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1、RNA干扰技术RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过RNA调控基因表达的机制。最早的RNA干扰研究是从植物和线虫开始，2001年Tuchl等首次应用长度约为1923个碱基对的双链小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，证实这些细胞也普遍存在RNA干扰的机制，从而在世界范围内掀起了研究和应用RNA干扰技术的热潮。RNA干扰之所以能引
2、起生物医学界几乎所有研究领域的广泛性趣，是因为siRNA具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。与抑制基因表达的传统工具，如反义寡核苷酸和核酶等比较，siRNA沉默基因的效率高达数十到数千倍，是逆基因工具的革命性改进。此外与目标基因信使RNA相差一个碱基序列的siRNA的基因沉默效应大大受到削弱，从而保证了抑制目标基因的高度特异性。因此，siRNA的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘密的进程。siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义
3、与广阔应用前景，siRNA技术连续多年被美国Science杂志评选的“全球年度十大科学突破”。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。第1节 RNA干扰的研究历程虽然RNA干扰是一种古老的机制，但是第一篇报道这种现象的论文是在1990年发表的。1990年，Napoli和Van der Krol等在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S启动子，连入农杆菌的T-DNA质粒，在矮牵牛花中过度表达。
4、她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。1998年，Andrew J. Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制现象。他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是mRNA成功转录后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）。因此，Andrew J. Hamilton认为内源性基因共抑制现
5、象属于转录后的基因沉默现象。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA（antisense RNA）均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫（C. elegans）par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire和Mello课题组接手了此课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo的课题中，引发线虫par-1基因沉默的是小片段的双链RNA，而不是正义单链RNA或负义单链RNA。他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的unc-22基因，进一步阐述了双链RNA在基因沉默中的作用，并将这一现象命名为“RNA干扰”。他们的研究成果激起了
6、其他科学家研究RNA干扰现象的浓厚兴趣，由于他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的，具有普遍性的机制，Andrew Fire, Craig C. Mello两位科学家因此在2006年获得诺贝尔奖。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNA干扰在不同物种的表现形式。 RNA干扰实验a：植物叶片；b：秀丽新小杆线虫；c：小鼠卵母细胞；d：果蝇复眼。1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发
7、现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的siRNA引发RNAi。同年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinase，PKR)和2,5-寡聚腺苷酸合成酶(2,5-oligoadenylate synthetase，2,5-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、
8、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。第2节 RNA干扰原理 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA（图1）。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），
9、即siRNA。研究表明在生物体中siRNA具相似的结构特征：为长约2123bp的双链RNA，具5单磷酸和3羟基末端，互补双链的3端均有一个23nt的单链突出。负责将dsRNA转化为siRNA的Dicer核酸酶，属于RNase家族，具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ (PiwiArgonauteZwille)结构域，Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现，其催化结构域在dsRNA上反平行排列，形成四个活性位点，但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性，这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA，各种生物体内Dicer结构略有不同，致使siRNA长度存在微小差别
10、。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，导致特定基因沉默，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。在RISC中，起靶序列识别作用的是siRNA的反义链，Zamore等发现在RNAi过程中，首先产生的是RISC无活性前
11、体，分子量250kD，当加入ATP后可形成100kD的活性复合体。由无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激活，但RISC酶复合物激活不需要共价键断裂，而要求结合于其上的siRNA双链的解开。在ATP存在时，依赖于ATP的解旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换，mRNA取代正义链与反义链互补，然后由活化的RISC在互补区的中间，距离siRNA反义链3末端约12bp处切断靶mRNA序列。 图1 RNAi机制siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下
12、合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，经过若干次的合成-切割循环，RNAi的作用不断放大，最终将靶mRNA完全降解。 此外许多研究还显示RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散，在植物中，RNAi信号可以通过两种途径在细胞间传递：短距离的相邻细胞之间的传递，植物细胞之间有着非常丰富的连接胞间连丝，沉默信号(如siRNA分子)可以通过胞间连丝在细胞间传递；沉默信号还可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。而在动物中，RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与，Hunter等在线虫中鉴定出了一种与沉默信号传播相关的蛋白，它是由SID一1基
13、因编码的一种跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通过，SID-1蛋白同源物在果蝇中不存在，但有研究表明在哺乳动物中存在SID-1蛋白同源物。RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗
14、、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 一、线虫中的RNA干扰模型Tabara教授于1999年以秀丽新小杆线虫为模型（图2），揭示了RNA干扰的原理。线虫细胞上的跨膜蛋白SID-1引导细胞外的长链双链RNA进入细胞质，RNA立即与细胞质内的RDE-4，RDE-1蛋白形成复合体。然后DCR-1与DRH-1
15、蛋白与该复合体结合，DCR-1蛋白将长链RNA切断，得到RDE-1结合的siRNA复合物。RDE-1-si-RNA复合物在解旋酶的作用下解链，RDE-1蛋白脱去，RISC酶与正义链和反义链中的一条链结合，RISC-单链RNA复合物在引导下与靶mRNA结合。反义RNA与靶mRNA上同源的部分特异性结合，在RISC的作用下，靶mRNA链被切断，无法与核糖体结合，翻译成蛋白质，引起基因沉默。同时，以反义RNA为引物，以mRNA为模板，在RdRP的作用下，生成新的siRNA反义链。这就是siRNA的级联放大的机制。RNA干扰现象介导的mRNA降解特异性强，同时由于放大机制的存在微量siRNA就能引起明
16、显的RNA干扰现象。线虫中的RNA干扰机制比较典型，但是在高等生物中，RNA的机制又有细微差别。图2 线虫中RNAi模型二、高等植物细胞中的RNA干扰机制植物细胞中在细胞核内产生的内源性miRNA（微小干扰RNA）参与了植物的基因表达的调控。植物miRNA多数长21个碱基，具有保守性，它的产生，是由miRNA前体长链dsRNA经Dicer酶家族（与DCR-1类似，常被称为DCL1、DCL2等）切割产生。以下机制为高等植物所特有： 1、干扰机制依赖于Ago蛋白家族，该家族有10个成员，它们在siRNA积累，DNA甲基化作用中起着关键作用，在整个RNA干扰的转录后基因沉默（PTGS）机制中起调节作
17、用。2、Dicer酶家族在高等植物中有特异性，共4个成员，称之为DCL1DCL4它们与miRNA的成熟有关。同时，miRNA的成熟需要植物细胞特有的HYL1这种双链RNA结合蛋白的参与。3、植物中特有的RDRs（RNA依赖的RNA多聚酶），它的作用机制与昆虫，哺乳动物有明显差异。三、哺乳动物的RNA干扰机制哺乳动物的RNA干扰机制与高等植物稍有不同，主要表现在以下几方面：1、动物miRNA的长度多为2224个碱基，比植物的长。2、动物miRNA的前体比植物miRNA的前体短得多，后者的长度是前者的三倍。3、动物miRNA由Drosha（与Dicer酶类似）、RNase在细胞核、细胞质中分两步完
18、成，而该步骤在植物细胞的细胞核中完成。4、动物miRNA在切断mRNA时，通常喜欢在3非翻译区域结合。 5、哺乳动物如人类，小鼠等具有较发达的免疫系统，外源性大片段dsRNA会引起干扰素样反应，蛋白酶R（PKR）被激活，有时还能激活寡聚腺苷合成酶（OAS）通路，使得细胞内蛋白质翻译停止，细胞死亡，该现象不出现在植物细胞中。第三节 RNA干扰的生物学功能及其特点一、RNA干扰的生物学功能 多年来DNA和蛋白质一直是基因组研究中的主角，而RNA只是被看做来往于DNA和蛋白之间的信使而已。然而越来越多的实验表明了RNA的重要作用。在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子micro RN
19、A(miRNA)。这种内源性的小分子RNA针对3端非编码区有着极高的保守性，并在组织中广泛表达，可在转录后以及翻译水平上调控基因表达。有人推测siRNA实际上不过是外源或病毒的dsRNA闯入内源RNAi通路的结果而已。寻找这类调节分子及其靶基因已成为研究的热点。2005年White head和MIT的研究人员发现miRNA调节着成千上万个人类基因，这些基因所占的比例超过基因组蛋白编码区域的三分之一。这首次证明了miRNA影响着很多的生命功能。在解开miRNA如何影响生物体发育这一未解之谜的道路上，Gaul等人证明了miRNA调节着许多发育中基本的过程，包括身体形态、神经系统和肌肉的发育，尤其是
20、对细胞存活意义重大。另一方面，David Bartel等人发现在植物中存在的miRNA也控制着发育过程中的基因表达。1、 通过组蛋白甲基化影响染色质结构 Volpe等利用裂殖酵母(Spombe)，发现整合入着丝粒区的转基因表达总被抑制，他们称此现象为“着丝粒沉默 (centromeric silencing)”， 随后发现着丝粒沉默是由于此区域核小体组蛋白H3的Lys-9甲基化后引起染色质凝集所致，并证明与RNAi相关的基因突变可使组蛋白H3甲基化消失，同时使着丝粒沉默现象消除。由此可知，至少在裂殖酵母中，RNAi机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。与此同时Bartel
21、等从裂殖酵母中分离出了一种与着丝粒区序列同源的小RNA分子，将其命名为异染色质siRNA，并推测“着丝粒沉默”是由siRNA造成的序列同源区组蛋白甲基化所致，即在着丝粒区域，DNA一条链连续表达，而另一条链间断表达，两条链的转录本互补形成dsRNA，然后通过RNAi机制形成siRNA，siRNA引导甲基转移酶到序列同源的着丝粒区，使组蛋白甲基化，最终导致染色质结构改变，从而调节基因活性。2005年Nature的一篇综述“Gene regulation: expression and silencing coupled”中提到，RNAi不仅可以通过促使mRNA分解来进行转录后调控，而且也在另外一
22、个基因调控的过程染色质的修饰中扮演了重要的角色，这一过程主要是通过控制组蛋白甲基化等修饰来实现的。这说明了RNAi的一部分作用机理：由于只有在DNA未折叠的情况下基因才会表现，因此miRNA凭借甲基化等修饰组蛋白而影响局部DNA的折叠，从调控大区域的基因表现，在发育及分化的过程中起非常重要的作用。miRNA所诱发的染色质修饰需要RNA polymerase的参与，说明了这种凭借甲基化染色质来抑制基因表达的过程，可能也是需要先转录成RNA，然后制造siRNA已进行染色质的修饰，抑制基因的表达。2、通过DNA甲基化在转录水平调节基因表达对RNAi相关基因突变体的研究表明RNAi机制参与细胞编码基因
23、正常转录的调控，生物体内三种基因沉默机制DNA甲基化、协同抑制和转座子沉默均与RNAi有关。Wessenegger等1994年在植物中发现染色体DNA甲基化依赖于RNA复制，即依赖于dsRNA的存在。随后Wessenegger与Pelissier又证实病毒在细胞内复制所形成的dsRNA可使宿主染色体上长约3Obp的同源序列甲基化，并发现只要存在序列同源性，dsRNA 即可使基因发生甲基化。DNA甲基化后，基因就会失去转录活性，不再起始转录，导致特定基因沉默。而且这种甲基化状态可以传给子代，使该基因在子代中表达仍然受到抑制。协同抑制现象指转入的基因可导致细胞内同源基因沉默，Pal Bhadra等
24、证实在果蝇中协同抑制是由于Polycomb复合体结合到内源基因上所致，Polycomb由siRNA引导并结合到同源序列附近，使染色质处于非活性状态，抑制其起始转录。另外Sijan等发现在矮牵牛(Petunia)中若转入基因产生的dsRNA与靶基因的启动子同源则会导致转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)，若与编码区同源则会导致转录后基因沉默，而且还发现TGS和PTGS过程中都有小分子RNA产生，并且两个过程均伴随靶序列的DNA甲基化，最终都可导致基因沉默。3、在翻译水平调节机体发育对动植物中RNAi相关基因突变体的研究表明，RNAi机制与生物发
25、育过程相关，其作用机理是RNAi机制的某些组分通过与PTGS彼此分离但又密切相关的过程参与对发育过程的调控。Ketting等发现单个Dicer基因DCR-1发生突变的线虫，除了RNAi机制缺失外，还产生了一系列表型改变。并且DCR-1突变体表现出的发育时序的改变与let-7和lin-4突变体相似，而let-7和lin-4编码小分子RNA，在体内首先合成70nt长的RNA前体，然后在Dicer作用下生成22nt的小分子RNA，称为小分子瞬时RNA (small temporal RNA，stRNA)，这些小RNA在线虫的发育过程中参与对rnRNA翻译的调节，是特定基因的负调控因子，但并不介导mR
26、NA的降解，而是结合于mRNA3非翻译区，阻止核糖体与mRNA有效结合，从而抑制翻译的进行。stRNA和siRNA关系密切，除了都由Dicer加工成熟之外，RNAi必需的Argonaute(ALG-1，ALG-2)家族基因也为两种RNA行使生物功能所必需。有人认为在RNAi过程中形成的RISC复合物既含有siRNA 又含有stRNA，此复合物可根据不同情况产生不同效应，它可利用siRNA与靶mRNA互补介导mRNA降解，但若siRNA与靶序列不能严格配对(如有单个碱基错配)，则PTGS即无法进行，此时复合物又可转而利用stRNA抑制核糖体在mRNA上延伸从而在翻译水平阻断基因表达，此模型中RI
27、SC作为一个平台，不同情况下可以募集不同的组件在其上装配，从而行使不同的功能，但最终均导致特定基因沉默，Sharp等证实在哺乳动物培养组织中，siRNA确实可通过与mRNA3端非翻译区结合而抑制翻译的进行。4、作为基因组的免疫系统所有的复杂生物的基因组在长期的进化过程中均面临着病毒等外来核酸序列的侵入，如人类基因组约有54%的序列含有这种入侵留下的遗迹。那么生物怎样才能使自己的基因组免受外来核酸分子侵袭，保持结构完整呢? 研究表明RNAi机制在真核细胞中起着类似动物免疫系统的作用，充当基因组的防护者。在植物中，RNAi导致的PTGS和VIGS是保护基因组免受病毒入侵的重要机制，在动物中也存在类
28、似的机制。除了可以抵御外来病毒入侵外，RNAi还可以控制基因组自身的寄生物转座因子的活动，在许多生物中，RNAi机制通过使转座因子或重复序列区域异染色质化，大大抑制了转座子和重复序列之间的同源重组对基因组可能造成的破坏。2002年5月Science的一片封面文章将这一范围扩大到了动物领域：加州大学费赛德分校的Shou Wei Ding等人是首此证明动物细胞也可以利用RNA沉默来抵御病毒侵染，这也是首次为证明动物和植物王国抗病毒通路的高度保守性提供了实验依据。之后法国科学家进一步将这一范围扩大到了哺乳动物。2006年Eugene Koonin等人又证明原核生物里存在类似于真核生物RNA干扰系统的
29、RNA沉默机制。正是由于RNAi机制的存在，才使生物基因组在长期的进化过程中能够保持结构的完整性和遗传的连续性。另外，2006年，David Corey还在Nature Chemical Biology发表文章提出siRNA不但可以沉默目标基因的表达，在某种情况下还可以激活目标基因的表达。同年的Sicence上发表了第一个Dicer酶的晶体图片，“dsRNA结合部分和RNAse类似结构部分是分开的，中间间隔一个带电的平台，可以容下25bp的RNA”，为解释Dicer到底如何加工siRNA提供了一些线索。Alexander Murashov等人则发现外周神经也能内吞siRNA并在轴突中运输siR
30、NA，能检测到轴突本地蛋白表达的下降。随后又发现在外周神经损伤后的某些时间点有特定的miRNA产生，表明RNAi机制在神经细胞修复过程中可能其某些作用，RNAi甚至可能应用于脊柱神经损伤的治疗。2006年冷泉港实验室Gregory Hannon等人发现了一类关闭基因表达的新小RNA分子Piwi-干扰RNA，大量存在于老鼠和人的睾丸中，科学家相信，与piRNAs有关的Piwi基因在多种生物中负责调控精细胞的发育和维持。这被Sicence评为2006年十大进展。综上所述，可见RNAi机制在真核生物生命活动中处于极为重要的地位，可以把它看作是一个以小分子RNA为核心的由多种组分构成的真核基因表达调控
31、体系。它可以在转录水平、转录后水平和翻译水平调节基因表达，并与细胞众多生物学过程密切相关。二、RNA干扰的特点应用RNA干扰技术抑制特定的基因表达远远优于传统的基因抑制工具，根本原因在于RNA干扰是源自细胞内在的基因调节机制，它沉默细胞基因表达具有以下几个显著特点：1、应用的普遍性 如前文所述，RNAi的机制系统发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。把长的dsRNA或短的siRNA导入生物体细胞，可激发RNA干扰、沉默基因表达。细胞培养和动物模型的实验都证实，siRNA可在多种器官的细胞中，包括肝脏、血液系统、视网膜、胚胎和造血干细胞等抑制特异性的基因表达。此外，几乎所有的基因都能通过RN
32、A干扰被沉默，目前用siRNA或dsRNA抑制的基因已经达到4000多种。针对某种特定的哺乳动物细胞基因，可以设计出数个至数十个能抑制其表达的siRNA序列。 与此相反，传统的反义基因技术在序列设计上的选择，以及所能沉默的记忆所能沉默的基因种类都少得多。2、高效性RNA干扰抑制目标基因表达的效能非常高，这是它区别于传统反义基因技术的主要特点。Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始dsRNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将dsRNA浓度降低到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L时，沉默
33、的效果才消失。Holen等也证实1100 nmol/L的dsRNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达。更令人惊讶的是，一次性地把50ug的siRNA注入小鼠的血液内，能高效的抑制多个器官，包括肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和胰腺中目标基因表达。其中肝脏内特异的基因抑制效果最强，能达到80%以上。3、特异性siRNA是严格按照碱基配对的法则与目标mRNA结合，对互补序列特异性的要求相当高。Elbashir等和Brummel kamp等发现在21
34、23个碱基对中有12个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。很多实验也证实，相差23个碱基序列的siRNA的作用则完全丧失。并且只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。4、ATP依赖性在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被 Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。 5、位置效应 Holen等根据人TF(tissue factor)不同的位置各合成了4组dsRNA来检测不同位置的dsRNA对基因沉默效率的影响。在不
35、同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明dsRNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。6、竞争效应Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167
36、i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。7、可传播性RNA干扰抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体并且可遗传。在线虫中，dsRNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID-1，它可以将dsRNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID-1介导的双dsRNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi
37、不能扩散。 8、长度一定dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被 Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡。第四节 RNA干扰技术要点一、siRNA的设计以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具，但后来发现长链dsRNA 特异性较差。它可激活RNaseL导致非特异性RNA降解，还能激活依赖于dsRNA 的蛋白激酶R，PKR可磷酸化翻译起始因子elF2a并使其失活，从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA
38、 就可以有效引起基因沉默，并且不会产生非特异抑制现象，进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3端有两个碱基突出的siRNA。但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对，单个碱基错配就会大大降低沉默效应，而且siRNA还可以造成与其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默)，所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。二、siRNA 的合成 目前获得siRNA主要有三种方法，化学合成、体外酶法合成和体内转录。1、化学合成siRNA可以直接进行化学合成，方便且不受碱基限制，但合成一个siRNA需先分别
39、合成两条单链(每条链合成需20步反应，每步反应产物均需纯化)，然后再退火成双链RNA，合成耗时长且费用很高。2、体外酶法合成 首先合成两段29nt的DNA，包括8个与T7启动子3端互补的碱基(称为引导序列，leader sequence)和由21个碱基构成的siRNA 编码序列。将这两段DNA分别和T7启动子混合，T7启动子和DNA引导序列退火结合，然后用DNA 聚合酶Klenow大片断补齐成为可用于转录的dsDNA模板，分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录，再将产物混合形成dsRNA。新的双链RNA包含5端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3端两个重复的U (UU)，以DNA酶降解
40、模板，同时用单链专一的核糖核酸酶(RNase)消化5的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能降解dsRNA，所以得到的产物就是所需的21bp的双链siRNA有19对碱基互补，3端各有2个U突出。3、体内转录 近几年，有几个研究小组构建了一些可以在真核细胞内表达siRNA的载体，包括被广泛应用的质粒载体和新研发的转染效率较高的病毒载体。质粒载体(以Ambion公司提供的Psilencer系列质粒为例，)都包含有一个RNA聚合酶 (Pol )启动子和一个45个连续的T构成的转录终止位点以及选择标记，选用Pol 启动子是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录，而遇到45个连续的T就终止转
41、录，并且终止于转录终止位点第二个碱基处，十分精确。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环(1oop)序列隔开，插入载体Pol 启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成具发夹结构的小RNA分子 ，这些小RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA 有19对互补碱基，3端各有2个U突出，可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比，表达载体是在细胞内通过转录持续产生siRNA，所以可延长siRNA作用时间， 三、siRNA导入细胞的方法在体外(in vitro)可用不同的方法将siRNA导入靶细胞，一般来讲化学合成和体
42、外酶法合成的siRNA可用电转移(electroporation)、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导人靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo)导人siRNA的研究工作也已有报道，如有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA引入动物体内进行基因功能的研究。但这些方法所产生的抑制效应都是很短暂的，一般有效期只有一周左右。Abbas等利用改造后的病毒载体转染哺乳动物细胞，发现在细胞内的抑制效应可持续25天左右，进一步促进了RNAi技术的应用。第5节 RNA干扰的应用前景自从2001年Tuchl等证实RNA干扰现象也存在于哺乳动物，便掀起了RNA干扰的研究热潮。很
43、多不同研究领域的实验室在设计课题实验方案时都加进RNA干扰的内容，既丰富了实验手段，有增强了课题研究的说服力。同时，生产合成siRNA和开发RNA干扰药物的生物公司应运而生，不仅有像Dharmacon和Ambion等专门设计合成siRNA的公司，像Melk等大型生物企业也投入对RNA干扰药物的研制，还有原来专门研制核酶产品的生物公司Ribozyme，干脆易其名为SIRNA，转营siRNA产品开发。RNA干扰的国际会议已经召开，其他大型的国际会议，如“慢性逆转录病毒和机会感染（CROI）大会”和“美国癌症研究协会（AACR）年会”等，都加插了RNA干扰专题会场。一、RNA干扰在探索基因功能中的应
44、用人类基因组计划的完成标志着后基因组时代（reverse genetics）的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。其中逆基因手段应用于探索基因功能比转基因表达的方法更有效和合理。所谓逆基因策略，是指通过特异性的基因敲除（knock-out）或敲低（knock-down），在去除该基因或降低其表达的系统中观察所呈现出来的表性特征的研究方法。逆基因的概念最先是从“基因敲出小鼠”模型的建立过程中提出的，后来又在反义基因技术和核酶技术的应用中进一步丰富。但是，基因敲除涉及非常复杂的分子技术，既花时间又耗费资源，而传统的反义基因技术的基因抑制效果和特异性都较差，不能
45、满足探索基因功能的要求。 通过RNAi特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能较传统方法如基因敲除省时方便，Phillip认为使用基因敲除技术敲除一个基因约需要6-12个月，而使用RNAi技术一个星期可以敲除约10个基因。Fraser等与Gonez等曾采用此方法证实了线虫染色体I和染色体III中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能，并在约l9 000个基因的线虫蠕虫中，构建了12 000种不同dsRNA文库用于研究其与复杂生命现象相关的基因的功能，如肥胖、衰老等。RNAi技术为功能基因组的研究提供了一种新的工具，使工作进程大大加快。 2003年，Kamath等人用与Frase
46、r同样的方法研究了线虫16 757个基因(占线虫全基因组基因总数的86%)的RNAi表型，共鉴定出1722个基因缺陷表型，其中23为首次发现。这是第1次用RNAi技术大规模高通量研究全基因组基因的功能。Ashrafi等用Kamath等建立的dsRNA细菌表达文库筛选与脂肪储存有关的基因，发现417个基因与脂肪储存有关，其中有许多脂肪代谢调节基因与哺乳动物中的同源。Harborth等将体外构建的siRNA分别导人Hela细胞、大鼠成纤维细胞和3T3细胞，分别抑制了哺乳动物的laminBl、laminB2、NUPl53、GAS4l、ARC21、cdkl、-actin及-actin等21个不同类型的
47、基因，均获得成功。1、 植物基因功能研究 目前根据拟南芥和水稻测序结果已经得到了大量的基因序列，研究者们也利用比较基因组学的方法对其中一些基因的功能进行了预测。利用植物中已知基因的保守序列，通过PCR扩增的方法也得到了大量可能具有同种功能的候选基因，这些候选基因的进一步鉴定也可以用RNAi技术来进行。2、 动物基因功能研究科学家们在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。他们建立了一个包含8 000多个基因的siRNA表达框文库阵列，通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的Unique基因，为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记；线虫和果蝇的全部基因组序列已
48、测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制，研究者可以深入研究基因功能，进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。 2、 RNA干扰在研究细胞转导通路中的应用由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达，可使其成为研究信号传导通路的良好工具。在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化Dsod(Mek的类似物)，活化的Dsorl可以激活EekA(ERK的类似物)。以Dsorl为靶目标的dsRNA可以阻断Dsod的表达，虽然总的ErkA的表达不受影响，但由于Dsod的表达被抑制，胰岛素刺激后ErkA不能活化。联合利用传统的缺失突变技术