糖上的羧基耦联。从而使生物分子耦联到传感片表面。2) 传感芯片SA捕获生物素
18、标记的肽片段、蛋白质、DNA传感芯片SA表面覆盖了一层链霉抗生物素（Streptavidin），能与被生物素标记的分子量大小各异的肽片段、蛋白质、DNA结合。是研究DNADNA，RNADNA，RNA蛋白质间相互作用的理想芯片。3) 传感芯片NTA通过金属螯合作用捕获生物分子（Ligands）传感芯片NTA表面耦联了氨三乙酸（NTA），通过镍组氨酸修饰离子螯合作用将末端组氨酸修饰的生物分子（Ligands）连接到芯片表面。类似组氨酸修饰的亲和层析，组氨酸修饰在生物分子的末端，因此用次法将生物分子连接到芯片，可以很好地保持生物分子的空间结构。4) 传感芯片HPA构建细胞膜研究模型传感芯片HPA提供了一个疏水表面，研究者可方便地在芯片表面铺上脂质体。要研究的受体就嵌在磷酸分子层中，因此HPA芯片是研究细胞膜受体在膜环境中与配体相互作用的理想芯片。5) 传感芯片L1直接抓住细胞的芯片传感芯片L1表面由亲脂的葡聚糖化合物组成，该化合物能直接插入磷脂双分子层将脂质体或细胞抓获到芯片表面。可研究位于与膜内外或跨膜的蛋白、受体等，是研究膜蛋白信号传导的理想芯片。11