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1、关于拟南芥根系发育突变体M20的植物分子遗传学初步分析李星煜11北京汇文中学指导教师:刘栋1 王晶1 许芸2 韩铄31清华大学植物分子遗传学刘栋实验室2北京育才学校3北京汇文中学摘要根承担着植物吸收水分和无机盐、固着和支撑、合成激素等重要功能。研究植物根系发育的调控机理，无论对于基础研究还是农业生产都具有重要意义。本研究的研究对象拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物学中常见的模式植物，具有植株小、生长周期短、种子多、基因组小且被已完整测序等优点。M20是具有显著短根表型、能稳定遗存的拟南芥根系发育突变体。本研究对其进行细胞学观察并采用分子遗传学手段对突变基因进行粗定位。细胞
2、学观察发现拟南芥根系发育突变体M20的分生区长度、成熟区细胞长度均小于野生型拟南芥；细胞分裂活性较野生型拟南芥无明显差别。图位克隆粗定位结果显示，其短根性状为单基因突变，突变基因位于1号染色体的顶端。本研究所获得的结果将有可能为农作物根系结构改善提供理论依据和实践基础。关键词：拟南芥 根系发育突变体 图位克隆1 引言1.1 根是植物的重要器官根是维管植物体轴的地下部分，其承担着植物吸收水分和无机盐、固着和支撑、合成激素等重要功能。根分为根尖结构、初生结构和次生结构三部分。其中根尖又分为根冠、分生区、伸长区和成熟区。根生长最快的部位是伸长区。伸长区的细胞来自分生区。由根尖顶端分生组织经过细胞分裂
3、、生长和分化形成了根的成熟结构。研究植物根系发育的调控机理，无论对于基础研究还是农业生产都具有重要意义。1.2 拟南芥 本研究的研究对象拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物学中常见的模式植物，具有植株小、生长周期短、种子多、基因组小且被已完整测序等优点。拟南芥根系发育突变体M20具有显著表型并能够稳定遗存。1.3 研究目的及意义由于拟南芥的众多基因与其他植物有着很高的同源性，因此对于拟南芥的研究得以广泛地应用。对于拟南芥根系发育突变体M20的研究，不仅可以在理论上阐明该突变体根系发育异常的细胞学基础、对造成性状突变的基因在染色体上进行初步定位，在实践中还可能获得性状优良的遗
4、传改造作物。1.4 研究思路 首先，利用显微镜比较突变体M20与野生型拟南芥分生区长度和细胞分裂活性。然后通过显微镜观察并测量突变体M20与野生型拟南芥的成熟区细胞长度。之后通过遗传杂交和运用各种分子标记完成遗传作图群体构建及突变基因初步定位。2 实验材料与方法2.1 植物培养相关操作2.1.1 植物材料拟南芥Columbia生态型（Col）拟南芥Landsberg erecta生态型（Ler）拟南芥根系发育突变体M20（M20）2.1.2 植物培养2.1.2.1 1/2MS培养基的配置 按照附录A 中表A-1配制1/2MS培养基。2.1.2.2 培养方法及生长条件 首先，将种子表面消毒：1)
5、 计算所需种子的数量，用称量纸取到EP管中；2) 在超净工作台中，加入1ml 20%漂水，浸泡10-15min；3) 将消毒水吸出，用无菌水洗涤3-5次；4) 将无菌水吸出，加入适量0.1% agar悬浮种子；然后，将种子在1/2MS培养基中线性排列。4春化2天后，竖直放入23 、长日照（16h光照，8h黑暗）、光强一般为5000-6000Lux的植物生长室中。培养用土为花卉营养土和蛭石混合而成，两者比例为1:1，需要种在土中的植物先在1/2MS培养基平板上萌发一周左右，将幼苗转移到土中。2.2 细胞学观察及分析方法2.2.1 分生区长度的测量将M20和Col的种子线性铺在1/2MS培养基上，
6、竖直培养。分别于生长3天、6天、9天时取两种各10棵幼苗。剪取从根的尖端区域，移至滴入HCG的载玻片上。在微分相差干涉显微镜下对分生区细胞数量进行计数，并计算平均值和标准差。2.2.2 成熟区细胞长度的测量将M20和Col的种子线性铺在1/2MS培养基上，竖直培养。分别于生长4天和9天时取10棵M20幼苗和3棵Col幼苗。剪取从根的尖端区域移至载玻片上。在微分相差干涉显微镜下测量每条根上成熟区内10个细胞长度并取平均值及标准差。2.2.2 分生区细胞分裂活性的观察将M20与含有Cyclin-B的标记植株杂交，取F1代种子分别在P+和P-上培养。取F2代植株根的尖端区域移至载玻片上，在微分相差干
7、涉显微镜下观察蓝色区域深浅程度及面积。2.3 图位克隆图位克隆技术是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着拟南芥基因组测序工作的完成，已经有很多的分子标记可以用于图位克隆。目前，适用最广泛的分子标记主要是简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphisms, SSLP）以及酶切扩增多态性（cleaved amplified length polymorphic sequences, CAPS）。它们都是基于PCR和琼脂糖凝胶电泳的分析技术，检测非常直接、方便。本研究采用SSLP分子标记对筛选到的突变体进行粗定位。2.3.1
8、 DNA的提取1) 取拟南芥叶片研磨，每管加入600lCTAB;2) 置于恒温65中30min60min；3) 加入氯仿异戊醇（24：1）600l，摇匀后静置5min；4) 放入离心机于转速12,000r/min离心5min，取上层清液；5) 加入400l异丙醇；6) 取44管DNA，放入离心机于转速12000r/min离心10min，倒掉废液；7) 加70%乙醇500l 600l，静置1min后倒掉乙醇；8) 静置30min；9) 加入无菌水后静置2min。2.3.2 作图群体的制备1) 以突变体M20（Col生态型）为母本，Ler野生型为父本杂交，收F1代种子；2) F1代自交，收F2代种
9、子；3) 在F2代幼苗中挑选带有突变表型的植株45棵，移入土中生长；4) 单株提取基因组DNA。2.3.3 突变基因在染色体上的初步定位1) 粗定位SSLP分子标记采用本实验室已有的分别分布于拟南芥5条染色体顶端、中间和末端的14对SSLP分子标记进行检测（见附录B）2) PCR扩增反应体系：基因组DNA模板1.5l10M Primer F0.5l10M Primer R0.5l10PCR buffer2.0ldNTP (2.5mM each)1.0lrTaq (Takara, R10T1, 5U/l)0.3lddH2O14.2l反应程序如表1所示。3) PCR产物进行4%琼脂糖凝胶电泳。12
10、0V电压下电泳1 2h，之后在凝胶成像系统中检测结果。表1 图位克隆粗定位PCR反应程序LoopCycleSegment1195 5min23594 30sec; 55 30sec; 72 45sec3172 5min3 实验结果与讨论3.1 M20根系发育异常3.1.1 M20与Col根系发育的比较图1 M20与Col根系发育的比较图1为M20与Col在1/2MS培养基上生长7天时所拍摄的照片。自种子萌发后第2天起，M20的主根长度即明显短于Col，且M20的根毛也较Col更少、更短。3.1.2 M20与Col分生区细胞数量的比较图2 在1/2MS培养基中培养第四天时M20与Col分生区长度
11、的比较图3 在1/2MS培养基中培养第六天时M20与Col分生区长度的比较图4 在1/2培养基中培养第九天时M20与Col分生区长度的比较图5 M20与Col分生区长度的比较M20和Col在1/2MS培养基中培养第4、6、9天时的数据显示，M20的分生区细胞数量明显少于Col，且二者分生区细胞数量的差值随培养时间增加而逐渐增大。通过以上数据分析得知，分生区细胞数量较少是M20短根表型的细胞学基础。3.1.3 M20与Col成熟区细胞长度的比较图6 在1/2MS培养基中培养第4天时M20与Col成熟区细胞长度的比较图7 在1/2MS培养基中培养第9天时M20与Col成熟区细胞长度的比较图8 M2
12、0与Col成熟区细胞长度的比较M20与Col在1/2MS培养基上培养第4天和第9天时的数据显示，M20成熟区细胞的平均长度明显小于Col成熟区细胞的平均长度，且二者差值随培养时间增加而逐渐增大。这说明成熟区细胞平均长度较小是M20短根表型的细胞学基础之一。3.1.4 M20与Col分生区细胞分裂活性的比较3.2 M20的遗传学分析3.2.1 M20突变表型的显隐性分析图9 M20的遗传学分析通过M20与Col杂交得到F1代种子,然后使F1代自交得到F2代种子并培养。在正常条件下培养得到的69株植株中，长根植株有51株，短根植株有18株，比例接近3：1。这说明M20的短根突变为隐性突变，其遗传符
13、合孟德尔遗传定律。3.2.2 造成短根突变性状的基因的初步定位图10 图位克隆粗定位结果图中显示了对部分样品的14对分子标记的检测结果。编号为1-45的泳道分别对应45个不同样品的检测结果；C表示Columbia野生型对照的检测结果；L表示Ler.生态型对照的检测结果；H表示C与L杂交后代的检测结果。表2 图位克隆粗定位结果分子标记Columbia型出现次数所占比例T7I233680%F2J62453.3%T23E182044.4%T16F161942.2%F3N112351.1%F14M42146.7%T9J142555.6%CIW112248.9%F15B82351.1%F9F131840
14、%F9H221942.2%F8L152453.3%PHYC31942.2%MNA52044.4% 通过对14对SSLP分子标记的检测发现，在第二、第三、第四和第五号染色体上，Columbia型分子标记出现的概率均约为50%。而在第一号染色体上，对应于T7I23分子标记，Columbia型分子标记出现的概率约为80%。因此，可初步定位突变位点在第一号染色体上，且与T7I23分子标记紧密连锁。4 结论本研究以拟南芥为模式植物，希望探究根系发育突变体M20发生突变的细胞学基础并通过分子遗传学手段来定位突变位点。经细胞学观察发现，根系发育突变体M20具有显著的短根表型，其分生区细胞数量、成熟区细胞长度均远小于野生型拟南芥，且二者差值随培养时间增加而增大。M20的分裂活性与野生型拟南芥并无明显差别。遗传分析表明，突变体M20的短根突变表型是隐性的。通过应用图位克隆技术可以将突变为位点粗定位于分子标记T7I23上。