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1、云南农业大学毕业论文YUNNAN AGRICULTURE UNIVERSITY毕 业 论 文论文题目：常绿杜鹃花的DNA提取技术研究学生姓名：朱兴朗学生学号：20080340专业班级：08园林学院名称：园林园艺学院指导老师：张敬丽学院院长：李文祥2012年5月5日V云南农业大学毕业论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在老师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学生签名：日期： 年 月 日毕业
2、论文版权使用授权书本毕业论文作者完全了解学校有关保留、使用论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本论文。本论文属于1、保密 ，在 年解密后适用本授权书。2、不保密。（请在以上相应方框内打“”）学 生签名：日期： 年 月 日指导教师签名：日期： 年 月 日常绿杜鹃花的DNA提取技术研究摘 要本研究以分布于云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物(RhododendronsP.)为材料进行杜鹃属植物进行总D
3、NA提取，采用改良CTAB法和改良SDS法对照白杜鹃DNA进行提取，结果表明：改良SDS方法提取的杜鹃花总DNA不仅带亮，而且比改良CTAB法提取的DNA杂质少；采用幼叶比功能叶提取的DNA质量好。关键词：DNA提起技术；杜鹃花；CTAB法；SDS法；技术对比The Operating Theory of Essential Truth in JournalismAbstractThe research on distributed in Yunnan, Guizhou and southwest mountain ( elevation 20204435m ) of dozens of sp
4、ecies of Rhododendron ( RhododendronsP. ) were used as the materials of Rhododendron for total DNA extraction, using improved CTAB method and the improved method of SDS control white azalea DNA extraction, the results showed that: the improved method for extracting total SDS azaleas DNA not only wit
5、h a bright, and the ratio of the improved CTAB method of DNA extraction using fewer impurities; young leaves than functional leaf extract DNA good quality.Key words: DNA lift technology；Rhododendron；CTAB；SDS；Technical comparison目 录毕业论文原创性声明和毕业论文版权使用授权书摘 要Abstract附表索引一、 绪 论1二 、课题研究背景及目的1三 、从研究现状1四、实验
6、方法及内容21实验材料和实验方法21 . 1 实验材料21. 1. 1 植物材料21. 1. 2 实验仪器及药剂21 . 2 实验方法2121 杜鹃基因组DNA的提取2122杜鹃基因组DNA的检测22结果分析53结论及讨论5结 语6参考文献6附录7致谢8插图索引图1 4图2 5常绿杜鹃花的DNA提取技术研究一、绪 论杜鹃属(Rhododendron)属于杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花亚科(Rhododendrofdea e)，杜鹃或杜鹃花是杜鹃属植物的统称。19世纪中叶，英国学者在喜马拉雅考察，发现大量杜鹃，引起世界各国对中国西南高山地区杜鹃资源的注意，随后英、法、美、德、俄等国的植物学
7、家深入中国西南山地调查采集，发表了大量新种，同时大量引入中国杜鹃，并与本土杜鹃杂交，培育出无数的杜鹃新品种，使杜鹃成为西方最重要的木本花卉之一，不仅大量栽培，而且研究也相对普遍和深入。相比之下，国内对杜鹃研究较少，起步晚，在客观上形成了杜鹃“墙内开花墙外香”的局面。云南、四川、西藏三省区的高海拔山地几乎拥有中国杜鹃花种类的90%以上，有“世界杜鹃大花园”之称，观赏价值极高的常绿杜鹃在四川集中分布。基础研究滞后，严重影响野生杜鹃资源的开发利用。本研究应用计算机、电子显微镜和DNA分子标记技术，对46种杜鹃的遗传多样性、亲缘关系和系统演化进行分析，旨在探索新技术在杜鹃研究上的应用，并为野生杜鹃的准
8、确分类提供理论依据，有利于杜鹃资源的合理开发和利用。二、课题研究背景及目的杜鹃花( Rhododendron L. ) 是世界名花, 中国十大名花之一, 被誉为“木本花卉之王”。我国是世界杜鹃花属植物分布的中心和发源地, 杜鹃花达530多种, 约占世界900 余种的59%。被列入“国际人与生物圈保护区网”的长白山, 具有优越的自然条件, 非常适于各种植物生长。其中野生杜鹃花就有9种, 是整个东北地区杜鹃花属植物分布最集中的地方。在众多杜鹃花的研究文献中, 多是介绍杜鹃花的形态、生态、观赏、培养、药用等方面的报道, 从分子标记的角度研究杜鹃花的工作还较少。利用RAPD 技术进行长白山野生杜鹃的研
9、究, 国内外尚未见报道。本研究以长白山杜鹃花为试材, 对RAPD反应条件进行了优化。 三、研究现状到目前为止，全世界已知杜鹃花属种类约为967种。中国有561种杜鹃，占世界总种数的58，绝大多数常绿乔灌木型杜鹃在中国，中国是世界杜鹃的原产地和分布中心 。一些学者对杜鹃属(Rhododendron)植物运用分子标记的方法进行了一些研究，主要是采用RAPD技术 、ITS序列 ，顾奇萍等探讨了云锦杜鹃ISSR扩增条件的优化 。本试验以云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物为试验材料进行DNA提取，旨在为研究杜鹃的遗传变异奠定基础。四、研究方法及内容1 实验材料与实验方法1
10、 . 1 实验材料1. 1. 1 植物材料 材料采集于云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物嫩叶， 用硅胶只作为干标本带回实验室备用。1. 1. 2 试验仪器与药剂 主要药剂：十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)、巯基乙醇、(三轻甲基)氨基甲烷(Tris)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、异戊醇(分析纯)、异丙醇(分析纯)、硼酸(分析纯)、硅胶、琼脂糖、Taq酶、10buffer(含Mg)、ISSR引物、DNA nlarker、溴酚蓝、hDNA、液氮。主要仪器：高压灭菌锅、恒压恒流电泳仪、水平电
11、泳槽、PCR仪、高速冷冻离 tL,JL、微量移液器、水浴锅、研钵、超低温冰箱、冰箱、超净工作台、液氮罐。1 . 2 实验方法121 杜鹃基因组DNA的提取 1211改良CTAB法 (1)取7 mL离心管，加入2 mL的2CTAB提取缓冲液，50 L的巯基乙醇，置于65水中预热20 min；(2)各取1/4杜鹃花干叶片放入研钵，迅速倒入液氮，研磨至粉末状，立即转入预热的7 mL离心管中，65保温45 min，其问每隔10 lnin左右混匀1次(轻轻颠倒数次)，取出样品冷却至室温。(3)加入等体积(2 000 tzL)氯仿一异戊醇(体积比为24：1)的混合液，轻轻振荡混匀，12 000 rrain
12、离心15 min (不低于l5，否则CTAB会沉淀)。(4)取上清转至一新离心管中，重复步骤(3)。(5)取上层水相l mL，加入3 mL冰冻至一20的乙醇，一20下冰冻2 h。(6)挑出白色絮状物放入15 mL离心管中，用600 jxL 70的无水乙醇漂洗23次，瞬时离心，将沉淀置于超净工作台风干至透明状。最后，加入100 IxL超纯无菌水溶解沉淀，置4下备用，一20保存。1212改良的SDS法 (1)取7 mL离心管，加入2 mL的SDS提取缓冲液，50 L的巯基乙醇，置于65水中预热20 min。(2)各取1/4杜鹃花干叶片于研钵中，加半勺PVP(约01 g)，迅速倒人液氮，研磨至粉末状
13、，立即转人预热的7 mL离心管中，65保温45 min，其间每隔10 nlin左右混匀1次(轻轻颠倒数次)，取出样品冷却至室温。(3)加入13体积(700 ILL)的5 molL KAc(pH值48)，混匀，放入冰中30 rain；(4)加入等体积(2 000 )氯仿一异戊醇(体积比为24：1)，轻轻振荡混匀，12 000 rmin离心15 min(不低于15，否则CTAB会沉淀)。(5)取上清转至一新离心管中，重复步骤(3)。(6)取上层水相1 mL，加入3 mL冰冻至一20的乙醇，一2O冰冻2 h；挑出白色絮状物放人15 mL离心管中，用6OO 70的无水乙醇漂洗23次，瞬时离心，将沉淀置
14、于超净工作台风干至透明状。最后，加入100 btL超纯无菌水溶解沉淀，置4下备用，一20保存。 122杜鹃基因组DNA的检测 用凝胶电泳及紫外吸收法进行DNA质量的检测。琼脂糖凝胶(08)电泳是通常用来分离与鉴定DNA的简单而高效的方法，可用来检测DNA的完整性与含量。提取的植物基因组DNA的相对分子量一般可和hDNA(48 kb)相比较。将提取的基因组DNA进行电泳，若是一条集中的窄带，与KDNA分子量大小相当，则DNA完整性较好。若点样孑L有拖尾，则DNA不纯。若呈弥散状，则说明DNA降解严重。核酸在紫外分光光度计的吸收峰为260 nm，蛋白质及酚类物质的吸收峰为280 nm，因此在此波长
15、处可对微克级的比较纯的核酸进行定量，但不能区分DNA和RNA。当吸收值为1时，相当于大约50 gmL的双链DNA，40 gmL的单链DNA或RNA。在260 nm及280 nm吸光度比值可作为核酸纯度的指标。DNA和RNA纯品的这个比值分别为18和20，若D D： 明显低于此值，说明有蛋白质或酚的污染。 2 结果与分析北方露地杜鹃花6个品种的DNA提取中，R1、R2、R3 3个品种无论功能叶还是幼叶均提取出了DNA；其他3个品种只有幼叶提取出了DNA。下面以R1品种提出的DNA为材料进行纯度和浓度分析。21 琼脂糖凝胶电泳法分析总DNA的纯度和浓度通过8 gL的琼脂糖凝胶电泳分析核酸，可以看出
16、2种方法都可以提出较高质量的总DNA，改良SDS法的点样孑L比改良CTAB法提取的总DNA的点样孑L暗，说明前者去除杂质蛋白质等大分子物质的效果不如后者好(图1)。图1对比功能叶和嫩叶提取的总DNA电泳带不难发现，从嫩叶提取的总DNA浓度最高(图2)。图222紫外分光光度法分析总DNA的纯度和浓度从表2可以看出，改良CTAB法和改良SDS法所提取的幼叶DNA，其D260 D2 比值比较稳定，在I719之间；功能叶的D D 比值较低，说明含有一定的蛋白质等杂质的污染。因此，在杜鹃花的ISSR反应体系中，最好应用嫩叶所提的DNA。3 结论与讨论 由于植物细胞具有细胞壁和复杂的次生代谢物，植物细胞总
17、DNA的提取与纯化比其他物种要难得多。纯化的途径可用CSCL 梯度离心、柱层析及纯化试剂盒等方法，这些方法虽然可获得高质量的DNA，但试验步骤繁琐而且成本昂贵。有关杜鹃基因组DNA的提取已有一些研究报道，所用方法各有不同。本研究开始时应用前人对杜鹃花DNA提取方法，结果很不理想。因此，本研究使用CTAB法和SDS法进行基因组DNA提取，其中有3处有所改进：一是同时使用较高浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和巯基乙醇(3)，以消除杜鹃叶内复杂的次生代谢物的影响；二是增加酚仿抽提次数，以充分去除各种杂质；三是大量提取，微量提纯，以降低次生代谢物的影响，2种方法均能提出的较高质量的DNA，其中改良SDS
18、法效果最好。露地栽培杜鹃每年春夏发叶2次，采取嫩叶有时间限制，因此比较功能叶和嫩叶对提取结果的影响，发现以杜鹃嫩叶为材料提取出了高质量的DNA，虽然采用功能叶提取的DNA杂质相对较多，但D D 。 在154162之间，可以应用在对DNA纯度要求较低的分子标记试验中，以缓解试验材料的不足。而大字杜鹃、红枫杜鹃和黄杨杜鹃用功能叶无法提出结语本试验采用改良的CTAB 法提取杜鹃花基因组总DNA, 经凝胶电泳, 提取的DNA 质量高, 适合进行RAPD 分析。在试验中发现, 植物叶片要进行充分的研磨, 研磨后要呈现粉末状, 否则会影响提取的效果。据邹喻苹等报道, 所有抗氧化剂都要在研磨前临时加入, 否
19、则无效。本试验经验正在研磨前加入抗氧化剂- 巯基乙醇提取DNA 的质量确实要好于研磨过程中加入的。牛皮杜鹃、孢叶杜鹃基因组DNA 没有提取出来, 可能是这两种杜鹃所含有的成分比较特殊, 但孢叶杜鹃与其他的杜鹃原生境相同, 都生长在长白山的高山苔原带, 其原因有待于近一步研究。参考文献： 1黄茂如杜鹃花M上海：上海科技出版社，1998 2赵喜华，王曼莹杜鹃花RAPD条件的优化J生物技术， 2005，15(1)：4143 3段国峰，肖千文杜鹃花属植物基因组DNA RAPDPCR反应体系的优化J山西农业大学学报：自然科学版，2008，28(2)：136一 l38 4谭 萍，李 煜，赵饮虹贵州几种常见
20、杜鹃花的随机扩增多态性DNA(RAPD)研究J西北植物学报，2005，25(4)：794798 5高连明，杨俊波，张长芹，等基于ITS序列分析探讨杜鹃属映山红亚属的组间关系j云南植物研究，2002，24(3)：313320 6顾奇萍，金则新，李钧敏云锦杜鹃ISSR扩增条件的优化J广西植物，2007，27(4)：560563附录致谢四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。 伟人、名人为我所崇拜，可是我更急切地要把我的敬意和赞美献给一
21、位平凡的人，我的导师。我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。授人以鱼不如授人以渔，置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了宏伟的学术目标，领会了基本的思考方式，从论文题目的选定到论文写作的指导,经由您悉心的点拨,再经思考后的领悟,常常让我有“山重水复疑无路,柳暗花明又一村”。 感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚谢意！ 同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。 最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在论文中被我引用或参考的论著的作者。7