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1、山东畜牧兽医职业学院 动物微生物及免疫教案授课内容血清学实验（二）教学方式PowerPoint讲授授课班级授课时数2教学目标说出沉淀试验的概念、类型和应用，补体结合试验的实验系统和结果。教学过程 复习提问并导入新课（约3min）回顾血清学试验的类型 教学内容（约82min） 11-3 沉淀试验一、原理：可溶性抗原抗体Ag-Ab 沉淀现象二、类型1环状沉淀试验：炭疽病的诊断、细菌的定型、血迹鉴定等2絮状沉淀试验3琼脂扩散试验：抗原与抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散，当两者比例适当处相遇，发生沉淀反应，出现肉眼可见的沉淀带。（1）单向单扩散 （2）单相双扩散 （3）双向单扩散（4）双相双扩散教学方
2、法：比方、举例 11-4 补体结合试验 简介补体结合试验的原理、结果和应用。 11-5中和试验简介中和试验的原理、结果和应用。11-6 免疫标记技术简介免疫标记技术的原理 特别介绍ELISA和荧光抗体技术 小结（5min） 复习思考题1什么是沉淀试验？ 2琼脂扩散试验的原理和应用？标记的内容为重点，标记的内容为难点。第三节 沉淀试验一、沉淀试验的概念沉淀试验：可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test）。参与
3、沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。二、沉淀试验的类型（一）环状沉淀试验（ring precipitation test） 用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定。（二）琼脂凝胶扩散试验 简称琼扩， 1.概念：1%琼脂凝胶的孔径约为85nm，因为凝胶网孔中充满水分，小于孔径的抗原或抗体分子可在琼脂凝胶中自由扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例适当处相遇时，即可发生沉淀反应，因形成的抗原抗体复合物为大于凝胶孔径的颗粒，不能在凝胶中再扩散，就在凝胶中形成肉眼可见的沉淀带，称此试验为琼脂凝胶扩散试验。2.琼脂扩散分四类(图11-3)：单向单扩散 单向双扩
4、散 双向单扩散 双向双扩散。（1）双向单扩散 又称辐射扩散 应用：传染病的诊断，如鸡马立克氏病的诊断。（2）双向双扩散 应用最广泛 应用：细菌、病毒的鉴定和传染病的诊断。如检测口蹄疫、马立克氏病、禽流感、传染性法氏囊病的琼脂扩散方法。双扩散用于检测抗体(图11-4)琼脂扩散四种基本类型（据陆承平） 双扩散用于检测抗体（据陆承平）（三）免疫电泳 免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。优点：在琼脂扩散的基础上，提高了反应速度、反应灵敏度和分辨率。在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。 1.对流免疫电泳(图11-5) 是将双向双扩散与电泳技术相结合的免疫检测技术
5、。用于多种传染病的快速诊断。如口蹄疫、猪传染性水疱病等病毒病的诊断。2.火箭免疫电泳(图11-6) 是将辐射扩散与电泳技术相结合的一项检测技术，简称火箭电泳。将pH8.28.6的巴比妥缓冲液琼脂融化后，冷至56左右，加入一定量的已知抗血清，浇成含有抗体的琼脂凝胶板。在板的负极端打一列孔，孔径3mm，孔距8mm，滴加待检抗原和已知抗原，电泳210h。电泳时，抗原在含抗血清的凝胶板中向正极迁移，其前锋与抗体接触，形成火箭状沉淀弧，随抗原继续向前移动，此火箭状锋亦不断向前推移，原来的沉淀弧由于抗原过量而重新溶解。最后抗原抗体达到平衡时，即形成稳定的火箭状沉淀弧（图11-6）。在试验中由于抗体浓度保持
6、不变，因而火箭沉淀弧的高度与抗原浓度呈正比，本法多用于检测抗原的量（用已知浓度抗原作对比）。第四节 补体结合试验 一、基本原理（图11-7）本试验包括两个系统共五种成分：检测系统（溶菌系统）：即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；指示系统（溶血系统）：包括绵羊红细胞、溶血素和补体。二、补体结合试验的基本过程及应用基本过程：第一步为反应系统作用阶段第二步是溶血系统作用阶段观察结果：最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合，结果是阳性；最终表现是溶血，说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，结果是阴性。应用：1.诊断传染病，如结核、副结核、鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、
7、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、锥虫病等。2.鉴定病原体，如对流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。第五节 中和试验 根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。体外中和试验是
8、将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。一、终点法中和试验l终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。(一)固定病毒稀释血清法 将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和
9、效价。1.病毒毒价单位 病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD50)作为毒价单位，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作为指标的，可用半数感染量(ID50)。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数
10、保护量(PD50)。2.病毒毒价测定 将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3，选择46个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组36只(个、孔)。接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。以TCID50测定为例说明如下：按Karber法计算，其公式为lgTCID50=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组
11、死亡（感染）数/试验数相加。若以测定某种病毒的TCID50为例，病毒作10-410-7稀释，记录其出现细胞病变（CPE）的情况（表11-1）。则L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16lgTCID50=(-4)+(-1)(2.16-0.5)=-5.66。TCID50=10-5.66，0.1ml。TCID50为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.66（1/105.66）时，每孔细胞接种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少TCID50或（LD50等）表示。如上述病毒的毒价为105.66 TCID50/0.1ml，即106.66
12、 TCID50/ml。表11-1 病毒毒价滴定(接种剂量0.1ml)病毒稀释CPE阳性数阴性数%10-4 10-510-610-76 5200 146100 833303.正式试验 将病毒原液稀释成每一单位剂量含200LD50(或EID50、TCID50)，与等量递进稀释的待检血清混合，置37感作1h。每一稀释度接种36只（个、管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组动物的存活数和死亡数，同样按Reed-Muench法或Karber法计算其半数保护量（PD50），即该血清的中和价。 (二)固定血清稀释病毒法 将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列无菌试管，第一列加等量正常血清(对照组)，第二列加等
13、量待检血清(中和组)；混合后置37感作1h，每一稀释度接种36只试验动物(或鸡胚、组织细胞)，记录每组动物死亡数、累积死亡数和累积存活数（表11-2），按Karber法计算LD50，然后计算中和指数。中和指数=中和组LD50/对照组LD50。按表11-3的结果：中和指数=10-2.2/10-5.5=103.3，查3.3的反对数为1995，即103.3=1995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1994倍。通常待检血清的中和指数大于50者即可判为阳性，1040为可疑，小于10为阴性。表11-2 固定血清稀释病毒法中和指数测定举例病毒稀释10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
14、 10-6 10-7LD50中和指数正常血清组 待检血清组 4/4 3/4 1/4 0/4 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/410-5.5 10-2.2103.3=1995二、空斑减数试验（Plague reduction test）空斑或蚀斑是指把病毒接种于单层细胞，经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态。空斑减数试验是应用空斑技术，使空斑数减少50%的血清稀释度为该血清的中和效价。试验时，将已知空斑形成单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加等量递进稀释的血清，37感作1h。
15、每一稀释度至少接种3个已形成单层细胞的培养瓶，每瓶0.20.5ml，37感作1h，使病毒与血清充分作用，然后加入在44水浴预温的营养琼脂（在0.5%水解乳蛋白或Eagles液中，加2%犊牛血清、1.5%琼脂及0.1%中性红3.3ml）10ml，平放凝固后，将细胞面朝上放入无灯光照射的37 CO2培养箱中。同时用稀释的病毒加等量Hanks液同样处理作为病毒对照。数天后分别计算空斑数，用Reed-muench法或Karber法计算血清的中和滴度。第六节 免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术酶标抗体技
16、术同位素标记抗体技术优点：敏感性和特异性大大超过常规血清学方法一、荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）用荧光色素标记（一）原理 将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合（二）荧光色素 可用于标记的荧光色素有：异硫氰酸荧光黄(FITC)：应用最广，呈现明亮的黄绿色荧光，荧光抗体四乙基罗丹明(RB 200)四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1标本片的制备 标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，制成涂片或压印片。
17、感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。标本固定的目的：一是防止被检材料从玻片上脱落；二是消除抑制抗原抗体反应的因素最常用的固定剂是丙酮和95%的乙醇固定后用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。2染色方法 荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。（1）直接法（图11-8） 荧光色素标记的抗体染色优点：简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点：敏感性偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。（2）间接法（图11-9） 荧光色素标记的第2抗体(抗抗体)染色间接法的优点是，比直接法敏感，对一种动物只需制备一种荧光抗抗体，即可用于多种抗原或抗体
18、的检测，镜检所见荧光也比直接法明亮。（3）抗补体法 荧光标记的抗补体抗体染色液特异性和敏感性均高，但易产生非特异性荧光。3荧光显微镜检查 荧光显微镜，倒置荧光显微镜观察。（四）荧光抗体标记技术的应用 1细菌病诊断 2病毒病诊断 二、酶标抗体技术（enzyme-labelled antibody technicque） （一）原理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性酶催化反应的高度敏感性:酶是一种催化剂，不被消耗，能反复作用，微量高效性，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。 既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。（二）用于标记的酶 用于标记的酶:辣根过氧化物酶(HRP) 碱
19、性磷酸酶HRP作用底物是过氧化氢，常用供氢体有： 邻苯二胺(0PD) ：D氧化后形成可溶性产物，橙色，不稳定，须现用现配3,3,-二氨基联苯胺(DAB)：反应后形成不溶性的棕色物质，可用光学显微镜和肉眼观察（供氢体为显色剂，因能在HRP催化H2O2生成H2O过程中提供氢，自己生成有色产物）HRP可制成酶标抗体。（三）免疫酶组织化学染色技术 又称免疫酶染色法。是将酶标记的抗体应用于组织化学染色，以检测组织和细胞中或固相载体上抗原或抗体的存在及其分布位置的技术。1标本制备和处理 2染色方法 。 （1）直接法 酶标抗体 （2）间接法 酶标记的抗抗体。 3显色反应 4标本观察 优于免疫荧光抗体技术之处
20、，在于毋须应用荧光显微镜，且标本可以长期保存。 （四）酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 1固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。2包被 将抗原或抗体吸附于固相表面的过程，称载体的致敏或包被3洗涤 通常采用含助溶剂吐温-20(最终质量分数为0.05%)的PBS作洗涤液。4试验方法 （图11-10）（1）间接法 用于测定抗体 酶标记的抗抗体 样品中含抗体越多出现颜色越快越深（2）夹心法 又称双抗体法 用于测定大分子抗原 酶标记的特异性抗体颜色的深浅与样品中的抗原含量成正比。（3）双夹心法 用于测定大分子抗原。酶标抗抗体检测
21、呈色反应的深浅与样品中的抗原量呈正比。(5)酶标抗原竞争法 用于测定小分子抗原及半抗原。用特异性抗体包被固相载体，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原对照仅加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。如待检溶液中抗原越多，被结合的酶标记抗原的量越少，显色就越浅。可用样品的OD值求出检测样品中抗原的含量。（6）PPA-ELISA 以HRP标记SPA代替间接法中的酶标抗抗体进行的ELISA酶-抗酶抗体法酶标抗体直接竞争法酶标抗体间接竞争法等。5底物显色 依供氢体而异最常用的为邻苯二胺(OPD)，产物呈棕色,可溶，避光进行显色反应加浓硫酸也常用四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，用氰氟酸终止(如用H2S04终
22、止，则为黄色)。 6结果判定 1.肉眼观察 2.测样本的光密度(OD)值（五）斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) 原理及其步骤与ELISA基本相同，不同之处在于：一是固相化基质膜代替将固相载体二是显色底物的供氢体为不溶性的。结果以在基质膜上出现有色斑点来判定。可采用直接法、间接法、双抗体法、双夹心法等。（六）酶标抗体技术的应用 此技术优点：敏感、特异、简便、快速、易于标准化和商品化等应用于多种细菌病和病毒病的诊断和检测，并多数是利用商品化的ELISA试剂盒进行操作，如猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛结核病、鸡新城疫、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等传染病的诊断和抗体监测常用此技术。