动物细胞培养技术.ppt

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1、动物细胞与组织培养技术,第一节 概述 第二节 动物细胞、组织培养的基本方法 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定 第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化,一、动物细胞与组织培养的基本概念 二、动物细胞体外培养的特点 三、发展历史 四、动物细胞的体外培养一般条件 五、体外培养细胞生物学特性,第一节 概 述,一、基本概念 1动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture) ：用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 动物细胞工程的基础。,分类： 细胞培养 Cell Culture 组织培

2、养 Tissue Culture 器官培养 Organ Culture,2、原代培养(Primary Culture)：初代培养，直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。 3继代培养（ Secondary Culture ）：传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养. 4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。 5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法获得、由单细胞形成的单一类型的细胞群体。,有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的细胞系。

3、 无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细胞系，大多已异倍化，异倍体核型，或成为恶性细胞。 限定性细胞系：具有特定实验指标的细胞系。 限定性细胞株：具有特定实验指标的细胞株。,二、动物细胞体外培养特点 动物细胞生长缓慢，培养时间长。 更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题。 对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括pH值、温度、剪切力 对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。 原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。 总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。,形态多种多样：圆形、椭圆形、正方形

4、、柱形、扁平形、梭形、星形和多边形等,平滑肌细胞,神经元细胞,血红细胞,三、动物细胞培养的发展历史,1885年，Wilhelm Roux （德国）最先尝试离体培养鸡胚神经板，存活了数月。建立“组织培养”概念。 1907年，美国胚胎学家Ross Harrison 培养蛙胚神经细胞长出了轴突，存活了几周（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）；创立了体外观察和研究动物组织的方法。公认为动物组织培养的开山鼻祖。,法美学者Alexis Carrel 1912年 将外科无菌概念和无菌操作技术引入到组织培养中； 采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块； 采用更新培养基和分离组织的传代措施，使

5、鸡胚心肌细胞维持生存34年，传代3400次，证明离体的动物组织在培养条件下有可能无限地生长和繁殖。 1923年，他设计了卡氏培养瓶，首先鸡胚心肌组织取得成功以后，已使多种动物组织培养获得成功。,1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。 1925年，Maximow采用双盖片法。 1934年，Gey和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。 1940年，Earle首创单个细胞克隆培养的方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔组织细胞系。 1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。 1951年， Dul

6、becco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，极大地推动细胞培养的发展，利用该技术建立了很多细胞系。单层培养成了细胞培养普遍应用的技术。,1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究。 1951年， Earle发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。 1952年，Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系。 1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。 1962年，Okada又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细

7、胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。,培养器皿：从载玻片发展到培养瓶、培养皿、培养板。 培养液：从天然动物血浆、胚胎渗出液发展到人工合成培养基(或称限定培养基)；促细胞生长物质从胎汁改用动物血清、近几年发展起来的无血清培养系统。 培养技术：从实验室小规模培养发展到微载体、微囊、中空纤维式、悬浮式等大型生物反应器培养，促进了细胞培养技术的应用与发展。,四、动物细胞的体外培养一般条件,1. 无污染环境 2. 温度 3. pH 4. 气体 5. 营养 6. 培养基 7. 附着底物,1. 无污染环境,培养环境的无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞培养室：福尔马林高锰酸

8、钾或过氧乙酸蒸气熏蒸进行消毒； 培养器皿及用品：高压蒸气灭菌进行灭菌； 培养液：0.22 m微孔滤膜过滤除菌。,滤 器,2、温度,恒定适宜的温度。 培养细胞对低温的耐受力高于高温，温度不超过39时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离此范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。一般鱼类细胞最适温度不超过30，鸟类细胞要求温度为38.5； 低温使细胞代谢速率降低，20-25能缓慢生长繁殖。4下能维持相当长时间，无明显损害; 人体细胞在39-40 1小时，受到一定损伤，但仍可能恢复； 40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数可能恢复； 41-421小时，细胞受

9、到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。,3、pH：最适7.27.4,大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离该范围对细胞培养将产生有害的影响；每种细胞都有其最适pH值； 细胞耐酸性比耐碱性强，偏酸环境中更利于细胞生长； 有些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6； pH低于6或高于7.6时生长会受到影响，甚至死亡。 常用磷酸缓冲剂，适用于封闭式培养； Hanks平衡盐溶液中含有高浓度的NaHCO3，打开培养瓶时，CO2迅速逸出而导致培养液pH变碱，酚红指示剂变红； HEPES 对细胞无毒性，能防止pH迅速变动，其最

10、大优点是在进行活细胞观察时能维持较恒定的pH。,4、 气体,气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） O2 ：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 低于大气压的氧压适于细胞株生长； 高氧压（高达95%）适于器官培养，但对于胚胎组织及细胞株单层的生长会产生致死性的伤害,CO2 ：既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，主要作用在于维持培养基的pH值 在细胞代谢中， CO2是三羧酸循环的最终产物之一，被培养基中的阳离子所固定，或与丙酮酸结合生产草酸，这些反应均可促进三羧酸循环 培养系统中CO2张力的维持，能使细胞培养物存活期延长，提高细胞培养技

11、术 二氧化碳培养箱，定时补充CO2 ，维持一定的CO2张力,5、营 养,要求高，需要： 碳水化合物、氨基酸、脂类 无机盐、维生素、辅酶 核酸、激素、生长因子,碳水化合物 细胞培养的主要能量来源； 合成某些氨基酸的原料；经过乙酰辅酶A(CoA)可合成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸； 葡萄糖最重要、最常用，4.5g/L高糖或1.0g/L 低糖； 果糖、甘露糖、磷酸葡萄糖及半乳糖等单糖也可作为细胞培养的能源； 双糖或多糖先分解为单糖也可用于细胞培养。,氨基酸与蛋白质 绝大多数细胞培养物不能利用蛋白质，细胞本身所需要的蛋白质是由摄取的氨基酸合成的； 12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸

12、、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。 所有细胞都需要谷氨酰胺，能促进各种氨基酸进入细胞膜； 氨基酸可作为细胞培养的能量来源； 培养基中常加入蛋白质和多肽，能促进细胞迅速生长。,维生素 细胞的生长繁殖需要多种B族维生素，大多数是与合成和代谢活动密切相关的各种辅酶、辅基； 必需维生素：肌醇、硫胺素、核黄素、吡哆醇、泛酸、叶酸、烟碱酸、生物素、胆碱、对氨基苯甲酸； 常用限定培养基中已成为固定组成成分。,细胞培养的辅助因素 非必需氨基酸：虽然细胞能合成这些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸，适量加入能促进细胞的生长，特别是当细胞接种量很小时； 其它维生素及辅酶 ：维生素A

13、对于纤毛圆柱上皮细胞的分化很重要；如果用辅酶的形式代替B族维生素加入培养基中，细胞生长会更好，如辅酶A、腺嘌呤核黄素； 核酸：虽然细胞能利用简单的分子如甘氨酸、二氧化碳、甲酸钠等合成核酸，但它们会优先利用培养基中的核甘酸； 激素：促进细胞的生长与增殖，影响细胞的生长与分化。细胞组织培养技术也是研究激素作用的重要工具； 血清：可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，是维持细胞有丝分裂不可缺少的物质。,6. 培养基,天然培养基 动物体液、组织提取液：血浆、血清、组织提取液、鸡胚汁等； 优点：营养成分丰富，培养效果良好； 缺点：成分复杂，来源受限，个体差异。 合成培养基 平衡盐溶液； 限定培养基；

14、 无血清培养基。,血清 能提供细胞生存、生长和增生所必需的激素和生长调节因子，如胰岛素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等； 能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分，如各种氨基酸、维生素、无机物、多肽、脂类、核酸衍生物等都是细胞生长所需的基本营养物质； 含有许多结合蛋白：对激素、维生素、脂类等具有稳定和调节作用；同时结合有毒性的金属离子和热原质，起到解毒作用； 含有蛋白酶抑制因子：保护细胞免受环境中蛋白酶的损伤； 还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成份，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等； 种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清

15、，最常用的是胎牛血清与新生牛血清； 血清的使用浓度一般为520，常用浓度为10； 使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用。,水解乳蛋白和胶原 另外两种较好的天然培养基成分； 水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸； 胶原：从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,人工合成培养基 平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）：维持细胞短期成活的培养基 组成：无机盐、葡萄糖、水。 作用：保持组织细胞生理状况所要求的渗透压与pH，维持细胞短期成活；洗

16、涤、分散、分离培养的组织细胞；配制细胞消化液；用作某些合成培养基的基础液。 种类：弱磷酸缓冲系统有Earle、Hanks、Dulbecco、D-hanks等；强缓冲系统有Tris-buffered BSS、HEPES、TRICINE、甘油磷酸钠。 应用时根据实验目的选择合适的BSS,限定培养基(defined media) ：满足细胞长期生长的培养基 于平衡盐溶液中加入各种必需代谢物与辅助成分，所有成分与含量明确。现在已有品质均一的各种优良培养基的商品出售； Parker（NO.199）培养基：于Earle平衡盐溶液中，根据鸡胚细胞的营养要求添加组分研制而成的培养基。这种培养基组成成分达61种

17、物质，是当前应用最广泛的培养基之一。以此培养基为基础，已研制出多种其他型号的培养基；,Eagle培养基/基础培养基BEM： Eagle根据L及Hela细胞系的营养需要研制出适合哺乳动物细胞培养的培养液，其成分较简单； 最低必需培养基MEM：Eagle根据人源细胞的培养要求研制而成，其特点是成分简单，某些氨基酸与维生素的含量显著提高，已成为最广泛应用的培养基；,Ham培养基：Ham研制 适宜于中国仓鼠二倍体细胞克隆化的培养基F7，改进的F10和F12，其中F12培养液在细胞的无血清培养中发挥了重要作用； RPMI培养基： Moore研制，其中RPMI1640适合于小鼠白血病细胞的悬浮培养和单层培

18、养，也可用于其他细胞的培养，被认为是培养人癌细胞较适合的培养液。 不同的细胞系有各自的最适培养基，根据试验确定。,无血清培养基(serum-free media) 血清成分不够清楚，存在非限定性和批间差异，使实验无法在一个控制的条件下进行；可能引起污染；给以后细胞产物的纯化带来诸多不便；成本昂贵； 无血清培养基：基础培养基、生长因子和激素、基质； 常用的基础培养基：RPMI1640、DMEM、HamF12等，最常用1:1的HamF12和DMEM的混合培养基。配制用水的质量以及培养基新鲜程度至关重要，用Hepes校正溶液的pH值；,常用生长因子与激素：胰岛素、表皮生长因子、神经生长因子、生长激素

19、、黄体化激素、促甲状腺释放激素、前列腺素、维生素C、维生素A醇； 常用基质：纤粘素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原、多聚赖氨酸； 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要胰酶消化传代，酶抑制剂能终止酶的消化作用，保护细胞； 结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白和牛血清白蛋白。增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤； 微量元素：硒,从有到无：在含血清的培养液培养至生长旺盛以后，逐步降低，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清； 处于对数生长中期、 90% 活细胞率、 适应时以高接种率； 并非所有细胞都能在无血清培养基中生长，新的无血清培养基的探索、新的可控制的生长因子及其性质研究仍是一个重要的课题,7. 附

20、着底物,玻璃 一次性塑料 微载体 饲养细胞,原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同的细胞，对底物要求各异。 常用底物：,A. 玻璃,最常用的底物：具有透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点； 质地：中性玻璃； 适于各种细胞附着生长； 玻璃用强碱如NaOH处理后，性质能受一定影响，需用酸中和后才可用； 缺点：易破碎。,聚苯乙烯制品：适于正常细胞、无限细胞系和肿瘤细胞； 聚四氟乙烯制品：透气性好，可制成薄膜，剪成小块后能置入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，便于取出、染色和做电镜切片。,B. 一次性塑料,C. 微载体,由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺以及带有不同基团的葡萄糖交联而成的大分子制成的小

21、球体； 优点：增大了单位体积内细胞的附着面积，有利于细胞的大量繁殖。,D. 饲养细胞 (Feeder Cells),制备：成纤维细胞或其它细胞长成单层后，大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活并保持代谢活动。 用途：作为底物，其它细胞接种其上；饲养细胞的代谢产物利于其它细胞生长，从而被称为饲养细胞。 用于培养特殊难培养细胞。,（一）培养细胞的生长方式及类型,（二）培养细胞的生长特点,（三）培养细胞的生长与增殖过程,五、体外培养细胞生物学特性,贴壁依赖型细胞,非贴壁依赖型,成纤维细胞,上皮型细胞,游走型细胞,多形型细胞,（一）培养细胞的生长方式及类型,于悬浮状态下即可生长,贴附于支持物表面才

22、能生长的细胞,1、贴壁依赖型细胞 贴附-大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。 细胞在活体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内原有特征。 单层附壁培养：动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。,在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1）成纤维型细胞： 本型细胞的形态类似体内生长的成纤维细胞； 形态：长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，中

23、有卵圆形核. 生长特点：细胞一般并不紧靠相连；生长时呈放射状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。 来源：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌 由中胚层间充质组织起源的组织。如人胚肺细胞,人的成纤维细胞,小鼠的成纤维细胞,人骨髓间充质细胞（MSC）,大鼠血管平滑肌细胞,成纤维细胞型,（2）上皮型细胞 形态：扁平状，不规则。 细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。 生长特点: 易相连成片 相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群单独行动。 来源:内胚层和外胚层。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮

24、细胞等。 Hela细胞呈现为典型的上皮型细胞。,单层扁平上皮细胞,人口腔皮样癌细胞,人宫颈癌上皮细胞（Hela）,成骨肉瘤细胞(多角形),上皮细胞型,奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型),上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同； 用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源； 与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态有差异； 来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同。,（3）游走型细胞：,不常见，具有类似巨噬细胞样的特征； 在支持物上

25、散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则； 细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒； 较不稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态； 如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。,单核巨噬细胞（未刺激状态）,游走型细胞,单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足,（4）多形型细胞 形态不规则的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分； 胞突细长形类似丝状伪足； 胞体略呈多角形，但较规则； 如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。,神经细胞（DAB显色）,多形型细

26、胞,神经细胞,大鼠 海马神经细胞,2 非贴附型细胞 悬浮型细胞：细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长； 见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长； 形态特点：胞体始终为球形； 优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞； 缺点：不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长； 贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养。,细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标； 实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态（2种或更多

27、形态）； 影响细胞形态的因素很多：细胞来源、培养条件 如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。,影响细胞形态学特征的因素,血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。 如：Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞，但在过酸或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。,培养细胞形态不稳定 血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与

28、否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,(二）培养细胞的生长特点,贴附和伸展,接触抑制,密度抑制,1贴附和伸展 贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点； 贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特殊的促细胞附着物质（如基膜素、纤维连接素、型胶原、血清扩展因子等）能参加细胞的贴附过程； 培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，形成伪足，呈放射状伸展； 细胞贴附和伸展过程：,贴附过程,细胞贴附速度：与细胞的种类、培养基成分、温度、底物的理化性质等密切相关。 初代培养细胞贴附慢，可长达l024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附; 胚胎组织短(2天

29、可见细胞生长),成体长; 单个细胞贴壁快，细胞团和组织块贴壁慢; 可采取的措施：包被；减少接种时细胞悬液的量；培养液中成分及浓度（添加纤粘连蛋白等）；培养液的温度。,2接触抑制（Contact inhibition） 细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。 一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，它们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。,分散生长,正常细胞的接触抑制,肿瘤细胞的堆积生长,3、密度抑制（Density inhibition） 密度抑制：在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6c

30、m培养皿约106个细胞），其分裂增殖停止。细胞密度常与培养液中的血清浓度相关。 转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，其密度依赖性调节常常降低，可至较高的终末细胞密度。,（三） 体外培养细胞的生长与增殖过程 1、单个细胞的生长过程： 与体内细胞周期相似，经历G1、S、G2、M期。,细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h， 细胞的分裂周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）,体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段,原代培养期,传代期,衰退期,2、细胞系的生长过程：,（1）原代培养期 为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续1-4周； 特点：异质性，细胞独立生存

31、性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性； 检测药物的很好实验工具。,（2）传代期 当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，应迅速将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液； 特点:细胞生命期中持续时间最长，均一，通常可传代1050代；细胞增殖旺盛，维持二倍体核型； 结果：群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占优势，细胞类型趋于一致。,有限细胞系和永久细胞系 有限细胞系(finite cell line) ：细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自行停止生长。即使提供生长所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种寿命仅能维持

32、一段时间的细胞系，称为有限细胞系。 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。 转换期、危机期crisis：有限细胞系转换成永久细胞系的过度期。又称为体外转化(in vitro transformation)。,永久细胞系特征 生长速率增加，倍增时间缩短 黏附性减少，贴壁依赖性降低 细胞形态变化，如细胞变小 对血清的依赖性减小 细胞接种到体内后，生癌率上升。 细胞异倍体和非整倍体增加 具有较高的核质比,癌细胞特征 细胞生长与分裂失去控制，具有无限增殖能力，成为“永生”细胞 细胞间粘着性下降，具有侵润性和扩

33、散性 分化程度低：低于良性肿瘤细胞，失去许多原组织细胞的结构和功能 细胞间相互作用改变：识别改变；表达水解酶类；产生新的表面抗原 蛋白表达谱系或蛋白活性改变：胚胎细胞蛋白甲胎蛋白 AFP、端粒酶活性升高 mRNA转录谱系的改变，表型多变 染色体非整倍性,荧光原位杂交显示端粒,(3)衰退期：此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而发生衰退、死亡。 细胞通过所谓“危机期”(crisis)，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。,3、每代细胞的生长过程,细胞“一代”：从细胞接种到分离再培养时的一段时间，培养工作中的一种习惯说法。 等同于细胞倍增一代吗？某细胞系为第158

34、代细胞？ 即指该细胞系已传代158次； 不同于细胞世代或倍增一代：细胞一代中，细胞能倍增36次。,潜伏期,每代细胞的生长阶段：,指数生长期,停止期,1）潜伏期,过程：游离细胞贴附底物,进入潜伏期，有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相； 缩短潜伏期 细胞种类:传代细胞，连续细胞系，胚胎组织； 接种密度：高密度单细胞悬液； 培养条件：无菌 无毒 适宜。,2）指数生长期,细胞增殖旺盛，群体均一，活力最佳，理想的实验材料。持续3-5天； 理想培养条件下，细胞迅速生长繁殖，数量日渐增加，连成一片，铺满培养器皿底物，细胞生长区域逐渐减少甚至消失。接触抑制致细胞运动停止、密度抑制致细胞终止分裂。细胞不再繁殖

35、而进入平台期。 细胞群体倍增时间和细胞分裂指数-细胞生长旺盛标志； 细胞分裂指数：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。,3 ）平台期,生长停滞期 细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和密度达到饱和，细胞停止分裂增殖但尚有活力，数量持平； 特点：细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间； 及时分离培养、传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。,潜伏期,指数生长期,停滞期,第二节 动物

36、细胞、组织培养的方法,一、体外培养的一般过程 二、动物细胞培养的基本方法 三、动物细胞大规模培养技术,一、体外培养的一般过程,组织获得 组织消化 接种培养 传代、细胞冻存复苏等,过程,组织取材,组织细胞的分离,培养,机械法,消化法,（一）取材,1鼠胚组织,2鸡胚组织,羊膜腔接种：流感病毒的分离，病毒感染后收集羊水和尿囊液 绒毛尿囊膜接种： 牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离； 病毒滴定，通过产生的斑和痘的数目计算感染性病毒颗粒； 抗病毒血清滴定试验，抗体存在时斑痘形成受抑制 尿囊腔接种：流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养；收获尿囊液 卵黄囊接种：虫媒病毒、衣原体及立克次

37、体的分离和繁殖。,3取皮肤 人皮肤是常用培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：切取 1-2cm2皮肤，即满足培养要求。需要特定个体材料时，可自行取材。 取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用 75%酒精擦拭消毒 2-3 次（勿用碘酒）。 取材方法： 用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内 2 毫米左右， 向上挑起小皮丘， 用手术刀紧贴针尖下方， 切下直径 2-3毫米小片，深度以创面微见血迹为度； 用拇指和食指紧捏取皮部皮肤， 在绷起的皮肤表面， 用手术刀轻轻片取一小片表皮， 大小和深度同前。 这样取材难免带一些真皮组织， 必要时亦可用外科刮皮刀刮取， 操作需在手术室进行，

38、 可能稍出血； 如取皮厚度适宜， 术后包扎好伤口，恢复很快，不留显著瘢痕。刮皮刀取能上能下优点是表皮细胞多， 培养易成功。,4取体液 血液白细胞是常用的培养材料，多用静脉取血法。 显示染色体用微量血短期淋巴细胞培养法，常规静脉抽血、耳垂/指尖取血。无名指肚取血(血多，消毒和取血都方便，刺口恢复快不易感染)。从手指取 2-3 滴血即够一次培养，血用量多时需从静脉采取。 肝素等抗凝剂防止凝血；抗凝剂以最小量又不失抗凝效果为好。量过小无抗凝作用，量大时易导致溶血。肝素常用浓度为 20U/ml，抽血前先用500U肝素/ml（生理盐水配制）湿润针管后推出的方法亦可。吸出血后拔掉针头，立即把血注入无菌容器

39、中备用。,（二）组织的分离 1离心分离法 培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。低速 500-1000 rpm 5-10 分钟； 需用大量白细胞进行培养情况下，需采用特殊分离技术，如使用分层液。 淋巴细胞分层液（Lyphocyte Separation Medium）：根据细胞比重不同，将各类细胞相互分开。红细胞比重 1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为 1.070；分层液用于分离血中淋巴细胞。,（1）取抗凝血，按 1:1 加入无菌分层液（滤过除菌）后，800-1000 转离心； （2）无菌分离出白细胞（白细胞位于红细胞上层，呈微白色）； （3）BSS 漂洗 1-

40、2 次，可用于培养或其它实验。 注意：如用动物血（如小鼠） ，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为 1.080左右，需用相应比重的分层液。,2机械分散法,注射器针管压挤法 不锈钢纱网钝物压取法：较多用,【程序】 （1）清洗：取得组织后，先用 BSS 洗去表面血污，然后预切成 5-10mm3 的小块，置入不锈钢网筛中（1mm 孔径）； （2）压挤：把网筛放在大碟皿上方，一手持网筛柄，另手用无菌管末端径轻压挤组织，使之穿过纱网，然后用吸管吸取营养液把纱网上剩余组织吹洗掉； （3）反复：用吸管从碟皿中吸出较大组织块，置入 10m 筛中，进行再压挤，方法同（2）； （4）镜检：被滤过的悬液即可用于培

41、养；可先吸取少许悬液镜检，如组织块过大，可再用 20m 筛做进一步压挤，以分散成单个细胞或细胞团； （5）培养：计数细胞（方法后述）后，接种培养。,3消化分离法： 组织剪切成较小体积，用生化和化学手段进一步分散组织。 胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、EDTA 消化法 （1）胰蛋白酶消化法 适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织 传代细胞,（2）胶原酶（Collagenase）消化法 细菌中提取，对胶原有很强的消化作用 适于消化纤维性组织、上皮组织、癌组织 上皮细胞对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果甚好

42、。,（3）EDTA 消化法 非酶性消化物，用不含 Ca2+ 和 Mg2+的 BSS 配成0.02%的工作液。 EDTA的作用机制：一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要 Ca2+和 Mg2+才能维持组织完整性。 EDTA从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，促进细胞相互分离。,（三）、 原代培养与传代培养技术 1、原代培养分为两种： 1） 组织块培养法 2） 组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细胞等。 幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。,机械法分离胚胎,基本步骤：无菌取出目的组织,用利刀无菌切割成12m

43、m小块,以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清,移入培养瓶，加入适当培养基浸润,培养瓶翻转1800，置1530分，使其贴壁,培养瓶翻回，置于37培养,（1）组织块培养,取材分离和组织消化,无菌取出目的组织,用利刀无菌切割成细块,胰蛋白酶液消化,Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清,吸管吹打分散细胞,移入培养瓶薄层培养,(2)组织消化培养,加入30-50倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液,37消化30-60min，每5-10min摇动一次,相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用,原代培养与检查 接种、培养 常规检查 （检查细胞形态及活力、

44、检查营养液pH及污染）,2、传代培养技术 传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养。 第一次传代时间：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。,基本步骤：,吸出培养瓶内旧培养液,加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）,吸出消化液，加入培养液终止消化,吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数,重新接种于新的培养瓶内,1）贴壁生长细胞传代,培养,2）悬浮生长细胞传代,离心法传代,直接传代法,离心法传代：离心（1000转/分-800g）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。,直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去

45、除12-23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,（四）细胞的冻存复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 1、冻存意义 1）长期保存细胞； 2）防止细胞老化； 3）减少人力、经费，减少污染。,2、冻存和复苏的原则：慢冻快融,细胞冷到零度以下，产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，在细胞内形成冰晶； 细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少胞内冰晶形成是减少细胞损伤的关键； 缓慢冷冻，使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶重结晶。,3、保存细胞三要素：营养、保护剂和低温,低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入保护剂，能大大提

46、高冻存效果。 常用的低温保护剂是甘油或DMSO，渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 保护剂的浓度在515%之间，常用10%。,4、慢冻程序,标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中。 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,常用

47、细胞冻存方法,1 预先配制冻存液：20%血清培养基与DMSO- 9 :1； 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 3 分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期； 4、冻存,1)传统方法：冷存管置于410分钟 -2030分钟 -801618小时(或隔夜)液氮槽长期储存。-20不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，存活率稍微降低一些。 (2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟之速度由室温降至(-80以下)-120，再放在液氮长期储存。适用于悬浮型细

48、胞与hybridoma之保存。,5、细胞复苏方法,快速融化，保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害 。 程序： （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,back,二、动物细胞培养的基本方法 悬滴培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 培养瓶培养方法 培养板培养法 克隆培养法,1、悬滴培养法 又称植块悬滴培养法，1907年Harrison首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。 优点：1）容易换片； 2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。,2、旋转管培养法 Gey（1933年）、Lewis（1934年）建立； 特点：培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。包括旋转管、旋转鼓、支架等； 缺点：不易在显微镜下观察。,3、灌注小室培养法 1912年由Burrows首创； 在盖玻片悬滴法基础上发展而来，可用于连续动态观察细胞变化，研究各种因素影响作用及活细胞反应。,4、 培养瓶培养方法 培养瓶培养方法：指将培