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1、病原物分离培养和纯化春季传染病病原菌的采 集、分离和纯培养 实验方案化药1104赵金金 病原物的分离和纯化摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在PDA培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。关键词：分离培养、炭疽病、PDA培养基、灭菌前言柯赫氏法则(Kochs Rule)又称柯赫氏假设(Kochs postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤
2、来完成诊断与鉴定。诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。 柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同”【1】。如果进行了上述四步鉴定工作得到确
3、实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家都应能熟练地运用。 柯赫氏法则同样也适用来对非侵染性病害的诊断，只是以某种怀疑因子来代替病原物的作用，例如当判断是否缺乏某种元素而引起病害时，可以补施某种元素来缓解或消除其症状，即可确认是某元素的作用。春季传染病病原菌的采集、分离和纯培养实验方案1.实验目的1 明确培养基的配制原理2 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤3通过采集和培养
4、春季传染病病原菌来更好的预防春季传染2.材料、仪器与用具2.1实验材料 柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、PDA培养基（自制）2.2仪器用具超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等三脚架、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌。3.内容与方法3.1培养基的配制过滤溶化称量培养基的制作：搁置斜面灭菌包扎分装加塞 “培养基按成分及对成分了解程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方法不同。”【2】本实验采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，简称PDA培养基。PDA培养基是植物实验室最常用的培养基，主要用
5、于植物病原真菌的分离培养。下面介绍PDA培养基的配制方法：首先准备优质去皮马铃薯200克、葡萄糖10-20克、琼脂20克，加水至1000ml。将马铃薯切成小块，加水1000ml煮沸约半小时，煮沸过程中要不断搅拌，然后用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入小块琼脂，加热融化，再加糖，待完全溶化后，趁热分装于三角瓶和试管中，注意每个三角瓶不宜装太多，以少于1/2为宜，试管中用于制备斜面培养基，也应较少，1/3左右为宜，然后将三角瓶和试管塞好棉塞以备灭菌。由于PDA略带酸性，适于真菌生长，因此不用调节pH值。3.2灭菌为了得到某种病原物的纯培养，用于培养病原物的器物和培养基必须经过灭菌才能使用。灭菌前在
6、三角瓶中加入少许孟加拉红抑制细菌和放线菌的生长。本实验采用高压蒸汽灭菌法对做好的PDA培养基和试管内斜面培养基灭菌。高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它是利用高压提高蒸汽温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：A、 关好清水阀门，放入清水至标准度为止注意水量要加足，否则易造成事故。B、 将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上气盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度，不要太紧，再旋紧相对的两个旋钮，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气不能彻底灭菌。C、 通电加温，同时打开排气活门牌尽锅内的空气，当活门喷出的全是蒸汽的时候即可关闭阀门，一定要排尽空气以达到彻底灭菌的目的，
7、通常压力表上升至5磅时打开放气降至零点再关闭。D、 压力表的指针上升时温度也随之升高，当压力表升至15磅时蒸汽压相当于一个大气压，此时计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，就能达到完全灭菌目的，然后停止加温。E、 一般应待压力表降至5磅时稍微打开排气活门，使锅内蒸汽缓慢排除，然后加大活门开口，勿使排气过快。F、 当压力表降至0时锅内蒸汽完全排尽时，打开锅盖取出培养基。然后将高压锅内水排出。G、 抽取上述培养基放入25摄氏度恒温箱中，48小时不见杂菌证明培养基已达到目的。有些培养基经高温灭菌后容易失去营养成分，则可采用间歇性蒸汽灭菌法，即每天保持100摄氏度一个小时连续三天也可达
8、到灭菌效果。3.3病原真菌的分离培养 为了获得分离菌的纯培养，必须进行分离菌的纯化，本实验采用组织分离法分离炭疽病菌。分离培养一般在超净工作台上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用紫外线照射消毒，工作前将所需物品放在超净工作台内，操作人员需用肥皂洗手，操作时还需用70%的酒精擦拭双手，操作时呼吸要轻，不要说话。操作方法如下：A、 取灭菌培养基一个置于湿纱布上，在皿盖上表明分离日期、材料和分离人姓名，并分别将10s、15s、20s、25s四个标示均匀标示到培养皿背面备用。点燃酒精灯。B、 将培养皿拿在手上在酒精灯上烘烤皿口一圈，用无菌培养操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴，然后将溶化冷至
9、60摄氏度左右的PDA培养基倒入培养皿中，每皿倒15-20毫升，轻轻摇动使成平面，凝固后即成平板培养基。C、 取辣椒或柑橘炭疽病新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘既病健结合部切取长宽3-4mm的方形小块病组织数块。D、 取5个灭菌培养皿，两个分别加入75%酒精、0.1%升汞，其余三个加入适量无菌水。将切好的病组织放入75%酒精中浸泡3-5秒（消除表面张力），然后按无菌操作法将病组织移入0.1%升汞液中分别进行表面消毒10s、15s、20s、25s，然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留消毒剂。E、 将漂洗后的病组织放到无菌吸水纸上吸取多余水分，减少细菌污染，然后在酒精灯火线
10、前用无菌操作法分别将消毒时间为10s、15s、20s、25s的病组织各1个分别放入培养皿对应标识的位置，然后迅速将培养皿盖上。F、 将培养皿放到25摄氏度左右恒温箱内培养。前两天主要观察是否被细菌污染，后两天主要观察待分离菌生长情况。G、 若病组织长出较为一致的菌落则多半为要分离的病原菌，为确定病原物是否为需要分离培养的病原物，可挑取菌落镜检，观察其形态特征，若与之前看到的一致即为所需病原物。待病原菌生长到一定情况，取出培养皿，在超净工作台内用接种环在菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上（接种环使用前在酒精灯火焰上烘烤数秒，防止杂菌滋生），在25摄氏度左右恒温箱内培养，数日后观察待分离菌生长状况，
11、如无杂菌生长，即得到该病菌的纯菌种，便可置于冰箱中保存。 如需验证此病害，可将分离培养所得病原物通过无菌操作接种到健康的相同植株上，保湿培养数日，观察其所致病害特征是否与原来一致，如一致，可再将其病原物分离培养观察其性状是否与第一次分离培养的病原物一致。4.结果分析4.1实验结果分离培养所得病原物菌落多数在平板培养基中生长良好，呈纯白色或灰白色，约有极少数被细菌污染，呈乳胶状，灰色。约3天后接种到斜面培养基中，生长数天后观察生长良好，无杂菌污染，呈黑褐色。挑取菌落部分与显微镜下观察，其分生孢子着生于分生孢子盘内壁上，分生孢子梗呈无色或褐色，分生孢子为无色单胞，长椭圆形或新月形，有的分生孢子盘上
12、还长有黑褐色刚毛。4.2结果分析 本实验过程主要为科赫氏法则的前两步，通过实验操作，了解了分离培养的基本原理和方法，基本掌握了消毒灭菌方法和培养基的制作、无菌操作技术，了解了科赫氏法则的程序和方法。5.分析讨论 炭疽病属菌物描述如下：“分生孢子盘在寄生角质下、表皮或表皮下，黑褐色，人工培养时有时产生菌核，在菌核和分生孢子盘上有时生有黑褐色的刚毛，分生孢子梗无色至褐色，产生内壁芽生式分生孢子，分生孢子为无色，单胞，长椭圆形或新月形，有的含有1-2个油球萌发之后芽管顶端产生附着胞，引起多种瓜果和蔬菜炭疽病。”【1】普通植物病理学实验指导上对此描述大致一致。本实验分离培养得到的病原物特征与炭疽病病原物描述一致，因此可以得知所得病原物为半知菌类腔孢纲黑盘孢目（melanconiales）炭疽病属（Colletotrichum）病菌，病原物分离源来自于辣椒炭疽病，可以验证分离培养操作得到纯化的为所需病原物。以上两个方面说明本次实验是成功的。实验中应注意多过程应在无菌条件下操作，灭菌操作时注意安全，灭菌一定要彻底。9