溶血性贫血的实验室检查.ppt

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1、溶血性贫血的实验室检查,辽宁中医药大学附属医院 高万里,溶血性贫血的概念 溶血性贫血的分类 主要溶血性贫血的病因分类及常见疾病 溶血性贫血的临床特点 溶血的实验室检查 溶血性贫血的常用实验室检查及意义 血管内和血管外溶血的鉴别,溶血的概念,溶血 ：病理状态下，红细胞的寿命缩短， 红细胞过多、过早被破坏，称之为溶血。 代偿性溶血：在溶血情况下，骨髓代偿性增生，生成红细胞的效率可以补偿过早、过多消亡的红细胞，而不出现贫血，称之为代偿性溶血。 溶血性贫血：红细胞的破坏过速、过多，超过代偿能力所发生的贫血，称之为溶血性贫血。,溶血性贫血的分类,根据溶血发生的急缓和持续时间的长短，分急性和慢性； 根据红

2、细胞的破坏场所的不同，分为血管内溶血和血管外溶血； 常见分类法是按先天性、获得性和发病机理分类。 1.先天性溶血性贫血 多为遗传性红细胞内在缺陷，包括膜、酶、 血红蛋白合成异常所致的溶血性贫血。 2.获得性溶血性贫血 多为红细胞外在因素异常，包括免疫因素、药 物因素、生物因素等所致的溶血性贫血。,主要溶血性贫血的病因分类及常见疾病,先天性溶血性贫血 获得性溶血性贫血,先天性溶血性贫血,膜缺陷：遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆 形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多症. 酶缺陷：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸激酶缺陷症、葡萄糖磷酸异构酶缺陷症、嘧啶-5-核苷酸酶缺陷症. 珠蛋白异常：（血红

3、蛋白分子病） 珠蛋白量的异常，如海洋性贫血等。珠蛋白质的异常，如镰刀形红细胞贫血、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E等。,获得性溶血性贫血,免疫因素：（存在有破坏红细胞的抗体） 自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、阵发性冷性血红蛋白尿、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免疫性溶血性贫血、溶血性输血反应 膜缺陷：阵发性睡眠性血红蛋白尿 感染因素：原虫、病毒、支原体及细菌感染等 化学因素：某些化学药物及毒素，如苯肼、砷化氢、蛇毒等 物理及机械因素：大面积烧伤、心脏瓣膜异常、人工瓣膜、血管病变、微血管溶血性贫血 其他：脾功能亢进,溶血性贫血的临床特点,急性溶血性贫血：1.起病急骤、2.寒战高热

4、、3.头痛恶心呕吐、4.面色苍白黄疸、5.严重者可出现周围循环衰竭或急性肾功能衰竭. 慢性溶血性贫血：1.起病缓慢病状轻微、2.贫血黄疸肝脾肿大三联症、3.可以并发胆石症和肝功能损害.,溶血的实验室检查,检查内容 反映红细胞破坏增生的检查 反映红细胞寿命缩短、易于破坏的检查 有关红细胞代偿性增生的检查,检 查 目 的,肯定溶血证据 确定主要溶血部位 寻找溶血原因,反映红细胞破坏增生的检查,间接胆红素增高 尿中尿胆原排泄增加 粪便中粪胆原排泄增加 血清结合珠蛋白降低 血浆游离血红蛋白明显增加 尿含铁血黄素阳性 血红蛋白尿 高铁血红蛋白血症,反映红细胞寿命缩短、易于破坏的检查,红细胞畸形、破坏红细

5、胞增多 单核-巨噬细胞吞噬红细胞现象 红细胞寿命缩短 红细胞脆性增加,有关红细胞代偿性增生的检查,网织红细胞增多 血中出现大量幼红细胞 血中大红细胞 骨髓中幼红细胞明显增生,溶血性贫血的常用实验室检查及意义,红细胞渗透脆性试验增高：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症 抗人球蛋白试验阳性: 1.自身免疫性溶血性贫血 2.药物免疫性溶血性贫血 3. 新生儿同种免疫溶血病 4.冷凝集素综合征,酸溶血试验阳性：PNH（作为肯定诊断） ROUS试验阳性：PNH（作为筛选检查） 蔗糖溶血试验：PNH（作为筛选检查） 热溶血试验：PNH（作为筛选检查） 高铁血红蛋白还原试验 ：还原率降低 葡萄糖-6

6、-磷酸脱氢酶缺陷症 血红蛋白电泳异常：常用于检查Hbc、HbBar等,HbA2增高：珠蛋白生成障碍性贫血 HbF增高：珠蛋白生成障碍性贫血 HbH包涵体检查阳性：珠蛋白生成障碍性贫血 异丙醇沉淀试验阳性：提示有不稳定血红蛋白存在 热变性试验 ：沉淀率增高 存在不稳定血红蛋白，大于10%有诊断意义 镰变性试验阳性：Hbs病 冷热溶血试验阳性：PCH病,血管内和血管外溶血的鉴别,血管内和血管外溶血的鉴别,溶血象检查的原理、试剂 及操作规程,（一 ）红细胞渗透脆性试验,实验原理 渗透脆性试验是检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐溶中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。

7、根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞表面积与容积的比值，反映其对低渗盐溶液的抵抗性。比值愈小，红细胞抵抗力愈小，渗透脆性增加。反之抵抗力增大。,试 剂 171mmol/LNaCl溶液（10g/L） 取经100烘干的分析纯氯化钠0.7g置100ml容量瓶中，加少量双蒸水溶液解后，再加双蒸水至刻度。 样品要求 静脉血4-5ml,操作程序 1. 静脉血4-5ml放入盛有玻璃珠的三角烧瓶内轻轻摇动（去掉纤维蛋白），直到血液不凝为止。将此血液放入离心管内离心10分钟左右，去掉血浆，再用0.9%的NaCl反复洗涤三次，再配成10%RBC悬液，分别于下列每管加一滴。表格如下：,2. 混匀、

8、经过两小时观察RBC始溶及全溶NaCl浓度 分析结果 静置室温2小时，从高浓度试管开始观察，上层溶液开始出现透明红色且管底有红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血。,参考值 正常溶血：初溶0.42-0.46%；全溶0.28-0.33 注：本试验需有正常对照。,临床意义 脆性增加 主要见于遗传性球形红细胞增多症，椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血。 脆性降低 主要见于珠蛋白生成障碍性贫血，血红蛋白C、D、E病，低色素性贫血，肝疾病等。,（二）抗人球蛋白试验（Coombs试验）,实验原理 抗人球蛋白试验（Coombs试验） 检测自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（I

9、gG）。分为检测红细胞表面有无不完全抗体的直接抗人球蛋白试验和检测血清中有无不完全抗体的间接抗人球蛋白试验。直接抗人球蛋白试验应用抗人球蛋白试剂（抗IgG和/或抗C3d）与红细胞表面的IgG分子结合，如红细胞表面存在自身抗体，出现凝集反应。间接试验应用Rh（D）阳性O型正常人红细胞与受检血清混合孵育，如血清中存在不完全抗体，红细胞致敏，再加入抗人球蛋白血清，可出现凝集。,试剂 抗人球蛋白试剂IgG 样品要求 机械抗凝的静脉血3ml，用0.9%NaCl洗涤数次，取RBC备用。,操作程序 1. 取10支小试管，每管加入0.85%生理盐水0.5ml，取1：5抗人球蛋白血清0.5ml，加入第一，充分混

10、匀，再从第一管取出混合液0.5ml注入第二管混匀，再取0.5ml注入第三管，依次下去直至第10管，取出0.5ml弃去，则每管的浓度为1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320 2. 将不同浓度的液体，分别滴一滴于玻璃板上（用一滴管由低浓度向高浓度加） 3. 将10%病人RBC分别滴加一滴于上述玻板液滴内，同时充分混匀，15分钟后观察结果。,结果分析 RBC凝集为阳性（需要正常对照） 参考值 正常人直接和间接抗人球蛋白试验均为阴性 临床意义 自身免疫性溶血性贫血，冷凝集素综合征，新生儿同种免疫性溶血，阵发性冷性血红蛋白尿，药物性免疫性溶血等直接抗人球蛋白试验阳性。,（三）酸溶

11、血（Hams）试验,实验原理 PNH患者体内存在对补体敏感的红细胞。Hams试验即红细胞在酸性（PH6.4-6.5）的正常血清中孵育，补体被激活，PNH红细胞破坏而产生溶血，而正常人RBC不被溶解，无溶血现象。,试剂 1. 1/6N HCL 2. 8.5g/L NaCl溶液 样品要求 1. 机械抗凝静脉血5ml，用0.9%NaCl洗涤 数次，取RBC备用（需同时用同型或O型正常人对照）。 2. 静脉血2ml分离出血清备用,操作程序 1. 取两支小试管分别注入患者血清0.25ml 2. 一管加入患者50%的RBC悬液0.0125ml，再加入1/6 N HCL0.025ml 3. 另一管加正常人同

12、型或者O型者50%的RBC悬液0.0125ml，加入1/6 N HCL0.025ml 4. 以上两管充分混匀，加棉塞于37温箱中一小时观察有无溶血现象（可离心后观察）,参考值 正常人 阴性 临床意义 本试验阳性主要见于PNH，确诊意义大。某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性,（四） 热溶血试验,实验原理 利用患者的红细胞在其自身的血清（含补体）中于37孵育后，由于葡萄糖分解产酸使血清酸化，从而导致溶血的发生。 样品要求 静脉血3ml（分成两管）,操作程序 取静脉血3ml，注入两支小试管中（各加入1.5ml），倾斜放置，一管置于室温，另一管放37温箱中，4h，6h，12h，24h，观察有无

13、溶血现象（可离心观察）。,参考值 阴性 临床意义 阳性见于PNH。遗传性球形红细胞增多症和自身免疫性溶血性贫血亦可阳性，但阳性率比PNH为低。本试验用于PNH筛选试验。,（五） 蔗糖溶血试验,实验原理 在离子状态蛋白质结构发生某些变化，RBC与血清免疫球蛋白之间发生抗原抗体反应，被补体包围，PNH患者RBC由于膜结构异常，在有补体情况下，容易破坏，发生溶血。,试剂 1. 蔗糖 2. 3.8%枸橼酸钠溶液 样本要求 枸橼酸钠抗凝静脉血2ml（ 3.8%枸橼酸钠与静脉血比为1：9）,操作程序 将一份枸橼酸钠全血加入9份新鲜配制的糖水中（即0.5g蔗糖+4.5ml蒸馏水+0.5ml抗凝血，或10%蔗

14、糖水5ml+0.5ml抗凝血），混合后，置37温箱中孵育30分钟，离心沉淀。 结果分析 如有溶血蔗糖液为红色，即为阳性。 参考值 正常为阴性,临床意义 PNH患者蔗糖溶血试验为阳性或溶血率增加，可作为PNH的筛选试验。自身免疫性溶血性贫血有的可为阳性，白血病、骨髓硬化时可出现假阳性。,（六）尿含铁血黄素试验 （Rous试验）,实验原理 当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白的聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内外可见直径1-3m的兰色颗粒。,试剂 1. 2%

15、 亚铁氰化钾水溶液：用时新鲜配制。 2. 3%盐酸 样品要求 新鲜晨尿10ml,操作程序 1. 取新鲜尿离心沉淀，去掉上清液。 2. 取等量的2%的低铁氰化钾和1/5 N HCL混合。 3. 将管（2）之酸性低铁氰化钾注入尿的沉渣试管中混合，在室温中静置10-20分钟，离心沉淀取沉渣镜检。,结果分析 如有兰色颗粒则为阳性。 参考值 正常人为阴性 临床意义 Rous试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排除出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNH，本试验结果即呈阳性，并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验可呈阴性反应。,（七）

16、红细胞形态观察（涂片、染色、镜检）,成熟红细胞的形态观察对诊断溶血性贫血具有重要意义，它可为本病的诊断提供重要的线索和根据；如遗传性球形红细胞增多症时可达20-30%以上，严重者可达100%；遗传性椭圆形红细胞高达50-90%；靶形红细胞主要见于地中海贫血和其他血红蛋白病。某些获得性贫血如自身免疫、感染、理化和机械因素所致的溶血性贫血，亦可因红细胞损害而出现红细胞形态改变，其中最主要的为出现球形红细胞和红细胞的碎裂现象。,（八）网织红细胞检验,概述 网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间，尚未完全成熟的红细胞，因网织红细胞胞质内残留有多少不等的核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质，用碱性染料（如煌

17、焦油蓝或新亚甲蓝）进行染色后呈绿色网状结构，故称为网织红细胞。 网织红细胞较成熟红细胞体积稍大，直径为8-9.5m，在瑞氏染色后的血涂中为嗜多色红细胞。 新鲜血液中的红细胞用核酸荧光染料染色后，在流式细胞仪或某些以流式细胞术为原理的血细胞分析仪上计数网织红细胞的百分比和每升血液中的绝对值。 在一些全自动血细胞分析仪上，还可直接测量网织红细胞的体积，体积分布宽度，血红蛋白含量等参数。,参考值 1. RC百分比：手工法 0.5-1.5% 仪量法 0.5-2.0% 2. RC绝对值：手工法 （24-84）109/L 仪量法 （29-75）109/L 3. RC成熟指数 ：10-34 4. RC血红蛋

18、白含量 ：30.4-35.8Pg（成人）,临床意义 网织红细胞计数是反映红细胞系统造血旺盛的可靠指标，临床常用相对百分比反映网织红细胞的数量变化，但易受红细胞比容的影响。网织红细胞绝对技术较相对百分比更为准确。网织红细胞成熟指数（RMI）能反映骨髓红系细胞造血活性，并可用于贫血的进一步分类。网织红细胞血红蛋白含量（CHr）可以更早期、灵敏的反映红细胞血红蛋白的合成，对缺铁性贫血的早期诊断、疗效观察及功能性缺铁的鉴别有重要意义。,1. 网织红细胞计数,（1）溶血性贫血时，骨髓红系因受到缺氧及大量红细胞破坏产物的刺激而增生，未完全成熟的红细胞提前释放到外周血，使网织红细胞增多，常在5%以上。急性溶

19、血性贫血时，网织红细胞可高达50%以上。 （2）急性失血时，网织红细胞可明显增多，其增高的幅度依赖于出血量的多少，一般在出血后的第2-3天达峰值，可达5-15%，出血停止后网织红细胞逐渐恢复正常，临床上可据此判断出血是否停止。,（3）缺铁性贫血及巨幼细胞贫血时，网织红细胞可正常、轻度升高或减低，当给予足够的铁剂或VB12及叶酸治疗，用药一周内网织红细胞开始上升，在24周后达高峰，一般增至5%以上，可达10-20%。随后网织红细胞数量逐渐下降，红细胞及血红蛋白则逐渐增高，这一现象称为网织红细胞反应，可以作为贫血治疗有效的判断指标。,（4）再生障碍性贫血时，网织红细胞减少，一般网织红细胞常低于0.

20、5%，部分慢性再障患者网织红细胞百分比可为1%左右，但其绝对值计数明显减低。临床将网织红细胞绝对值低于15109/L，作为急性再障的诊断指标。 （5）骨髓病性贫血如急性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤患者，骨髓中肿瘤细胞大量浸润，使红系细胞增生受到抑制，网织红细胞数量明显减少。,2. 网织红细胞成熟指数（RMI）,RMI增高时红系细胞造血应激反应的早期信号，此时网织红细胞数量可能仍处于参考范围内。 急性大出血后，58h即可见成熟网织红细胞增多，RMI增大，而网织红细胞数量常在2天后才会出现有意义的增高。 红细胞生成素（EPO）治疗后，红系造血应激反应随之而出现，RMI升高可作为骨髓移植后造血功能重建的一

21、项早期观察指标。,3.网织红细胞血红蛋白含量（CHr）,缺铁性贫血的早期诊断：缺铁性贫血时，CHr明显减低 。当体内贮存铁减低但尚未出现贫血，即处于潜在性缺铁期时，CHr先于血红蛋白和血清铁等减低。当CHr的临界值（cut-off)26pg时，对缺铁性贫血诊断的灵敏度可达100%、特异性为80%。若用足量铁剂治疗后，CHr上升早于其他红细胞参数。 EPO治疗检测：EPO治疗后，红细胞生成量增多，铁消耗加剧，若体内贮存铁不足，CHr降低，呈功能性缺铁状态。当及时补充铁剂后，功能性缺铁状态消失，CHr逐渐恢复正常。,（九） 高铁血红蛋白还原试验,实验原理 高铁血红蛋白还原试验是在血液中加入亚硝酸盐

22、，人类红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化成糖旁路使NADP（氧化型辅酶）变成NADPH（还原型辅酶），其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+）,通过比色可知道还原的多少。当G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白的还原率下降。,参考值 正常人高铁血红蛋白的还原率75% 临床意义 G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白的还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31-74%，严重缺乏（半合子或纯合子）30%。,（十）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧 光斑点试验和活性测定,原理 在G-6-PD和NADP +存在下，G-6-PD 能使NADP+还原

23、成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。 参考值及临床意义 正常人有很强荧光。G-6-PD缺乏者荧光很弱或无荧光。,（十一）丙酮酸激酶荧光斑点试 验和活性测定,实验原理 在二磷酸腺苷（ADP)存在的条件下丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸，在辅酶还原型(NADH)存在的情况下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，若标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD. 参考值 正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。酶活性（15.01.99）UgHb. 临床意义 荧光斑点不消失或时间延长说

24、明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25-60分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。,（十二） 血红蛋白电泳检测,原理 血红蛋白电泳使根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的PH缓冲液中，缓冲液的PH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；反之，Hb带的电荷向阴极泳动。经过一定电压和时间的电泳，不同的血红蛋白所带的电荷不同，相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。,参考值 1. PH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 正常血红蛋白电泳区带HbA95%,HbF

25、2%,HbA2为1.0-3.1%。PH 8.6TEB缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC、但HbF不易与HbA分开，HbH与Hb Barts不能分开和显示，应再选择其他缓冲液进行电泳分离。 2. PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 主要用于HbH和Hb Barts的检出。HbH等电点为5.6，在PH6.5TEB缓冲液中电泳时泳向阳极，Hb Barts则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极移动。,临床意义 1. 通过与正常人血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白的区带。如HbH、 HbE、Hb Barts、 HbS、HbD、 HbC等异常血红蛋白的异常。 2. HbA2增

26、多，见于珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也在HbA2区带位置出增加，但含量很大（在10%以上）HbA2轻度增加亦可见于肝病，肿瘤和某些血液病。,溶血性贫血实验室检查筛选试验,主要临床表现： 黄疸、贫血、肝脾肿大等。 血象检查：红细胞计数 红细胞形态 网织红细胞计数 尿液检查：尿胆原 血红蛋白尿 含铁血黄素尿 生化检查：总胆红素及间接胆红素测定 骨髓检查：红系增生情况 粒/红比值,抗人球蛋白试验： 阳性- 免疫性溶血性贫血 阴性- 非免疫性溶血性贫血 -遗传性溶血性贫血 （自幼发病家族史阳性）,免疫性溶血性贫血：,自身免疫性溶血性贫血： 1. 红细胞渗透脆性试验增高

27、或正常 2. 自溶试验阳性，不能为葡萄糖所纠正。 同种免疫性溶血性贫血: Rh血型、ABO血型鉴定（新生儿溶血病、误输异型血） 药物性免疫性溶血性贫血 （有青霉素、奎尼丁等药物史） 阵发性冷性血红蛋白尿 冷溶血试验阳性,非免疫性溶血性贫血：,有各种诱因 感染、药物、化学中毒、蛇毒、继发性脾肿大、肝硬化 等因素所致溶血性贫血 阵发性睡眠性血红蛋白尿 罗氏试验（Rous试验）阳性 酸溶血试验（Hams）试验阳性 热溶血试验及蔗糖溶血试验阳性 红细胞碎裂现象 微血管病性溶贫、溶血性尿毒综合征常为阳性,遗传性溶血性贫血 （自幼发病家族史阳性）,红细胞渗透脆性试验： 增高：提示红细胞膜的异常 正常：提示

28、红细胞酶的缺乏 降低： 提示血红蛋白病,红细胞渗透脆性试验,增高：提示红细胞膜的异常 1. 遗传性球形红细胞增多症 血片可见球形红细胞增多，自溶试验阳性 能为葡萄糖所纠正 2. 遗传性椭圆形红细胞增多症 血片见椭圆形红细胞增多,红细胞渗透脆性试验,正常：提示红细胞酶的缺乏 1. 丙酮酸激酶缺乏（PK） 自溶试验阳性，能为ATP所纠正 2. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏（G-6-PD） 高铁血红蛋白还原试验 阳性 变性珠蛋白小体（Heinz） 阳性,降低： 提示血红蛋白病 血红蛋白电泳阳性 地中海贫血 ”H”包涵体、异丙醇试验弱阳性 地中海贫血：重抗碱血红蛋白增高 轻血红蛋白A2增高 血红蛋白S病 镰变试验阳性 不稳定血红蛋白病 热变性试验及异丙醇试验阳性 其他 ：C、D、E血红蛋白病相应血红蛋白增高,谢谢！,