天然产物的提取分离与结构鉴定.ppt

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1、第二章 天然产物的提取 分离和结构鉴定,一、基本概念 1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。 2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。,第一节 天然产物的提取,研究天然产物化学成分的基本步骤,原材料,单体化合物,总提取物,不同部位,目的化合物,结构修饰 人工合成,提取,初步分离,精细分离纯化,水 亲水性有机溶剂 亲脂性有机溶剂,二、提取方法,超临界流体萃取法（SFE）,水蒸气蒸馏法,溶剂提取法,升华法,压榨法,溶剂,（一）溶剂提取法,溶剂提取法原理“相似相溶” 溶剂的选择取决于被提取成分化学结构、 溶解性及溶剂的性质。 注意：

2、 乙醇、甲醇虽然属于亲水性溶剂，可与水混溶，但很多亲脂性成分可溶于乙醇、甲醇，所以乙醇或甲醇提取液中既有水溶性成分，也有很多脂溶性成分。,溶剂提取法 根据天然成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从生物材料中溶解出来的一种提取方法。,溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程。 包括浸润、解吸和扩散三个阶段。,1、溶剂提取法的原理,选择溶剂依据相似相溶原理。,浸润：渗透阶段 溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。,解吸：溶解阶段 细胞内容物与细胞组织之间有亲和 力，溶剂破除这种亲和力。,扩散：置换阶段 利用细胞内的渗透力产生的压差而抽

3、提出来，用溶剂占领内容物的位置而 将内容物置换出来。,2、选择溶剂的要点 * 对所要成分溶解度大 * 沸点适中容易回收 * 低毒安全 * 廉价 天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。 最常用的溶剂为乙醇。,3、常用溶剂的分类,2. 弱极性溶剂,3. 非极性溶剂,亲脂性有机溶剂，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚、环己烷等。适合提取：除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉与部分多糖外，大多可溶；部分脂溶成分亦可溶。通过调节乙醇浓度、加酸、加碱可改变分离效果。,亲水性有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮。 适合提取

4、极性小的成分，但渗透性差，易燃、易挥发，常有毒性；样品中水分多则提取效果差,水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿苯石油醚,常见溶剂极性的强弱顺序 ：,4、溶剂的选择 (1) 水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。 (2) 亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。 (3) 亲脂性有机溶剂： 具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。 优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。,5、溶剂提取的方法,溶剂提取的方法,连续回流提取法,回流提取法,

5、煎煮法（煎中药）,渗漉法,浸渍法（泡药酒）,（1）浸渍,特点,适用于较易提取的有效成分遇热易破坏以及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的天然物的提取。,适用范围,特点：浸出率较差，特别是用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。,粉碎好的药材放入提取用的容中，加入溶剂使没过药面，浸泡12小时。 滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取,加入溶剂浸泡,12小时后,浸渍法,（2）渗漉法,向原料粗粉中不断添加溶剂，使其渗过原料，从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种浸出方法。,（2）渗漉,特点,当溶剂渗进原料溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸出液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地

6、进行。,原理,特点：浸出效率较高，浸出液较澄清。 溶剂消耗量大、费时长。,（3）煎煮法,以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原料也不适用。,传统的中药煎制。,（4）回流提取法,使用有机溶剂。对遇热易破坏的成分有影响。,（5）连续回流提取法,索式提取器的组成,循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连续提取的方法。 提取效率高，节省溶剂。但不适于热不稳定成分的提取。,也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇。不同比例的溶剂可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等。,连续回流 (索氏提取),.把滤纸做成与提取器大小相应的滤纸筒

7、，然后把需要提取的样品放入滤纸筒内，装入提取器。 注意: a.滤纸筒既要紧贴器壁，又要方便取放。（滤纸筒上可以套一圈棉线，方便提取完成后取出滤纸筒。） b.被提取物高度不能超过虹吸管，否则被提取物不能被溶剂充分浸泡，影响提取效果。被提取物亦不能漏出滤纸筒，以免堵塞虹吸管。如果试样较轻，可以用脱脂棉压住试样。,操作步骤：,.在提取用的烧瓶中加入提取溶剂和沸石（没有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸）。,.连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加热。沸腾后，溶剂的蒸气从烧瓶进到冷凝管中，冷凝后的溶剂回流到滤纸筒中，浸取样品。溶剂在提取器内到达一定的高度时，就携带所提取的物质一同从侧面

8、的虹吸管流入烧瓶中。溶剂就这样在仪器内循环流动，把所要提取的物质集中到下面的烧瓶内。,具体的回流时间是不一样的，有的是按文献要求提取一定时间，有的是提取至提取液无色，又比如用乙醚提取样品中的脂肪时是以抽提管中流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。总之就是要提取完全为止。,旋转蒸发,旋转蒸发,薄膜蒸发,6、影响溶剂提取法的因素,（1）生物材料的粉碎度,材料细，面积大，扩散快，效果好。但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提取。 花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细些。,（2）提取温度,一般使用常温，在不破坏有效成分的条件下加热不

9、要超过80C。 温度低提取时的杂质少，温度高时提取效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水提时避免热提。,（3）提取时间,以提完为准，是否完全可以提取也做定性实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断。,根据检测结果确定是否需要延长提取时间。,（4）浓度差,根据扩散原理，造成提取液的浓度差可以提高提取的效率。,可采取的措施有：搅拌、更换溶剂。,（5）新技术的使用,超声波、微波促提技术的应用，可以加快提取速度，提高提取效率。,目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率（3300W）

10、来提高萃取效率。但较大的超声波功率，又会发出令人感觉不适的噪音。,超声波促提原理：,为物理过程，无化学反应，不改变生物活性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、扩散、溶解。,实验室用小型超声仪,工业生产用超声仪,微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物从固相进入溶剂相的过程。,微波促提原理：,微波加热机制： 极性分子作用机制: 极性分子存在一定的偶极 矩，当它处于一定的静电场中时，偶极分子就有呈方 向性的趋势，即带正电的一端朝向负极，带负

11、电的一 端朝向正极。当电磁场方向变化时，偶极子的取向也 随之改变，分子发生摆动。 当微波的频率较高时，如 2450MHz ，即1秒钟内 电场变化 2.45109 次，极性分子也随之发生 2.45109次的摆动。由于分子的热运动和相邻分子 间的相互作用，阻碍和干扰分子随电场的摆动，产生 类似摩擦的作用，使分子获得能量并以热的形式表现 出来。,加热机制,微波具有穿透力强，加热效率高，操作简便、快速、节能、高效等特点。 缺点：化学成分的结构易发生变化，继而导致生物活性的改变。,微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物质的稳定性。,工业生产用微波提取罐,（二）水蒸气蒸馏法,适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏

12、而不被破坏的有效成分结构的提取。如挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。,水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶于水但有一定挥发性的有机物质中，使该有机物在低于100的温度下，随着水蒸气一起蒸馏出来。,原理：道尔顿分压定律,水蒸气蒸馏装置,常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、蒸馏、冷凝和接受器四个部分。,（三）升华法,装置图,适用范围,某些固体物质（如水杨酸、苯甲酸、樟脑等）受热后，在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可以直接转化为蒸汽，蒸汽遇冷又凝结为固体称为升华,1、将茶叶与95%乙醇回流2h； 2、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积； 3、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿在蒸汽浴上

13、蒸干，除去水份； 4、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗； 5、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色咖啡因在滤纸上结晶。,实验室提取咖啡因步骤：,升 华,（四）超临界流体萃取,在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。,物质在不同温度和压力的条件下，可以以不同的形态存在，如固体，液体，气体，超临界流体等。在超临界流体中，不同的物质有不同的溶解度，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或者溶解度小的物质分开。然后，通过升高温度，降低压力或者吸附的方法，使萃取物与超临界流体分离，而得到所需的物质。,原理,超

14、临界状态,P-T相图,气态 = 液态,临界点:气、液界面刚刚消失的状态点,(Pc、Tc),为什么超临界流体是良好的萃取剂,液体,超临界流体,气体,超临界流体的物理性质和传质特性介于液体和气体之间 超临界流体的溶解能力与液体的溶解能力接近；扩散系数接近于气体,液体,气体,超临界流体,溶解能力,扩散系数,优良性能的萃取剂,溶剂萃取和超临界萃取的对比,最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。,（三）超临界流体萃取法,超临界二氧化碳流体(SFE-CO2)临界点(31.1)相当接近室温,超临界二氧化碳萃取,

15、二氧化碳在温度高于临界温度Tc=31.26，压力 高于临界压力Pc=7.4MPa的状态下，性质会发生变化， 其密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的 100倍，因而具有惊人的溶解能力。用它可溶解多种 物质，然后提取其中的有效成分，具有广泛的应用前 景。超临界二氧化碳是目前研究最广泛的流体之一， 因为它具有以下几个特点： (1)CO2临界温度为31.26，临界压力为7.4MPa，临 界条件容易达到. (2)CO2化学性质不活泼，无色无味无毒，安全性好. (3)价格便宜，纯度高，容易获得.,利用超临界条件下流体的特殊性能对样品进行提取，是20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。,超临界流

16、体不但具有与液体接近的密度，有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率越高。,常用的超临界流体有CO2、乙烷、丙烷等。,与普通有机溶剂提取法相比，超临界CO2萃取技术具有无毒、常温、不易燃、无污染等特点，可确保原有的色、香、味不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程中可同时对萃取物进行分离纯化。该技术适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分。,超临界CO2提取的特点。,CO2,钢瓶,冷温槽,高压泵,恒 温 箱,控温面板,接受瓶,流量计,CO2,原料,玻璃珠,脱脂棉,萃取柱,超临界CO2 萃取实验装置示意图,液体CO

17、2由高压泵加压到萃取工艺要求的压力并传送到换热器，将CO2流体加温到萃取工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过程。负载溶质的CO2流体在分离器中改变温度压力，溶解度降低使萃取物得以分离。分离萃取物后的CO2流体再经换热器液化后回到储罐中循环使用。,超临界CO2提取操作流程,20世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青。 70、80年代SFE用于食品香料的提取。 90年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分。,大型超临界流体萃取装置,超临界流体萃取技术的应用,第二节 天然产物的分离,一、经典分离方法,1.溶剂法,6.分馏法,5.升华法,4.膜分离法,3.沉淀法,

18、2.结晶法,1.溶剂法包括,（1）系统溶剂分离法,（2）两项溶剂萃取法,（1）系统溶剂法,原理,依据“相似相溶”的原理，按极性由小到大的顺序依次提取分离总提液中各种溶解度有差异的成分。 石油醚、己烷挥发油、脂溶性色素、蜡 乙醚、氯仿生物碱、苷元 乙酸乙酯黄酮苷 正丁醇皂苷、蒽醌苷 甲醇、乙醇苷、糖类、生物碱盐,适用范围,优缺点,此法是早 年研究天然药物有效成分的一种最重要的方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化学成分的中药提取液。目前仍是最常用的方法，,此法操作繁琐，对化学性质不稳定，容易引起分解、异构化的天然产物应特别注意。在微量成分、结构性质相似成分的分离纯化上受到很大限制。,（2）两

19、项溶剂萃取法,原理,利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。 溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相。混合物中各成分在两相中分配系数相差越大，则分离效果越高。,萃取的方法,1）简单萃取法：实验室用分液漏斗，一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，根据情况，可用酸水或碱水。中药中成分比较复杂，,2）pH度萃取法：以pH成梯度 的酸（碱）水溶液依次萃取以 亲脂性有机溶剂溶解的碱（酸）性成梯度的混合生物碱(混合酚、 酸类)，,使后者分离的方法。,萃取分离不出来纯品。,一次,3）连续萃取法：采用连续萃取器萃取。,利用两溶液比重不同自然分 层和分散相液滴穿过连续相 溶剂时发

20、生传质。此法可克 服分液漏斗多次萃取的麻烦。,4）液滴逆流分配法（DCCC法）：,是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。,双水相萃取法,（一）、概述,早在1896年,学者发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系。 双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。,利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，瑞典的Albert

21、sson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。,双水相萃取法概述,（二）双水相系统及特点,1、什么是双水相系统？,聚合物的不相容（溶）性：,把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性聚合物溶液混合后静置，这些亲水性的高分子聚合物并不混为一相，而是分成两个液相，这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。,聚乙二醇 (PEG)溶液,葡聚糖 (Dx)溶液,利用双水相的成相现象及待分离组分在

22、两相间分配系数差异，进行组分分离或多水相提纯技术。,双水相体系：,分相的聚合物都是以水作为溶剂，称双水相体系,双水相萃取技术：,聚合物不相容性的原因：,聚合物分子的空间阻碍作用，相互之间无法渗透而分离成多相,聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)； 聚丙二醇/聚乙二醇； 甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖。 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机

23、盐。,常见双水相系统？,2、双水相萃取法的特点,能够保留产物的活性,整个操作可以连续化,与传统的沉淀法相比，要优越得多。,已被广泛地应用在蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化,-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。,影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。,萃取原理,双水相萃取技术的应用,双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞 生物学、生物化工和食品化工等领域，并取得了许 多成功的范例，主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊 髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰 素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗

24、体等。 此外双水相还可用于稀有金属贵金属分离， 传统的稀有金属贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂 污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等 缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是 金属分离的一种新技术。,双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。,双水相萃取的工艺流程,分离和提纯各种蛋白质(酶） 用聚乙二醇(PEG)/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从 - 淀粉酶发酵液中分离提取 - 淀粉酶和蛋白酶；萃取最适宜条件为PEG1000 ( 15 %) (NH4) 2SO4 (20 %) , pH = 8 ，- 淀粉酶收率为90 %

25、 ，分配系数为19. 6，蛋白酶的分离系数高达15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍，蛋白酶在水相中的收率高于60 %。,双水相的应用举例,提取抗生素和分离生物粒子 采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH= 8. 08. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %,双水相的应用举例,目前存在的问题： 虽然该技术在应用方面已经取得了很大 的进展，但几乎都是建立在实验的基础上， 到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释 双水相系统的形成机理以及生物分子在系统 中

26、的分配机理。,存在的问题,1、定义 反胶束或称逆胶束(Reversed micelle) 是指当有机溶剂中 加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会 自发地在有机溶剂中形成一种稳定的大小为纳米级的聚集体。 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有 机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性 核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了 “水池” 。,反胶团（胶束）萃取,反胶团（胶束）萃取,反胶团（胶束）萃取,静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减小大分子蛋白

27、进入胶核的传质阻力。 凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大的因素均有利于提高分配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面活性剂种类和浓度等，通过因素优化，实现选择性地萃取和反萃取。,2. 反胶束萃取的原理：,3.反胶束的溶解作用,微水池溶解和分离作用： 反胶团的微水池的水 可溶解氨基酸、肽和蛋白 质等生物分子，为生物分 子提供易于生存的亲水微 环境。 因此，反胶团萃 取可用于氨基酸、肽和 蛋白质等生物分子的分 离纯化，特别是蛋白质类 生物大分子。,在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的“水池” 中，避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故

28、能很好保持其生物活性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取和分离开辟了一条新的途径。 成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作 反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术。,反胶束法的优点,（1）溶液的pH pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质 （2）溶液的离子强度 影响微胶团的静电状态. 凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。 （3）表面活性剂的浓度和种类 （4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）,3、 影响反胶团萃取的因素,4.胶束萃取的操作,A 萃取的基本方法 B 反萃

29、取 .,C 分级萃取,AOT = 二-(2-已基)琥珀酸酯磺酸钠。,5、应用举例 纯化和分离蛋白质 如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11. 1 和6. 8），用二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取，并用缓冲液将混合液的pH 值调至9. 0 ，则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留在水相.,提取或分离物,溶液,结晶,2.结晶法,粗结晶,溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤,放置（冷藏）析晶，过滤,重复上述操作（重结晶）,3.沉淀法,酸性或碱性化合物通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出而实现分离。如生物碱加入有机酸可生成不溶于水的有机酸盐沉

30、淀，酸性化合物可加入钙盐、铅盐、钡盐等生成不溶性的沉淀。,水醇沉淀法,铅盐沉淀法,1）水提取醇沉淀法，于水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达60%以上，可使多糖、蛋白质沉淀。 2）醇提取水沉淀法，于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分。,利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离的方法。,酸碱沉淀法,专属试剂沉淀法,1）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。 2）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。,某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。,（四）透析法,利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子则不能通过半透膜的

31、性质进行分离的方法。,如分离纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等大分子时，用此法可除无机盐、单、双糖等小分子杂质 。,透析膜的膜孔有大有小，视具体情况而选择，常用透析膜：动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、玻璃纸膜等。,借助机械外力的作用，将油脂从榨料中挤压出来的过程。在压榨过程中，主要发生的是物理变化，如物料变形、油脂分离、摩擦发热、水分蒸发等。但由于温度、水分、微生物等的影响，同时也会产生某些生物化学方面的变化，如蛋白质变性、酶的钝化和破坏、某些物质的结合等。压榨时，榨料粒子在压力作用下内外表面相互挤紧，致使其液体部分和凝胶部分分别产生两个不同过程，即油脂从榨料空隙中被挤压出来及榨料粒子变形形成坚硬的

32、油饼。,（五）压榨法,石油醚(流动相),碳酸钙 (固定相),色 谱 带,最早的色谱实验,二、色谱分离法,柱色谱,薄层色谱,原理：利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到分离。,色谱定义：是一种物理化学分离分析技术，它利用混合物中各组分在固定相和流动相间的分配系数的差异，让各组分在两相间进行多次分配产生明显迁移速差而得以分离。又称之为色谱分离法、层析法,色谱的分类,薄层色谱法定义,分类,吸附薄层色谱,分配薄层色谱,在平面载板上均匀涂布适宜的固定相形成一薄层，将欲分离的试样于薄层板上点样，随着移动相溶剂的移动展开，混合物中各成分获得分离的方法。,常用的吸附剂硅胶,应用最

33、为广泛!,粒径：200-300目 种类：硅胶G硅胶+粘合剂煅石膏 硅胶GF254含有荧光物质 硅胶H 不含粘合剂煅石膏 硅胶HF254 含有荧光物质,常用的吸附剂其它,氧化铝：碱性、中性、酸性三种规格。,聚酰胺：“氢键吸附”，对羟基类成分有很好的分离效果。,附子中乌头碱的限量检查，就是采用碱性氧化铝制备的薄层板,薄层色谱法展开剂的选择,待测组分的Rf值宜控制在0.2-0.8之间 各组分斑点圆且集中 混合溶剂临用前新鲜配制,要根据被分离物质的溶解性、酸碱性、极性等性质，结合吸附剂的吸附性能，综合考虑，可选择单一溶剂或混合溶剂系统。 若分离某些酸性或碱性成分，可在所选溶剂中加入少量的酸或碱或将一小

34、杯挥发性酸或碱放置色谱缸内。,操作技术手工铺板,取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵中向一个方向研磨混合成均匀糊状（无气泡和结块），均匀涂布在薄层板上。,玻璃板,层析专用玻璃板，清洗干净,用量,1020CM，3g硅胶,黏合剂,0.20.5%CMC-NA溶液，0.3%,干燥,水平台面，室温下自然完全晾干,检查,表面光滑平整，均匀，无杂质,操 作 要 点,CMC-Na溶液的配制,浓度0.20.5%，一般用的浓度是0.3%。 浓度过稀，使用的时候薄层易掉粉 浓度过大，用硫酸显色加热易变黑 使用上清液,取蒸馏水1000ml，在加热并不断搅拌的条件下，缓慢加入羧甲基纤维素钠0.3g，至完全溶解。

35、静置冷却，临用前取上清液备用。,涂布后的薄层先在室温下阴干，至完全干透后，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同。 硅胶 105-110 3060min 氧化铝 105-110 30min,操作技术点样,定量微升毛细管,薄层点样毛细管,溶液沸点适中，对成分溶解度好（甲醇、乙醇、氯仿、醋酸乙酯等）。 斑点不宜过大,以小于3mm为宜，采用多次点加法。点样量应适中。毛细点样管或定量毛细点样管尽可能往薄层板中间点。,操作技术展开,预先用展开剂将密闭的色谱缸饱和片刻，然后将点样后的薄层板置缸内支架上，勿与展开剂接触，预饱和一定时间，使缸内饱和的展开剂气体达到

36、平衡。饱和后，将薄层板点有试样一端浸入展开剂约0.5cm深处（不能浸泡点样斑点），开始展开，随着展开剂的上升，试样中不同成分因迁移速度不同而得到分离。待展开剂上行迁移到规定高度即取出烘干,操作技术显色,观察方法：日光、荧光、显色 通常可先在日光下观察，标出色斑并确定其位置，然后在紫外光下观察和标记，必要时再选择显色剂显色观察 若薄层板为硬板，采用喷雾法将显色剂直接喷洒；软板可选用碘蒸气法、压板法,显色喷雾瓶,三用紫外灯,操作技术计算比移值,0.2-0.8,Rf值越大，化合物的极性？,纸色谱法定义与原理,分配色谱,定义：以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水（或根据实际分离的需要，经适当处理后滤纸上吸附

37、的溶液）为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数的差异而达到分离的一种分配色谱法。,纸色谱法实验所需器材,薄层点样毛细管,主要用于亲水性化合物的分离如氨基酸、苷类、糖类、有机酸,分类,吸附柱色谱,凝胶过滤色谱,分配柱色谱,离子交换柱色谱,上样量大，常用于制备分离，是分离天然化学成分最常用的方法。,吸附柱色谱法基本原理,吸附作用,化学吸附:碱性氧化铝与黄酮发生的吸附,半化学吸附:氢键吸附，过程可逆,物理吸附：相似者易于吸附,吸附色谱最主要的吸附力,利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各种成分得到相互分离的方法。,物理吸附,化学吸附,半化学吸

38、附,溶液分子与吸附剂表面分子的分子间作用力。 硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂的吸附色谱,如聚酰胺与黄酮类、蒽醌类等化合物之间的氢键吸附。介于物理吸附与化学吸附之间,如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，生物碱被酸性硅胶吸附等。,物理吸附基本规律相似者易吸附 固液吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂,极性吸附剂,非极性吸附剂,对非极性物质亲和能力强，溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低；反之，则提高。,a.对极性强的物质吸附能力强 b.溶剂极性减弱，则吸附剂对溶质的吸附能力增强；反之，则减弱。,c.溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，一旦加入极性较强的溶剂时，又可被置换洗脱下来。,常用于分离水溶性成分

39、如氨基酸、糖类及某些苷类！,聚酰胺柱色谱,洗脱剂,聚酰胺,常用的吸附剂聚酰胺,聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键结合而被吸附，根据吸附力的大小不同，使能形成氢键与不能形成氢键的化合物达到分离。,氢键吸附,聚酰胺吸附能力强弱的判断,溶剂的种类 水、有机溶剂、碱溶液,化合物分子结构 分子中能形成氢键的基团越多，吸附越强 成键基团位置不同，被吸附的强弱也不同 共轭双键越多，吸附越强 能形成分子内氢键者被吸附强度减弱,化合物结构对聚酰胺吸附作用的影响,形成氢键的数目,成键基团位置,双键的数目,分子内氢键,吸附柱色谱流动相,极性

40、吸附剂 溶剂极性越大，洗脱能力越强 非极性吸附剂 水、l0%乙醇、20%乙醇、 30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇 聚酰胺 水、乙醇（30%、50%、75%、95%）、丙酮、稀氨水液或稀氢氧化钠水液、甲酰胺或二甲基甲酰胺、尿素水溶液,吸附柱色谱被分离物质,在吸附剂与洗脱剂固定的情况下，各组分分离的情况直接与化合物的结构与性质有关。,硅胶和氧化铝（极性吸附剂），极性越大，被吸附就越强！,柱层析吸附剂一般是100-200目 试样与吸附剂用量比约为1:60 可分为湿法装柱和干法装柱,吸附柱色谱装柱,要求,柱中吸附剂充填均匀，柱体内不得出现气泡、疏密不匀或者裂缝！,湿法上样：洗脱剂溶解试样

41、制成高 浓度溶液 干法上样：试样层尽量窄且平整,吸附柱色谱上样,吸附柱色谱洗脱,参照薄层色谱确定色谱条件：Rf约为0.2 梯度洗脱 注意保持液面高度，勿使柱面洗脱液流干 化合物无色，等份收集+薄层鉴别,分配色谱法,分配色谱法,基本原理(分配系数不同),正 相 分 配 色 谱,反 相 分 配 色 谱,正相 色谱,极性物质吸附强,非极性物质吸附弱,后出,先出,反相 色谱,极性物质吸附弱,非极性物质吸附强,先出,后出,分配柱色谱法基本原理,支持剂：硅胶，溶剂系统：水饱和的正丁醇， 水为固定相，正丁醇为移动相。,反相硅胶：在硅胶表面键合长度不同的烷基 R，形成亲油表面而成。烷基长度为乙基、辛基、十八烷

42、基。 溶剂：H2O-MeOH、H2O-CH3CN,离子交换色谱法定义、 分类,是一种利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离的方法。,阳离子交换树脂：被分离物质带正电荷,阴离子交换树脂：被分离物质带负电荷,分类,氨基酸的离子交换分离原理,离子交换柱色谱操作技术,定义 以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合物分子中分子量大小不同的化合物得到分离的方法 分离原理 葡聚糖凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交链而成的多孔性网状结构。 凝胶吸水后形成凝胶粒子，凝胶粒子

43、构成网眼，小分子进入，大分子流下。如同按照分子大小过筛一样，故称为“筛层析”。,凝胶层析,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。,凝胶层析,表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂的配比及反应条件。,商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示，英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量为每克2.5ml。,交联度大网状结构越紧密

44、孔隙越小吸水膨胀越少。,大分子化合物阻力较小，流速较快 小分子化合物阻力较大，流速较慢,凝胶色谱原理示意图,此法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)。前者只适用于在水中应用，而后者不但可在水中用，也可在有机溶剂中用或在水与有机溶剂的混合溶剂中使用。 G型凝胶：水或含水醇上样、洗脱分离水溶性大分子化合物。 Sephadex LH-20凝胶（引入羟丙基）：可用有机溶剂极性大、极性小化合物均可分离。,凝胶层析,凝胶柱层析的动态过程,大孔吸附树脂层析法,大孔树脂的多孔网状结构，巨大的比表面积使其具有良好的吸附性能的白色的颗粒状物质。,吸

45、附原理,大孔吸附树脂通过物理吸附（范德华引力或氢键）和分子筛作用（多孔网状结构）而实现分离； 极性较大的化合物一般适用于中极性的树脂上分离。 极性较小的化合物一般适用于非极性的树脂上分离。,洗脱液的选择,洗脱剂选择基本要求依据“相似相溶”原理。可选用水、不同浓度的MeOH、EtOH、Me2CO。 非极性大孔树脂 洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。 中极性大孔树脂 用极性较大有机溶剂洗脱。,大孔树脂预处理与再生,预处理：MeOH 或Me2CO浸泡过夜，装柱后连续洗涤至流出液加等量水无浑浊。 再生：乙醇浸泡24小时，用乙醇洗涤，至醇液中加水不呈白色混浊止。用2% NaOH浸泡、洗涤，水洗至中性，再用5

46、% HCl浸泡、洗涤，然后水洗至中性。 另外，其存放时，应保持颗粒湿润，否则一旦颗粒干了则颗粒易碎，此时则大孔树脂不能使用了。,大孔吸附树脂柱的洗脱,洗 脱 柱,得3瓶洗脱液,20,30,95,硅胶柱,气相色谱法,气相色谱与液相色谱相似，只是以气体作流动相，它的分离机理是基于物质在流动气相和固定相（可为固体和液体）两相间分配的不同而达到分离的方法。,农药残留等的检测,载气系统,进样系统,色谱柱,检测系统,温控系统,高效液相色谱法,高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品的分离取决于其在流动相和固定相中的分配。 特点是使用高压输液泵进行洗脱，并配备有紫外等检测系统，使分离达到高速化和高效化

47、。,Thank you!,第三节 天然产物的结构鉴定,鉴定天然产物所需做的工作 1、元素分析 由哪些元素组成，各占多少。 2、物理常数 熔、沸点 3、比旋光度 4、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定法、MS等方法 5、结构测定法：红外光谱、核磁共振（13C谱 、1H谱和二维谱）,结构测定的一般程序,纯度鉴定,推测母体结构类型 功能基情况,分子量分子式的确定,波谱、化学方法 推测出结构式,人工合成进行确认,结构测定,一、化学方法,二、仪器方法,波长在200400nm分子吸收紫外线引起分子价键电子跃迁，由于价电子跃迁的能级固不同的而各异。,1、紫外光谱, 饱和键 * 跃迁，不出现吸收带。 共轭

48、双键 *和n *跃迁。,紫外主要用于是否含有共轭体系的鉴定，如苯在256nm出现B带。,OH 3600cm-1左右，因缔合，峰较宽； C=O 1700cm-1附近，随所连基团的供电子强弱而向上或向下移动。,2、红外光谱,测定分子中存在的官能团种类。,3、质谱 确定分子量 4、氢核磁共振谱 确定氢的个数及相互关系 5、旋光光谱 具有旋光性的天然产物，测定其构型和构象 6、元素分析 测定C、H、N、S元素含量。 7、 核磁共振谱 确定分子骨架。,酚 UV280nm，IR15001600、3300cm-1，溶于NaOH 黄酮 黄色或淡黄结晶，UV240285nm及300400nm各一峰，IR在15001700cm-1有吸收。 皂甙 1H谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号。 香豆素 UV240260nm，IR15001600cm-1，有芳环吸收； 320nm吡喃酮环结构， 1700cm-1附近有不饱和内酯吸收峰 ；1H谱主要为芳香质子信号。,三、中药指纹图谱质量控制,借助计算机、信息及先进的物理、化学技术，将中