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1、质粒DNA的提取 纯化与鉴定,一、基因克隆的质粒载体,1、定义 双链闭环DNA； 1kb-200kb； 独立存在于宿主染色体之外； 具复制起始点； 复制和转录不同程度依赖于宿主基因； 编码某些酶，使宿主具有特殊标志， 可供选择。,2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。,3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体,4、常用质粒载体 例如
2、：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等,二、质粒DNA的分离纯化,试剂的参考配方: Solution I：50mmo1L 葡萄糖、5mmo1L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)TrisHCl(pH8.0)、1.0 mmo1L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) Solution II：0.4mo1L Na0H，2SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
3、 Solution III：5mo1L 醋酸钾 60 mL、冰乙酸 11.5mL、水 28.5mL TE缓冲液：10mmo1L TrisHCl、1mmo1L EDTA(pH8.0) （一）、细菌培养物的生长和收获 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到两支试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。,（二）、质粒DNA的提取 1将过夜培养的2-4m1细菌，12,000rpm高速离心1分钟，彻底去除上清。(菌液较多时可以多次离心收集菌体) 2加入200 l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4保存。） 3加入25
4、0 l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心管5-10次，使细菌裂解，室温放置(2-5分钟左右)至溶液变成澄清。（注：温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。） 4加入350 l Solution III，立即轻柔上下颠倒5-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2分钟。 512,000rpm高速离心15分钟。,6取出2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm离心1分钟。 7取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取700 l Wash Solut
5、ion到吸附柱，离心1分钟。 8重复步骤7一次。 9取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同支收集管中，12,000rpm高速离心2分钟。 10将吸附柱放入干净的15m1的离心管中，在柱子膜中央加30-50 l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm高速离心1分钟。 注意：将TE或水预热到50左右可以提高洗脱效率。 11取1-2 l洗脱液做浓度测定，1%琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。,三、质粒DNA的鉴定,（一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。 （二）、EB荧光分析 （三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分
6、子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。,质粒的电泳图谱,质粒DNA的鉴定和酶切分析,一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定 二、质粒的限制性内切酶消化鉴定,实验原理 DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。,一般提取的质粒有3种构型： 超螺旋的共价闭合环状 开环DNA，即共价闭合环状
7、质粒DNA有一条链断裂 线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂。 通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快， 其次为线状DNA， 最慢的为开环质粒DNA。,实验步骤 1、制备1琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀。 2、胶板的制备 1） 选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。 2）将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5l EB储存液（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 3）待胶凝固后，小心地拔出梳
8、子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。 4）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。 3、加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（5l质粒+1l 6 loading buffer)加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 4、电泳 1）接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm。 2）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。,限制性内切酶,1. 定义：识别双链DNA分子核苷酸序列 并加以切开 2. 来源：细菌的限制修饰系统 3. 特性：识别4 6个核苷酸序列 产生平端和粘端 4. 应用
9、：定点切割,酶切产生的末端,（1） G A TA T C C T AT A G EcoR酶切产生平端 G A T PA T C C T AP T A G （2） GA A T T C C T T A AG EcoR酶切产生5突出粘端 G PA A T T C C T T A AP G (3） C T G C AG GA C G T C Pst酶切产生3突出粘端 C T G C A PG GP A C G T C,酶切反应,限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 20l体积反应体系如下： A: 质粒（pGEM-T easy-NGF） 0.2-1 g B: 10酶切buffer 2.
10、0l C:限制性内切酶 EcoR 0.5l D: 加ddH2O 至20l 37水浴消化1小时。,质粒的酶切电泳,M1 1 2 3 M2,注意事项 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。 尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。 通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。,