微生物的遗传变异和育种.ppt

《微生物的遗传变异和育种.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物的遗传变异和育种.ppt（260页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第八章 微生物的遗传变异和育种,遗传与变异的概念,遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能， 变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10-510-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。,遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，而变异则推动了种的进化和发展。,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。,遗传物质改变，导致表型改变。这种改变稳定，具有可遗传性,（1）遗传型（genotype）,又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。,（2）表型（phenot

2、ype）,又称表现型，指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。,表型的实现是由生物体的遗传型和环境条件共同作用的结果。,饰变（modification）： 指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：Serratia marcescens 的红色素在25和37的变化。,特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。,其表型的差异只与环境有关,Production of a red pigmen

3、t (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,Serratia marcescens 的红色素在25和37的变化。,研究微生物遗传的意义,微生物的独特生物学特性： （1） 个体极其简单； （2） 营养体一般都是单倍体； （3） 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖； （4） 繁殖速度快； （5）

4、易于积累不同的中间代谢产物或终产物； （6） 菌落形态特征的可见性和多样性； （7） 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性； （8） 易于形成营养缺陷型； （9） 各种微生物一般都有相应的病毒； （10） 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,微生物是遗传学研究中的明星！ 模式生物（model organism）,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研

5、究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,遗传变异的物质基础,第一节,3个经典实验证明遗传的物质基础是核酸还是蛋白,（一）经典转化实验,（二）噬菌体感染实验,（三）植物病毒的重建实验,DNA作为遗传物质,RNA作为遗传物质,1928年，英国科学家Griffith进行了以下几组实验： （1）小白鼠体内实验,（一）经典转化实验（transformation）： 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，

6、有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,（2）细菌培养试验,热死S 型菌不生长 活R 型菌长出R型菌 热死S 型菌+活R 型菌长出大量R型菌 + 10-6S型菌,培养皿培养,培养皿培养,培养皿培养,（3）S 型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状,F. Griffith将这种现象称为转化（transformation)，并将引起转化的物质称为转化因子(transforming factor)。,（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分 （DNA，RNA,蛋白质，荚膜多糖等） （2）对各组

7、分进行转化试验,1944年，O. T. Avery等从热死的S型S. pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了更精密的转化实验。,只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型，且DNA纯度越高，转化效率越高。,结论： DNA是转化所必需的转化因子,（二）噬菌体感染实验,1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验噬菌体感染实验,大肠杆菌 大肠杆菌T2噬菌体,实验材料:,吸附,10 min后,用捣碎器 使空壳脱离,离心,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,用含32P-D

8、NA标记的噬菌体作感染实验,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,吸附,10 min后,用捣碎器 使空壳脱离,离心,上清液中含 75%放射性,沉淀中含 25%放射性,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,用含35S-蛋白质标记的噬菌体作感染实验,在DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。,（三）植物病毒的重建实验,有些动物病毒、植物病毒以及某些噬菌体只由RNA和蛋白质组成，为了证明核酸RNA是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus

9、, TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。,将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子，而TMV的蛋白质部分不能感染烟草。,植物病毒重建实验,实验证明，遗传信息的流向与RNA的传递是一致的,病斑的特性是典型的HRV病班。,病斑的特性是典型的HTV病班。,朊病毒的发现和思考,朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？ 朊病毒仅由蛋白质构成 朊病毒的遗传物质为蛋白质？,微生物的基因和基因组结构,第二节,基因研究历史,从遗传学史的角度看，基因概念大致分以下几个阶段：,泛基因

10、（或前基因）,基因（gene）是什么?,是实体，其物质基础是DNA（或RNA）； 是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段； 是遗传信息传递和性状分化发育的依据； 基因是可分的，根据功能不同，分为： 编码蛋白质的基因 结构基因（结构蛋白，酶） 调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白） 无翻译产物的基因 tRNA基因（简称 tDNA ） rRNA基因（简称rDNA ） 不转录的DNA区段 启动子（promotor） 操纵基因（operator）,基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传的功能单位。,现代基因阶段,基因的分类 将编码蛋白质的基因根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类。 具有转录

11、和翻译功能； 只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因； 不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因。,原核生物的基因结构,原核细胞基因结构示意图,真核生物的基因结构,真核细胞基因结构示意图,外显子和内含子,真核细胞基因结构的主要特点 编码区是间隔的、不连续的。 外显子 在编码区能够编码蛋白质的序列 内含子 在编码区不能够编码蛋白质的序列 真核细胞中，外显子和内含子数目不同,基因组（genome）： 一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。 微生物的基因组一般较小。,原核生物在一般情况下只有一条染色体，多为单倍体。 真核微生物有多条

12、染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。有时为双倍体。,原核生物（大肠杆菌）的基因组,紧密缠绕的环状双链DNA分子 遗传信息的连续性 功能相关的结构基因组成操纵子结构 结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝 基因组的重复序列少而短,古细菌（詹氏甲烷球菌）的基因组,古细菌的基因组结构类似于细菌，即在环形DNA分子上功能相关的基因组成操纵子结构，基本无内含子序列。 负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）类似于真核生物，其转录起始系统基本上与真核生物一样，而与细菌截然不同。此外，RNA聚合酶、启动子结构、翻译机制、核小体等也与真核生物接近。,真核生物（啤酒酵母）的基因组,基因组大 DNA与组蛋白构成

13、染色质的复杂结构 有间隔子或内含子序列 没有明显的操纵子结构 含有大量的重复序列（低度、中度和高度重复） 基因组大部分在细胞核内,第三节 质粒和转座子,质粒（plasmid）：,一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,转座子（transposable element）：,位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。,质粒和转座子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子。,一、原核生物的质粒,定义：是一类小型共价闭合环状核外DNA，能独立于染色体进行自主复制。可以通过交换掺入染色体成为附加体；可以从寄主细胞中消除。 近年

14、来也发现了线性双链DNA质粒和RNA质粒 大小：1-1000kb，含有数个到数十个甚至上百个基因。 构型：DNA的两条多核苷酸链彼此螺旋缠绕，每条链上两个核苷酸末端通过共价键连接，形成没有游离末端的闭合环状链，叫 共价、闭合、环状DNA(covalently closed circle DNA,cccDNA),通常呈现负超螺旋构型，如果两条多核苷酸链中只有一条保持完整的环状结构，另一条链出现有1至数个缺口时，称为开环DNA,OC型，若双链断裂形成线状分子，称为L型。 功能：进行细胞间接合并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生。,cccDNA

15、,ocDNA,l DNA,对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。,质粒的凝胶电泳检测,二、质粒的分子结构,1. 结构,通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10kb以内）,2. 质粒的特点:,在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；,致育因子（Fertility

16、factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） Col质粒（colicin plasmid， Col plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid）,根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分类:,三、质粒的主要类型,（一） F质粒（F plasmid）,又称F因子、致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor），其大小约100 kb，为cccDNA，这是最早（1946年）发现的一种在大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）中起主

17、要作用的质粒。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（具有性菌毛，相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,F+菌株能通过接合作用将因子转入F-菌株并使之成为F+菌株。,F因子能以游离状态存在于细胞中，也可以整合到宿主染色体上。,F因子整合到宿主染色体上再回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下来，而成为携带某一染色体基因的因子，因此将这些携带不同基因的因子统称为F因子。,（二）抗性因子（Resistance factor，R因子）,也称抗药性质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。

18、抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒一般由两个相连的DNA片段组成,含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因，相对分子质量约11107，具有转移功能；,抗性转移因子（resistance transfer factor，RTF）,抗性决定因子（r-determinant）,大小很不固定，相对分子质量从几百万至11108以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,又称Col因子（colicinogenic factor，col factor），因其首先发现于大肠杆菌中而得名，这类质粒编码的基因使宿主产生细菌素（ba

19、cteriocin），是一种细菌蛋白，只能杀死近缘且不含Col质粒的菌株，不具有很广的杀菌谱。,（三）Col质粒（colicin plasmid，col plasmid）,一般都位于质粒或转座子上， 细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：,大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），Col质粒名称来源于此。,此外还有绿脓杆菌素、巨杆菌素、枯草杆菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。,大肠杆菌素是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌的作用。 凡

20、带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。 有些G+细菌也产生细菌素，如用于食品保藏的Nisin ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。,(四) 毒性质粒（virulence plasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒；,苏云金芽孢杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒；,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子。

21、,有些微生物对人、动植物有致病性，其中有些致病性也是由质粒决定的，如根癌农杆菌中的致瘤性质粒 即诱癌质粒。长200kb，是一种大型质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。 当带有Ti质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，

22、以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,(五) 代谢质粒（metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,如降解质粒，编码一系列能降解复杂物质的酶，将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。尤其是对一些有毒化合物的降解，在环境保护方面具有重要的意义。,（六）隐秘质粒（cryptic plasmid）,在应用

23、上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）。,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。,它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。,2m质粒,大多数酵母菌含有一种长2m的质粒，属隐秘质粒。,- 长为2m的6kb的环状双链DNA分子； - 位于酵母细胞核内，50100拷贝； - 只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表型； - 质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和一个2.3kb小区域所间隔； - 两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成A型和B型。,2m质粒是酵母菌

24、中进行分子克隆和基因工程的重要载体，以它为基础构建的克隆和表达载体已得到广泛的应用。另一方面，该质粒也是研究真核基因调控和染色体复制的一个十分有用的模型。,严紧型质粒(stringent plasmid)： 质粒的复制与染色体的复制同步，在这类细胞中，一般只含12个质粒；低拷贝数 松弛型质粒(relaxed plasmid)： 质粒的复制与染色体的复制不同步，在这类细胞中，一般含1015个或更多质粒。高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid) （可以在许多

25、种细菌中复制）,质粒的其它分类：,质粒的不亲和性,细菌通常含有一种或多种稳定遗传的质粒，这些质粒可认为是彼此亲和的。 如果将一种类型的质粒导入某一合适的但已含有一种质粒的宿主细胞，经少数几代后，大多数细胞中只含有其中一种质粒，那么这两种质粒就是不亲和的，不能共存于同一细胞中。这种特性称为不亲和性。根据某些质粒在同一细菌中能否共存的情况，可将质粒分为许多不亲和群，能在同一细菌中共存的质粒属于不同的不亲和群，同一细菌中不能共存的质粒属于同一不亲和群。,质粒的消除,质粒消除是指细胞中由于质粒的复制受到抑制而细胞染色体的复制并未受到影响，从而在子代细胞中不含有质粒的现象。 质粒消除可自发发生，也可通过

26、人工处理提高消除率，某些理化因素如加热，UV,电离辐射，胸腺嘧啶饥饿，吖啶橙，丝裂霉素C，溴乙锭等处理可干扰质粒复制，消除质粒。消除的质粒不会自发回复，质粒消除后只影响质粒赋予宿主细胞的功能，而不影响宿主细胞的繁殖。,四、转座因子的主要类型和分子结构,插入（IS）序列 转座子(Tn) 特殊病毒（Mu噬菌体）,转座因子：是细胞中能改变自身位置的一段DNA序列。可以从染色体或质粒的一个位点转移到另一个位点，亦可在同一个细胞的两个复制子之间转移。DNA片段的这种转移位置的运动称为转座。,原核生物中的转座子类型,插入序列（IS，insertion sequence),分子量最小（仅0.71.4kb），

27、只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列。 已在染色体、F因子等质粒上发现IS序列。E . coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS，通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E . coli的核染色体组上，形成Hfr菌株。 因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS被切离时引起的突变可以回复，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。,转座子（Tn，transposon),转座子又称转位子或易位子分子量居中（一般为225kb）。除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因（对抗生素、某

28、些毒物）、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。从结构来看， Tn 有两种类型，即末端为反向或顺向重复的IS，或末端为反向重复的序列。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但并不完全是随机的，某些区域更易插入。,Mu噬菌体（即 mutator phage）,Mu噬菌体即 诱变噬菌体是E . coli的一种温和噬菌体。含有噬菌体生长繁殖和转座所必需的基因，其分子量最大（39kb），含有20多个基因，但并没有固定的整合位置。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。,五、转座的遗传效应,插入突变 产生染色体畸变（复制性转座子） 基因的扩增和重排 转座子的应用（随机诱变）,微生

29、物的基因重组,第四节,两个独立基因组内的基因，通过一定的途径转移到一起重新组合，形成新的稳定基因组的过程。 在基因重组时，不发生任何碱基对结构上的变化，而是整个基因的水平方向转移，导致受体细胞获得该基因，重组后生物体新的遗传性状的出现完全是基因重组的结果。,基因重组（gene recombination）：,基因重组可自然发生，也可在人为设计的条件下发生。 自然发生的基因转移、交换、重组是生物进化的动力，人为操作的基因重组可达到育种的目的。,原核生物的基因重组类型：,1）转化 2）接合 3）转导 4）原生质体融合,真核微生物的基因重组类型：,有性杂交,准性生殖,原生质体融合,遗传转化,受体菌（

30、recipient cell，receptor）直接吸收供体菌（donor cell）的游离DNA片段（染色体DNA或质粒DNA）而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化。,一、 转化（transformation）,通过转化方式而形成的杂种后代，称为转化子(transformant)。,有转化活性的供体菌游离DNA片段称为转化因子(transforming factor)。,转化的发生需要二方面必要的条件：,（1）受体菌的生理状态（感受态的建立）；,（2）转化因子的特性,（一）转化的条件,. 感受态（competence）,感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。能

31、发生转化的受体细胞必须处于感受态。,感受态细胞（competent cell）是具有摄取外源DNA能力的细胞。,细菌能否出现感受态由其遗传性决定，但受环境影响也较大，表现出很大的个体差异。,感受态因子：调节感受态的一类特异的分泌蛋白。存在于具有自然转化的能力的细菌中，在细菌生长的一定阶段产生。感受态因子与细胞表面受体结合诱导感受态特异蛋白的表达。,膜相关DNA结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）,细胞壁自溶素（autolysin）,几种核酸酶,自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，使其具有DNA结合活性并进一步完成转化过程。把感

32、受态因子加到不处在感受态的同种细菌培养物中，可以使细菌转变成感受态。,感受态特异蛋白,转化因子,转化因子的本质是离体的DNA片段，一般只有15 kb左右或更小的片段。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。有dsDNA、ssDNA和质粒DNA。,最易与细胞表面结合的是dsDNA，由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限，因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。,质粒DNA是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。,呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有线状单链DNA具有转化作用的报道。 转化的频率通常为0.11.0，最高为2

33、0。 能发生转化的最低DNA浓度可以低到1105 g/mL（即11011 g/mL）。化学方法无法测出这么低的浓度。,自然感受态： 是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；,人工感受态： 通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！） 培养环境中加入环腺苷酸或高浓度钙离子，或把培养在营养丰富培养基中的细菌转到营养贫乏的培养基中，均有诱导感受态出现的作用。,（1）自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，转化过程研究得较深入的就是这种G细菌。,（二）转化

34、过程,目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力。此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。,双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的 DNA结合位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合； 在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段； DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。 来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对交换，形成了一个杂合DNA区段（heterozygous region）。在这一过程中，有核

35、酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与； 受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因； 当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,转化过程,人工转化,用CaCl2， PEG等处理细胞，电穿孔等是常用的人工 转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组 手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；任何来源的DNA将其连接到质粒上都能进入 受体细胞,指用提纯的病

36、毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,病毒核酸 （DNA或RNA）,宿主细胞,直接感染,（三）转染（transfection）,现在把DNA转移至动物细胞的过程也叫转染,提纯的病毒DNA以转化的（而非毒粒感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,病毒或噬菌体并非遗传基因的供体； 中间不发生任何遗传因子的交换或整合； 最后不产生具有杂种性质的转化子；,与转化的区别：,二、接合（conjugation）,供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性

37、状的现象，称为接合。 通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子（conjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。,接合,两株多重营养缺陷株只有在混合培养后才能在基本培养基上以10-6-10-5频率长出原养型菌落，未混合的两亲本菌株均不能在基本培养基上生长，说明长出的原养型菌落是两菌株间发生了基因重组所致。,中间的玻璃滤板只允许培养基和大分子物质包括DNA通过而细菌不能通过，两臂盛有完全培养基分别培养前述两个营养缺陷型菌株，菌体生长到一定程度抽吸培

38、养液使二者在相同培养液中生长，但不能直接接触，多次实验没有筛选到原养型菌株，表明Lederberg等观察到的重组现象需要细胞直接接触。,1950年Davis进一步作了U形管实验,能进行接合的微生物种类：,主要在细菌和放线菌中存在。 在细菌中，G 细菌尤为普遍，如E. coli、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、固氮菌属和假单胞菌属等； 放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（Streptomyces coeilcolor ）。 在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。,在所有对

39、象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是E. coli 。,大肠杆菌的接合机制,接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。 F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,性菌毛,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株； b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hf

40、r菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛,F因子的四种细胞形式,1） F+F-杂交,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用； b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。 d）复制完成后

41、， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移的是F+的拷贝。,最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此这种类型的菌株在与F-菌株接合后，因子可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞，并发生比F+与F-菌株接合重组频率高几百倍以上的重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）HfrF-接合,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。

42、F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,接合中DNA转移过程有着稳定的速度和严格的顺序性。Hfr菌株染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入F-菌株的机会就越多，其性状在接合子中出现的时间就越早，反之亦然。,因子上决定性别的基因位于线性DNA的末端，能进入F-细胞的机会极少，故在Hfr菌株与F-细胞接合中，F-转变为F+的频率极低，而其他遗传性状的重组频率却很高。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,中断杂

43、交（interrupted mating）技术,利用HfrF-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以 分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为 单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。,3）FF-接合,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同： 供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组； b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转

44、导（F-mediated transduction）。,三、转导（transduction）,利用缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。,获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子（transductant）。,细菌转导的两种类型：,普遍性转导,局限性转导,流产普遍转导,完全普遍转导,低频转导,高频转导,(1) 普遍性转导的发现,1951年，J. Lederberg和N. Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用鼠伤

45、寒沙门氏菌的两个突变株LT22(trp-)（P22）和LT2(his-)进行实验。,用U型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,滤过性因子？,普遍性转导（generalized transduction）,通过完全缺陷型噬菌体为媒介，将供体菌基因组上任何小片段DNA携带到受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。,通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌,形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,转导噬菌体为什么

46、“错”将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,因为染色体上的pac与P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8。,普遍性转导的三种后果：,（1）完全普遍转导,（2）流产普遍转导,() 外源DNA被降解，转导失败。,普遍转导的三种后果：,形成稳定的转导子,流产转导,外源DNA被降解，转导失败,（1）完全普遍转导,供体DNA经转导噬菌体的媒介而进入受体菌中，外源DNA与受体细胞染色体上的同源

47、区段配对，通过双交换重组到受体染色体上，从而使受体菌成为一个遗传性状稳定的转导子，这种现象就称完全普遍转导。,受体菌,10-810-6,供体菌,误包,转导颗粒,转导子,双交换,同源配对,（2）流产普遍转导,简称流产转导（abortive transduction）。供体DNA经转导噬菌体的媒介而进入受体菌中后，既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、翻译和性状的表达，这种现象就称流产转导。,细胞分裂,不断稀释,供体DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有供体 DNA，而其他细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,2. 局限性转导（specialized transduction）

48、,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。 最初于1954年在E. coli K12中发现。,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶原菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因 （几率一般仅有10-6）,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 但没有正常噬菌体的溶源性和增殖

49、能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,低频转导（LFT）的定义: 诱导溶原性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（10-6）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导溶原性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过10-6 ，称为低频转导。,高频转导(HFT): 如果细菌染色体中整合有一个缺陷的噬菌体时，正常噬菌体也能整合到同一细菌染色体上，这种细菌称为双重溶源菌。 双重溶源菌中，正常噬菌体称为辅助噬菌体，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。 双重溶原菌在紫外辐射等因子的诱导下，原噬菌体容易被切割下来，产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。,局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一 起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包 装的全部是宿主菌的基因。,b）局限性