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1、质粒DNA的提取与电泳检测,一. 实验目的,1.通过质粒DNA的提取和检测，掌握提取质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。,二. 实验原理,1.质粒概述: 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。,目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%-3%,大小在1Kb-200Kb之间。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，
2、如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。,2。质粒DNA的提取： 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA， 这些方法都含有以下3个步骤： 细菌培养物的生长。 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化。,三. 仪器和试剂,试剂: 1、质粒快速提取试剂盒 溶液1（SET缓冲液）、溶液2（Lysis Buffer)、溶液3（3M NaAc,Ph4.8)、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管 2、电泳检测 TAE缓冲液、琼脂糖、Loading buffer、EB 仪器、耗材： 台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、移液器、1.5ml Eppendorf管,四. 操作步骤,(1)培养细菌:大肠杆菌
3、接种到LB培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时. (2)收集菌体：取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液. (3)裂解：加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打混匀后, 加入150ul溶液2（用完立即拧紧瓶盖）,温和颠倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒5-10次,放置5分钟. 12000rpm离心5分钟 (4)收集质粒：取吸附柱，加入420ul结合缓冲液，取离心后的上清液到吸附柱中（不要吸到蛋白沉淀），混匀. 12000rpm离心30秒,弃去废液.吸附柱装回收集管。,(5)向吸附柱加入700ul漂洗液， 12000rpm离心30秒。倒掉废液，装回吸附柱。 (6)重复（5），再次12000rpm离心2分钟以完全去除漂洗液。 (7)回收质粒：将吸附柱移到一个新的1.5ml eppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul 洗脱缓冲液（水浴预热至70度），溶解提取物,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟. (8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.,五、试验结果,六、结果分析,问 题 思 考 ？,1.说明碱裂法提取质粒的原理? 2.电泳结果出现几个条带?各是什么?,