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1、蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则一、概述（一）定义与目的 蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则是为蚕用消毒剂进行临床试验制定的。蚕用消毒剂临床消毒效果评价以家蚕为主要对象，其目的是为了评价一种蚕用消毒剂是否对家蚕病原微生物具有消毒（杀灭）作用，并确定临床应用的推荐用法与用量。广谱蚕用消毒剂必须对本指导原则中列出的所有菌、毒种进行消毒试验，专用消毒剂可选择1种或几种菌、毒种进行试验。（二）适用范围本指导原则适用于蚕室蚕具消毒剂、蚕用烟熏剂和桑叶叶面消毒剂对各种病原体的消毒效果评价。二、试验设计（一）试验用蚕1.品种：用一化性或二化性的现行普通四眠蚕品种，所用蚕种为杂交种。2.来源：有生产许可证单
2、位生产的合格蚕种。（二）试验材料1.受试药物及来源：受试药物应与拟上市的制剂完全一致，有完整的产品质量标准，有合乎规定格式的说明书。受试药物应来源于同一批号，由申报单位自行研制并在GMP验收合格的车间生产的样品，并提供中国兽医药品监察所或农业部认定的其他兽药检验机构出具的产品检验合格报告。2.标准培养基：下列标准培养基和稀释液用于试验菌、毒种的制备。营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、稀释液（胰蛋白胨生理盐水溶液）、沙堡液体培养基、沙堡琼脂培养基、有机干扰物（3%牛血清白蛋白）。上述培养基配方参见附录A。3.试验菌、毒种应采用大学或省级以上专业研究机构鉴定保藏的菌种。如果采用自然感染病例分离的菌株
3、，应详细记录其来源，并应经有资质的部门鉴定方可用于试验。试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备等见附录B。（三）残留消毒剂的去除和中和剂选择观察药物的杀菌（消毒）作用时，必须在药物与菌体接触一定时间后立即去除菌体周围的药物或消除药物的杀菌作用。去除残留消毒剂的方法可用化学中和法和离心沉淀法等。1.化学中和法是目前最常用的一种方法。做法是向标本回收液中加入适当量的中和剂，使消毒剂浓度得到稀释，并且消毒作用受到化学中和。中和剂选择试验方法见附录C。2.离心沉淀法将消毒处理后的标本用磷酸盐缓冲液反复离心洗涤3次，最后将沉淀物转种到合适培养基上进行培养。无论用何种方法，事先必须用实验证明该法可
4、中止消毒剂的作用且对实验菌、毒种无抑制作用，对培养基无不良影响。（四）试验分组进行蚕用消毒剂试验时应分以下各组。1.空白对照（不感染不处理）组。2.感染不处理组（阴性对照组）：根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按试验组同样的方法进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数或灭活率的初始浓度。3.试验组：根据本原则中所列试验菌、毒种，选定所有的试验菌种和不同消毒剂浓度以及作用时间进行试验；如试验目的是研制专用的蚕用消毒剂，根据本原则中所列试验菌、毒种，选定相应的试验菌、毒种和不同消毒剂浓度以及作用时间进行试验。4.药物对照组（阳性对照组）。每个组设3个重复，每个重复（单元）
5、用50条2龄起蚕。（五）试验方法蚕用消毒剂进行消毒试验时，常用的试验方法有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验等。进行蚕室蚕具消毒剂研制时，一般采用悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验；或追加载体喷雾定量杀灭试验；进行烟熏剂研制时，采用烟熏定量杀灭试验。1.细菌芽孢消毒试验 进行细菌芽孢消毒试验时，有下列4种方法可供选择，按测试目的选择1种方法进行试验。（1）悬液定量杀灭试验操作程序消毒液配制：首先按试验设计或产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200 mg/L，则
6、应配制250mg/L），置201 水浴备用。试验菌液配制：按照“附录B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备”规定的方法配制实验用菌悬液，浓度为1108cfu/ml5108cfu/ml。消毒处理：取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物，混匀，置 201 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。中和：待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。活菌计数：各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10min 后，分别吸取 1
7、.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液作两次活菌计数即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。对照：同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37 温箱中培养，培养 72h 观察最终结果。重复与计量：试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:杀灭对数值（KL）对照组平均活菌浓度的对数值（No）试验组活菌浓度对数值（Nx）计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平
8、均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值。（2）载体浸泡定量杀灭试验操作程序消毒处理：取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。将盛有消毒剂的平皿置 201 温箱内 5 min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。中和与活菌计数：待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5 min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1
9、.0 ml 直接接种平皿，每管作两次活菌计数，测定存活菌数。对照：另取无菌小平皿，按每片5.0ml 的量，吸取相应的稀释液注入平皿中，置 201 温箱内5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于稀释液中，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37 温箱中培养，培养 72h 观察最终结果。重复与计量：试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（3）载体喷雾定量杀灭试验操作程序选定消毒剂的浓度与作用时间：根据所
10、试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（试验设计中设定的浓度）和至少3 个不同作用时间进行试验。载体设置：试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。消毒处理：每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。中和与活菌计数：待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细
11、菌被洗脱进入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管作两次活菌计数。每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。对照：用稀释液代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37 温箱中培养，培养 72h 观察最终结果。重复与计量：试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（4）烟熏定量杀灭试验操作程序根据试
12、验设计或产品说明书的要求，选定试验菌种与消毒剂的浓度和作用时间进行试验。熏烟容器：烟熏定量杀灭试验在一个容积为1m3正方形的密闭箱子内进行，箱子的每个内壁都安装有宽约20cm的平台，分三层，供消毒时放置菌片用。如需要特定的温度条件，试验时箱子内的温度必须达到要求的温度。试验时，每种载体菌片各取 12片，分上、中、下三层放置，每片菌片放置在一清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内），每层4片菌片，分别放在不同的平台上。消毒处理：每批试验根据试验设计的要求进行，如该产品注明必须利用烟雾进行消毒，要做到消毒时无明火，且药剂发烟充分彻底。中和与活菌计数：待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，打开箱子，分别从每
13、层取载体菌片 1 片（共3片），一起放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管作两次活菌计数。对照：在相同的温度下将菌片放置在不作消毒处理的箱子内相同时间，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37 温箱中培养，培养 72h 观察最终结果。重复与计量：试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（
14、5）评价规定产品申报新蚕用消毒剂时，要求在产品说明书指定的浓度与3个作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应5.00。要求载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应3.00，可判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可容许在部分重复次数中，出现不合格结果。产品鉴定时，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均5.00，可判定为消毒合格。要求载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭
15、试验中，各次的杀灭对数值均3.00，可判定消毒合格。报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出。感染不处理组（阴性对照组）应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。（6）注意事项试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。悬液定量杀灭试验时，有机干扰物一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒
16、剂使用说明书中规定，产品只用于清洁物品或器械的消毒或只作清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。进行烟熏定量杀灭试验时要密切观察，防止明火产生，注意安全。2.真菌消毒试验（1）试验程序常用杀灭试验有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验、烟熏定量杀灭试验等。选择的试验菌种一般为白僵菌和黄曲霉，试验用培养基一般为沙堡琼脂培养基和沙堡液体培养基。其操作程序同“细菌芽孢消毒试验”。活菌培养计数时，对白僵菌，在25培养箱中培养24h72h 观察最终结果。对黄曲霉，在30培养箱中培养24h72h观察最终结果
17、。（2）评价规定和注意事项与“（五）1（5）细菌芽孢消毒试验”相同。3.病毒消毒试验常用杀灭试验方法有悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验等，按测试目的选择1种方法进行。（1）悬液定量杀灭试验操作程序消毒液配制：按试验设计要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200 mg/L，则应配制250mg/L），置201 水浴备用。病毒液配制：按照“附录B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备”中规定的方法配制实验用家蚕核型多角体病毒多角体或质型多角体病毒多角体悬液，浓度为1109
18、个/ml。消毒处理：取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用病毒多角体悬液，再加入0.5ml有机干扰物，混匀，置 201 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。中和：待试验病毒多角体与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验病毒与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。添食：各管试验病毒与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50ml混合液，每区（单元）50头2龄起蚕，每区（单元）喂饲涂抹混合液的圆叶6片，每种处理设3个重复。对照：同时用
19、稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527下饲养观察一定时间（一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及时调查确认），饲养过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按下式计算灭活率：重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（2）载体浸泡定量杀灭试验操作程序消毒处理：取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片
20、 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。将盛有消毒剂的平皿置 201 温箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。中和与添食：待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的病毒被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50ml混合液，每区（单元）50头2龄起蚕，每区（单元）喂饲涂抹混合液的圆叶6片，每种处理设3个重复。对照：另取无菌小
21、平皿，按每片5.0ml 的量，吸取相应的稀释液注入平皿中，置 201 温箱内5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于稀释液中，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527下饲养观察一定时间（一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及时调查确认），饲养过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按下式
22、计算灭活率：重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（3）载体喷雾定量杀灭试验操作程序选定消毒剂的浓度与作用时间：根据所试病毒和消毒剂对该病毒的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（试验设计中设定的浓度）和 至少3 个不同作用时间进行试验。载体设置：每种病毒所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。消毒处理：每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。中和与添食：待试验菌片与消毒剂相互作
23、用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50ml混合液，每区（单元）50头2龄起蚕，喂饲涂抹混合液的圆叶6片，重复3区（单元）。待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。消毒处理注意事项：每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。对照：用稀释液代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，进行平行试验，作为感染不处理组（
24、阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527下饲养观察一定时间（一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及时调查确认），饲养过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按下式计算灭活率：重复：试验重复 3 次，计算平均灭活率。（4）烟熏定量杀灭试验操作程序根据试验设计，选定试验病毒与消毒剂的浓度和作用时间进行试验。消毒容器与消毒处理：烟熏定量杀灭试验在一个容积为1m3正方形的密闭箱子内进行，箱子的每个内壁都安
25、装有宽约20cm的平台，分三层，供消毒时放置菌片用。如需要特定的温度条件，试验时箱子内的温度必须达到要求的温度。每种病毒所染菌片应分别在不同的箱子内进行试验。试验时，每种载体菌片各取 12片，分上、中、下三层放置，每片菌片放置在一清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内），每层4片菌片，分别放在不同的平台上。每批试验根据试验设计或产品说明书的要求进行，如该产品注明必须利用烟雾进行消毒，要做到消毒时无明火，且药剂发烟充分彻底。中和与添食：待试验菌片与消毒剂相互作用至各规定时间，打开箱子，分别从每层取载体菌片1片（共3片），一起放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌
26、上振敲 80 次，使菌片上病毒被洗脱进入中和液中。各管试验病毒与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50ml混合液，每区（单元）50头2龄起蚕，每区（单元）喂饲涂抹混合液的圆叶6片，每种处理设3个重复。对照：在相同的温度下将菌片放置在不作消毒处理的箱子内相同时间，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527下饲养观察一定时间（一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死
27、蚕应及时调查确认），饲养过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按下式计算灭活率：重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（5）评价规定病毒消毒试验，可用于评价消毒剂对家蚕病毒的灭活效果。感染不处理组（阴性对照组）的发病率95.0%。3次试验的平均灭活率99.0%，可判为对家蚕病毒消毒合格。（6）注意事项试验操作时尽量使用移液器与无菌一次性吸头。饲养观察过程中必须做好病蚕隔离消毒工作，防止二次感染。进行烟熏定量杀灭试验时要密切观察，防止明火产生，注意安全。4.微孢子虫消毒试验常用杀灭试
28、验方法有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验、烟熏定量杀灭试验等。根据测试目的选择其中1种方法进行试验，4种方法的操作程序同“3.病毒消毒试验”。使用2龄起蚕进行试验，消毒接种蚕体后饲养观察时间为9d，饥饿1d。评价规定和注意事项同“3.病毒消毒试验”。三、试验报告为公正、科学地评价药物消毒效果，对试验报告内容做如下要求：1.试验目的。2.试验家蚕应注明品种、龄期。3.试验时间与地点。4.试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。5. 对照药物需注明蚕药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量。受试药物需注明蚕药名称、生产厂家、规格、生产日期及生产批号等。6.试验数据，
29、应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。7. 用于消毒试验的病原微生物需注明其来源、名称、菌液制备方法、攻毒方法、剂量。8. 归纳总结药物的消毒效果，确定受试药物的用途、推荐剂量、给药次数和给药间隔等。9.试验单位（加盖公章）。附录A 消毒试验用试剂和培养基配方1.磷酸盐缓冲液 （PBS，0.03mol/L，pH7.2）无水磷酸氢二钠 2.83g磷酸二氢钾 1.36g蒸馏水加至 1000ml将各成分加入到 1000ml 蒸馏水中，待完全溶解后，调 pH 至 7.27.4，于 121 压力蒸气灭菌 20min备用。2.有机干扰物 牛血清白蛋白 30g 蒸馏水 1000ml溶解后用微
30、孔滤膜（孔径为0.45m）滤过除菌，冰葙保存备用。3.营养琼脂培养基蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化钠 5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000ml除琼脂外其他成份溶解于蒸馏水中，调 pH 至 7.27.4，加入琼脂，加热溶解，分装，于121 压力蒸汽灭菌 20min备用。4.营养肉汤培养基蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000ml将各成分溶解于蒸馏水中，调 pH 至 7.27.4，分装，于 121 压力蒸汽灭菌 20min备用。5.稀释液：胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）胰蛋白胨 1.0g氯化钠 8.5g先用900ml以上蒸馏水溶解，并调节pH值在7.00.2，最终用蒸馏水
31、加至1000ml，分装后，经121压力蒸汽灭菌后使用。6.沙堡琼脂培养基葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH 至5.60.2，于 115压力蒸汽灭菌 30min备用。7.沙堡液体培养基 葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH 至5.60.2，于 115压力蒸汽灭菌 30min备用。附录B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备试验菌、毒种有：苏芸金芽孢杆菌卒倒亚种（Bacillus thuringiensis subsp. sotto Ishiwata）芽孢、球孢
32、白僵菌Beauveria bassiana （Bals.） Vuill. 和黄曲霉（Aspergillus flavus Link）、家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV）多角体病毒和家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV）多角体病毒、家蚕微孢子虫（Nosema bombycis Naegeli）孢子。1.细菌芽孢悬液的制备、计数及保藏（1）细菌芽孢悬液的制备冻干保藏的细菌芽孢：制备芽孢悬液时，开封冻干保藏的安瓿后，悬浮于少许营养肉汤中，吸出
33、少量菌液接种营养肉汤，于37，培养24h；在营养琼脂平板上划线培养，37，培养24h，挑取典型菌落接种营养肉汤，37培养24h，吸取培养物接种罗氏瓶内琼脂表面，或中管琼脂斜面表面，37培养5d7d，于室温放置3d5d（亦可不放），取少许菌苔作芽孢染色，镜检。当每个视野内的芽孢数达9095%以上时，用无菌生理盐水洗下菌苔（用L形玻璃棒刮），无菌过滤菌液，注入有玻璃球的无菌瓶中，用手充分振荡， 3000r/min离心10min，如此反复3次，将菌液悬浮于无菌生理盐水中，制成适当浓度的菌液，于45水浴24h，再80水浴10min，放置4冰箱保存备用。 （2）活菌计数稀释：先将菌液用比浊法或分光光度计
34、测定法初步估测菌液含菌浓度，然后用培养基作10倍系列稀释。接种：吸取0.1ml菌液于合适的固体培养基平皿内。每个稀释度接种3个平皿，接23个稀释度。将平皿上菌液摇匀后，置37培养。计数：选每个平皿菌落数在30300个者计数（未稀释的原液不足30者亦应计数）。将计数结果换算成每毫升原液的菌落数，并计算该稀释度的平均菌数。平板间或稀释度间的误差率超过10%应重做。计数好的细菌芽孢悬液放置4冰箱保存，有效期为3个月。（3）细菌芽孢的保藏细菌芽孢可用冻干保藏法和定期移植保藏法等方法进行保藏。冻干保藏法可保藏细菌芽孢10年。用定期移植法保藏细菌芽孢时，在营养琼脂培养基上移植培养，移植次数不超过5次，移植
35、培养好后放置于4冰箱内保藏，每次保藏不超过6个月，移植次数超过5次时，必须在蚕体上进行接种复壮后才能继续使用。2.白僵菌分生孢子悬液的制备、计数及保藏（1）繁殖与培养物获取取定期移植保藏的菌种管，在无菌操作下打开，挑取少些分生孢子，接种于沙堡琼脂斜面上，于 25 培养 5d7d， 即得到白僵菌分生孢子新鲜培养物。取新鲜培养的菌种管一支，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，加入少量的橡皮颗粒（可用普通橡皮自制），用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使分生孢子悬浮均匀。（2）
36、剔除菌丝与其它杂物用滤过法除去菌丝。滤过后，显微镜下（400-640倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰氏染色与生化试验等法进行鉴定。（3）分生孢子液储存白僵菌分生孢子悬液在4 储存，当天使用，不得过夜。（4）分生孢子液配制使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时菌悬液的含菌量为1107 cfu/ml5107 cfu/ml。菌悬液的含菌量按活菌计数的要求进行。（5）制备染菌样片制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10l。染菌后，置室温
37、下自然阴干后再使用。（6）菌物回收回收菌数应达5105cfu/片5106cfu/片，也可依试验要求确定。（7）试验菌种保存用定期移植法保藏白僵菌菌种。在沙堡琼脂培养基上移植培养，移植次数不超过5次，移植培养好后放置于4冰箱内保藏，每次保藏不超过3个月，移植次数超过5次时，必须在蚕体上进行接种复壮后才能继续使用。3.黄曲霉分生孢子悬液的制备、计数及保藏（1）繁殖与培养物获取取定期移植保藏的菌种管，在无菌操作下打开，挑取少些分生孢子，接种于沙堡琼脂斜面上，于 30 培养 5d7d， 即得到黄曲霉分生孢子新鲜培养物。取新鲜培养的菌种管一支，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀释液加
38、入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，加入少量的橡皮颗粒，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使分生孢子悬浮均匀。（2）剔除菌丝与其它杂物要求同2.（2）白僵菌。（3）分生孢子液储存黄曲霉分生孢子悬液在4 储存，储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。（4）分生孢子液配制要求同2.（4）白僵菌。（5）制备染菌样片要求同2.（5）白僵菌。（6）菌物回收要求同2.（6）白僵菌。（7）试验菌种保存要求同2.（7）白僵菌。4.家蚕核型多角体病毒多角体的制备、计数及保藏（1）家蚕核型多角
39、体病毒多角体的制备将家蚕核型多角体病毒多角体用蒸馏水配成1106个/ml浓度的多角体悬液涂抹在桑叶上，给4龄起蚕添食8h左右，接种病毒后的蚕用清洁桑叶在2425的温度下饲养，饲养至5龄蚕充分发病时，用剪刀剪破病蚕的腹足和尾角，收集病蚕体液。收集的体液3000 r/min离心10min，离心后取沉淀物，将沉淀用生理盐水充分悬浮，300r/min离心3min，取上清，反复差速离心多次，直至基本无杂质为止。将纯净的多角体用无菌生理盐水悬浮，制成多角体悬液。（2）家蚕核型多角体病毒多角体的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌生理盐水调成1109个/ml的多角体悬液，置4冰箱内备用。（3）家蚕核
40、型多角体病毒多角体的保藏置4冰箱内保藏，有效使用期为6个月。5.家蚕质型多角体病毒多角体的制备、计数及保藏（1）家蚕质型多角体病毒多角体的制备将家蚕质型多角体病毒多角体用蒸馏水配成1106个/ml浓度的多角体悬液涂抹在桑叶上，给2龄起蚕添食8h左右，接种病毒后的蚕用清洁桑叶在2527的温度下饲养，饲养至龄蚕充分发病时，解剖病蚕，收集病蚕中肠。收集的病蚕中肠先研磨，用纱布过滤，去除大的中肠组织碎片，然后以300 r/min、3 min 与3000 r/min、10 min进行差速离心，离心后去除沉淀物中上、下层的杂质，反复离心多次，直至基本无杂质为止。将纯净的多角体用无菌生理盐水悬浮，制成多角体
41、悬液。（2）家蚕质型多角体病毒多角体的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌生理盐水调成1109个/ml的多角体悬液，置4冰箱内备用。（3）家蚕质型多角体病毒多角体的保藏置4冰箱内保藏，有效使用期为6个月。6.家蚕微孢子虫孢子的制备、计数和保藏（1）家蚕微孢子虫孢子的制备将家蚕微孢子虫孢子用生理盐水配成11041105个/ml浓度的孢子悬液涂抹在桑叶上，给2龄起蚕添食8h左右，接种孢子后的蚕用清洁桑叶在2527的温度下饲养，饲养至蚕充分发病时，解剖病蚕，收集已病变的丝腺和中肠组织，或收集病蛾。收集的病蚕组织或病蛾先充分研磨，用纱布或其它滤网、装置等过滤，去除组织碎片。然后以500 r/m
42、in、5 min 与3000 r/min、10 min进行差速离心，离心后去除沉淀物中上、下层的杂质，反复差速离心多次，直至基本无杂质为止。将纯净的孢子用无菌水悬浮，制成孢子悬液。（2）家蚕微孢子虫孢子的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌水调成1109个/ml的孢子悬液，置4冰箱内备用。（3）家蚕微孢子虫孢子的保藏置4冰箱内保藏，有效使用期为6个月。7.试验菌片的制备为了测定消毒剂或消毒方法对不同物品上微生物的杀灭作用，常用代表性的材料制备染菌样片，比较常用的有布片、铝片、玻璃片、纸片、竹片等。试验前应将材料制成0.51.0cm2或11cm2、1.51.5cm2的样片，用洗衣粉煮沸后
43、用自来水冲洗、晾干、经高压灭菌备用。常用的染菌方法有滴染、浸染和喷染三种。细菌和真菌的染菌量一般控制在每片51055106个，病毒多角体和微孢子虫孢子的染菌量根据各种试验要求确定。（1）滴染法将灭菌后的样片平放于无菌平皿内，每个样片加0.010.02ml菌液，涂匀。细菌芽孢菌片于37温箱烘干，在4下保藏、备用，有效期不超过6个月。病毒多角体、微孢子虫孢子和真菌分生孢子菌片当天制备，自然条件下阴干。（2）浸染法将灭菌样片平放于灭菌平皿内，加入菌液，以样片全部浸湿为度。30min后，用无菌镊子将菌片移至另一垫有灭菌滤纸的平皿内，细菌菌片于37温箱烘干、备用。病毒多角体、微孢子虫孢子和真菌分生孢子菌
44、片当天制备，自然条件下阴干。（3）喷雾染菌法一般仅用于细菌菌片的制备。用气溶胶喷雾器将预先制备好的菌液在密闭的染菌柜内喷雾数分钟。喷雾完毕后静止1min，待大粒子沉降后，将样片由柜下方的抽屉送入柜内，使细菌微粒均匀沉降在样片上（一般为15min）。附录C 中和剂选择试验方法1.中和剂选择试验原则该项试验所用试验指示菌应为消毒试验选用菌株中抗力最弱者。所用试剂、培养基及其它材料都应一致。应以消毒剂未用中和剂中和时的最低有效浓度作为试验浓度，所用试剂、培养基及其它材料都应一致。2.方法可通过设定下列的实验来确定所选的中和剂是否合适（见表1）。表1 中和剂选择试验组号0.5ml菌液加入下列溶液混 匀作 用10min取0.5ml混匀液加入下列溶液作用10min后，取原液或稀释液0.5ml接种平板（2个/样本）1消毒剂4.5mlPBS4.5ml原液，102消毒剂4.5ml中和剂4.5ml原液，103中和产物4.5mlPBS4.5ml100，10004PBS4.5mlPBS4.5ml100，10005中和剂4.5mlPBS4.5ml100，10006PBS