《实验肿瘤学基本概念教学课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验肿瘤学基本概念教学课件.ppt（48页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、实验肿瘤学基本概念,肿瘤发生发展的一般过程,正常细胞 癌细胞 原位癌 浸润癌 转移癌 休 眠 预防 诊断 治疗,肿瘤细胞的生物学特点,自我满足的生长信号 对生长抑制信号不敏感 逃避凋亡 无限增殖的潜能 血管生成 浸润和转移,实验肿瘤模型的要求,忠实地重现人类肿瘤的生物学特性,实验肿瘤学的研究方法,直接研究 建立细胞系 建立动物模型,细胞系的基本概念,组织培养和细胞培养：模拟体内环境在体外培养机体组织和细胞，使之生存和生长。 原代培养（primary culture）:从体内取出组织和细胞的第一次培养。 传代（passage）：细胞长满培养瓶后，细胞分成2-3瓶继续培养。 细胞系（cell li
2、ne）:原代培养细胞首次传代成功后的细胞，称细胞系。Finite cell line, continuous cell line, established cell line 细胞株(cell strain):通过选择或克隆，从亲代细胞系选出的带有特定标志的细胞群。 瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。 ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物收集中心, 美国菌种保存中心,培养细胞的生长方式,贴附生长型细胞：细胞附着于支持物表面生长。 上皮细胞型：来源于外胚层和内胚层的细胞，细胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。 成纤维细胞型：来源于中胚层的
3、细胞，细胞呈梭形，排列成漩状、放射状、栅栏状。 悬浮生长型：造血系统的细胞,培养细胞的生长特点,贴附生长：支持物可为玻璃、塑料、胶原、其他细胞等。 停泊或贴壁依赖性细胞（anchorage-dependent cell) 接触抑制(contact inhibition)：正常细胞相互接触后，细胞将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。 密度抑制(density inhibition)：正常细胞汇合成片后细胞分裂停止，在静止状态下细胞存活一段时间 汇合 confluent,培养条件,基本营养成分 RPMI1640 DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium)
4、谷氨酰胺 生长因子 小牛血清 胎牛血清 灭活补体 56 30min 环境 37 pH 7.2-7.4 渗透压 无污染无毒 细菌、支原体,体外培养的优点,优点：1.活细胞， 2.对象均匀，易控制实验条件，易于观察和纪录实验结果 3.易研究单个细胞的结构和功能，易于进行分子生物学水平研究， 4.实验周期短，成本低，细胞系可长期保存。,体外培养的缺点,1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样， G1 G0 终末分化 肿瘤细胞 M S 介质细胞 G2,2.转化（transformation）: 在体外培养过程中细胞的遗传性状发生变化。分为一般转化和恶性转化。 一般转化：指细胞获得不死性。 恶性转化：
5、指出现在软琼脂培养基中浸 润生长；在动物体内成瘤；血清依赖性降低；生长密度依赖性降低。 3. 体外实验结果不能外推到体内实验,细胞培养的应用,研究细胞与环境的相互作用 细胞间的相互作用 细胞内胞质活动 细胞质与细胞核之间的流动,建立细胞系的基本要求,细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。,建系方法,1.原代培养：无菌操作， 取肿瘤组织，切成小片，小于0.5毫米，进行培养， 或用胰酶、胶原酶消化成单细胞悬液，血清灭活酶，培养 2.传代：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1：2-3传代 3.去除杂细胞 4.冻存细胞 10%DMFO+90%胎牛血清， 4 30min, -20 2hrs
6、, -70 过夜, 液氮，长期保存。 登记，定期复苏细胞。 复苏：37 水浴，加培养基洗一次，培养 5.鉴定,鉴 定,细胞形态观察 癌细胞多角型，重叠生长， 核浆比例失调，多核巨细胞 染色体分析 数量和核型、核带，标记染色体 细胞生长曲线和细胞周期 集落形成率 动物接种 成瘤， 组织形态学与原发肿瘤相似 污染 无病毒、支原体污染、细胞间交叉污染 Hela cell: 1951年 Henrietta Lack 宫颈癌,实验动物基础知识,法 规,1988年 中华人民共和国实验动物管理条例 1989年 医学实验动物管理实施细则 1994年 关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格证制度得通知 （医学实
7、验动物合格证书，医学实验动物环境设施合格证书，医学实验动物全价营养饲料合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书） 1988年 广东省实验动物管理办法,基本概念,实验动物（laboratory animal）:指人工培育的、对其携带微生物实行控制、来源清楚、遗传背景清晰、可用于科学实验得动物。 实验用动物（animal for research）:能用于科学实验的动物，包括实验动物、野生动物、经济动物和观赏动物。 标准化实验动物：有明确的遗传背景、繁殖方法、饲养环境、饲料成分均达到标准的实验动物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。,实验动物的分类(遗传背景),近交系（纯系）：连续20代以上兄
8、妹交配或亲子交配 而获得的遗传上达到一致的动物群。如BLAB/c小鼠。 杂交群: 两个近交系动物间有计划进行交配获得的第一代动物。 封闭群：由同一血缘品系进行自由交配，在固定场所保存繁殖5年以上得动物群，如Wistar 大鼠、SD大鼠。 突变系：正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物，如裸鼠,按微生物控制分类,一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。 二级：清洁动物，不携带人畜共患疾病病原体和动物传染病病原体的动物。 三级：无特定病原体的动物（specific pathogen free,SPF）, 动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的实验动物。 四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的
9、实验动物。 一级动物只能用于教学和某些研究的预实验，卫生部以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物,免疫缺陷动物,裸小鼠（ nude mice）,1962年英国发现。鼠11号染色体裸基因nu是隐性突变基因。 裸基因纯合子（nu/nu）鼠的特征: 1. 全身无毛，裸体外表。 2. 胸腺上皮细胞不能增殖，T细胞发育受阻，T细胞免疫缺陷。 3.B 细胞形态正常，功能较差，免疫球蛋白以 Ig M 为主，少量Ig G ，类似于人原发细胞免疫缺陷。 随着鼠龄增加， T细胞增加，移植实验一般用4-8周鼠。 4. 裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，应饲养在SPF 环境。 5. 纯合型雌鼠不能生育，/nu/
10、+和/nu/nu交配可获 1/2 纯合子鼠。 常用BALB/c nu/nu, Swiss nu/nu, NC nu/nu 。,应 用,建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌机理： 1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。,裸大鼠(nude rat),1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。 1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵抗力低下。,严重联合免疫缺陷鼠 (severe combined immune d
11、eficiency mice, SCID),1982年美国发现于C.B-17/ICR品系。 Scid位于16号染色体，是隐性突变基因。 纯合子scid/scid T细胞和B细胞功能缺陷，血清中无免疫球蛋白，外周血淋巴细胞数量明显减少。NK 细胞功能正常。接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤，可获得高纯度的单克隆抗体。 SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。,动物肿瘤模型,自发肿瘤：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。,诱发肿瘤：用化学、物理、生物等因素在动物体内诱发的肿瘤。物理、生物因素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定，常用化学因子诱发肿瘤
12、。常用于肿瘤病因、化学预防的研究,诱发肿瘤模型的基本要求,简单易行、易重复 选择对特定致癌物敏感的动物种系： 多环方香烃-皮肤/小鼠； 甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠； 甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠 恰当的致癌物剂量： 动物存活率高，诱发周期短。 诱发的肿瘤类似于人类肿瘤,原位诱发：如：0.25二已基亚硝胺 0.251 ml 灌胃6月， 70发生肝癌 异位诱发：将与致癌物作用过的器官或组织移植于自体或同系、同基因正常动物皮下，诱发所需的肿瘤。如：甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子宫颈，将子宫颈切除，移植于同系成年小鼠皮下，3个月后诱发异位子宫颈癌,可移植性肿瘤 肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学
13、特性学相对稳定的肿瘤。,同种可移植性肿瘤 可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白血病 到1997年我国65株。 腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药物筛选。 异种可移植性瘤： 免疫力正常动物：免疫隔离区 如眼前房、脑内，或免疫抑制，如X线照射/可的松 免疫缺陷动物,移植部位,原位移植（orthotopic implantation） 异位移植(ectopic implantation) 皮下、肾包膜下、腹腔,可移植性肿瘤的参考标准,传15-20代以上 接种成活率100%，自发消消退率5% 生长速度稳定,宿主寿命稳定,宿主反应低下 瘤组织的
14、组织结构与原发瘤相似，保持原发瘤的特性和标志,肿瘤转移的基本过程,原发灶 血管生成/降解细胞外基质 癌细胞入血/淋巴管 癌细胞穿过管壁 细胞增殖/休眠 再次转移 机理：“种子与土壤”,侵袭模型,背侧品皮下移植侵袭模型 肌肉内移植侵袭模型 腹腔内移植侵袭模型 肾包膜下移植侵袭模型 睾丸包膜下移植侵袭模型 爪垫皮下移植侵袭模型 小鼠尾部移植侵袭模型 耳廓皮下移植侵袭模型 癌细胞侵袭视网膜内界膜侵袭模型,转移模型,自发转移模型(spontaneous metastasis)：肿瘤细胞穿过宿主自然屏障，侵入血道和淋巴道而发生的转移，常用同种移植瘤和人肿瘤原位移植瘤，后者反映人肿瘤细胞与宿主器官的相互作
15、用，可用于辅助治疗的研究 实验性转移模型(experimental metastasis)：人工方法将癌细胞移植于血道和淋巴道而发生的转移 SCID-Hu 鼠模型: 将人胚器官如肺、骨髓等移植于SCID 鼠皮下，建立癌细胞对靶器官的移植模型,血管生成研究模型,1.人肿瘤组织 肿瘤微血管密度iMVD 生长因子 2.移植瘤 3.血管内皮细胞系 4.Matrix Implant 5.CAM 血管生成有种属特异性,肿瘤休眠（tumor dormancy）,肿瘤细胞在机体内持续存在而又没有明显生长(2年)的状态,此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡。 微小转移灶（micro-metastasis）:
16、在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶 微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞,转基因动物肿瘤模型,理论基础：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果 2 基因功能在进化中是保守的,转基因动物,外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。 用途：生物医药 基因表达调控 单基因表达调控 多基因表达调控 基因敲除（knock out),转基因方法,DNA 逆转录病毒/DNA转染 胚胎干细胞 显微注射 受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 显微注射 逆转录病毒 DNA DNA,纤维注射与逆转录病毒转染的比较,转基因方式 显微注射 逆转录病毒转染 DNA导入 50kb,单细
17、胞受精卵 10-15kb,46细胞卵 培养液 M16 高营养液 移卵 输卵管 子宫 整合 随机整合，多拷贝 随机整合，嵌合体， 单拷贝 表达 受旁侧序列影响 受病毒LTR影响， 在一定范围内表达水平 易缺失 与拷贝数成正比 传代 可传代 整合至生殖细胞的可传代,显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序,供体母鼠 注射激素、交配 鼠受精卵 目的基因 显微注射 注射DNA的受精卵 假孕母鼠 娩出幼鼠 鉴定,C57BL/6肝癌模型,p53-/-+p53+/+HBV+ p53+/- HBV + + p53+/+ p53+/- HBV+ P53+/- HBV- p53+/+ HBV + P53+/+ HBV- AFB1 10mg/kg i.p,Group HBV p53 AFB1 SEX N HCC Ia + +/- + M 7 7/7 + +/- + F 8 5/8 IIa + +/+ + M 16 11/16 + +/+ + F 6 0/6 IIIa - +/- + M 7 2/7 - +/- + F 9 1/9 IVa - +/+ + M 10 1/10 - +/+ + F 7 0/7 Ib + +/- - M 8 1/8 IIb + +/+ - F 5 0/5,