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1、www.CRTER.org毕凌云，等. 动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖*毕凌云1，杨达胜1，赵德安1，梁 斌1，张瑞霞1，白海涛2 (1新乡医学院第一附属医院儿科，河南省卫辉市 453100；2厦门大学附属第一医院儿科，福建省厦门市 361003)文章亮点：1骨髓干细胞具有多项分化潜能，设想利用骨髓干细胞分化为肾脏固有细胞、修复损伤肾组织。正常情况下，外周血干细胞数目较少，而骨髓干细胞动员剂可提高外周血干细胞数目，达到治疗目的。2 实验拟用大鼠缺血再灌注肾损伤模型，联合粒细胞集落刺激因子和干细胞因子动员自身骨髓干细胞，初
2、步探讨骨髓干细胞动员剂对缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖的影响及促进肾小管修复的可能机制，实验结果表明联合使用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子动员自身骨髓干细胞，可以促进肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞的增殖和减少细胞凋亡，从而有利于肾小管损伤的恢复。关键词：干细胞；骨髓干细胞；肾损伤；干细胞因子；粒细胞集落刺激因子；肾缺血再灌注损伤；细胞凋亡；省级基金；干细胞图片文章主题词：干细胞；肾；缺血再灌注；再灌注损伤；干细胞因子；粒细胞集落刺激因子基金资助：2006年河南省医学科技公关项目-89*；2009年新乡医学院第七批省级重点学科开放课题(ZD200909)*摘要背景：骨髓干细胞具有多项分化潜能，
3、可分化为肾组织固有细胞、修复损伤肾组织。目的：探讨粒细胞集落刺激因子联合干细胞因子动员自身骨髓干细胞对大鼠缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖的影响。方法：160只大鼠尿筛阴性后随机均分为正常对照组、模型组、细胞因子治疗组、治疗对照组。模型组和细胞因子治疗组建立大鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤模型；细胞因子治疗组和治疗对照组于造模后24 h开始皮下注射粒细胞集落刺激因子(50 g/kg，1次/d)和干细胞因子(200 g/kg，1次/d)，连续5 d；模型组不给药，正常对照组不予干预。TUNEL法检测细胞凋亡；免疫组织化学法(SABC法)检测肾组织CD34+细胞、Caspase-3、Bcl-2、细胞增殖核
4、抗原表达情况。结果与结论：细胞因子治疗组肾组织内CD34+细胞较正常对照组、模型组明显增多(P 0.05)。不同时间点模型组和细胞因子治疗组凋亡指数、Capase-3表达量均高于正常对照组和治疗对照组(P 0.05)，且模型组均显著高于细胞因子治疗组(P 0.05)。不同时间点模型组和细胞因子治疗组Bcl-2阳性表达细胞均高于正常对照组和治疗对照组(P 0.05)。细胞因子治疗组显著高于模型组，然后随着时间推移Bcl-2表达量明显减少(P 0.05)。模型组和细胞因子治疗组均可见细胞增殖核抗原阳性表达细胞；模型组于第24天增殖指数达峰值，后逐渐下降。细胞因子治疗组在第10天即达到高峰，持续至第
5、17天，然后逐渐下降。说明粒细胞集落刺激因子联合干细胞因子动员自身骨髓干细胞可以促进肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞的增殖和减少细胞凋亡，从而有利于肾小管损伤的恢复。Mobilization of autologous bone marrow stem cells is involved in cell apoptosis and proliferation following renal ischemia-reperfusion injuries Bi Ling-yun1, Yang Da-sheng1, Zhao De-an1, Liang Bin1, Zhang Rui-xia1, Ba
6、i Hai-tao2 (1Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China; 2Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, Fujian Province, China)毕凌云，女，1978年生，汉族，河南省新乡市人，博士，讲师，主治医师，主要从事小儿肾脏病
7、及儿童血液净化方面的研究。通讯作者：杨达胜，教授，主任医师，副院长，新乡医学院第一附属医院，河南省卫辉市 中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2013)49-08488-10修回日期：2013-09-20(201302077/DW)Bi Ling-yun, M.D., Lecturer, Attending physician, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province,
8、 CCorresponding author: Yang Da-sheng, Professor, Chief physician, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, CAccepted: 2013-09-20AbstractBACKGROUND: Bone marrow stem cells are defined by their multi-potential ability, and
9、can be differentiated into intrinsic cells in the kidney.OBJECTIVE: To study the effects of mobilizing autologous bone marrow stem cells by granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor on cell apoptosis and proliferation of rats with renal ischemia-reperfusion injury. 3 P.O.Box 1200,S
10、henyang 110004 METHODS: Totally 160 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, model group, cytokine treatment group, cytokine control group. Rat models of unilateral renal ischemia-reperfusion injury were established in the model and cytokine treatment groups. R
11、ats in the cytokine treatment group and cytokine control group received subcutaneous injection of granulocyte colony-stimulating factor (50 g/kg) and stem cell factor (200 g/kg), once a day, for 5 continuous days. Rats in the model and control groups had no treatment. Apoptotic cells were detected b
12、y terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling method, and the expression of CD34-positive cells, Caspase-3, Bcl-2, proliferating cell nuclear antigen in the kidney were measured using immunohistochemistry staining.RESULTS AND CONCLUSION: The number of CD34-positive c
13、ells in renal tissue of the cytokine treatment group was significantly higher than that of the control group and model group (P 0.05). The apoptotic index and expression of Capase-3 in the model group and cytokine treatment group were higher than those in the control group and cytokine control group
14、 (P 0.05). The apoptotic index and expression of Capase-3 in the cytokine treatment group were lower than that in the model group (P 0.05). The expression of Bcl-2 in the model group and cytokine treatment group was higher than that in the control group and cytokine control group (P 0.05). The expre
15、ssion of Bcl-2 in the cytokine treatment group was higher than that in the model group (P 0.05); however, as time went on, Bcl-2 expression was obviously decreased. Proliferating cell nuclear antigen expressed both in the model group and in the cytokine treatment group. Additionally, the proliferati
16、ve index reached peak at 24 days in the model group, and then decreased gradually; while in the cytokine treatment group, it reached the peak at 10 days, maintained a high level until the 17th day, and then decreased gradually. Mobilization of autologous bone marrow stem cells by combination of gran
17、ulocyte colony-stimulating factor and stem cell factor can increase proliferation and decrease apoptosis of renal tubular epithelial cells after renal ischemia-reperfusion injury, and thus, promote the recovery from renal tubular injury.Subject headings: stem cells; kidney; ischemia-reperfusion inju
18、ry; reperfusion injury; stem cell factor; granulocyte colony-stimulating factorFunding: the Medical Technology Tackle Key Project of Henan Province in 2006, No. 89*; Open Topics of Provincial Key Disciplines in Xinxiang Medical College in 2009 (7th Batch), No. ZD200909*Bi LY, Yang DS, Zhao DA, Liang
19、 B, Zhang RX, Bai HT. Mobilization of autologous bone marrow stem cells is involved in cell apoptosis and proliferation following renal ischemia-reperfusion injuries. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013; 17(49):8488-8497.8497ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction急性肾衰竭发病率约占全部住院患
20、者的5%，占ICU患者的30%1，住院患者死亡率高达40%-60%2-3。肾缺血/肾毒素引起的急性肾小管坏死是急性肾衰竭最主要原因，目前仍缺乏治疗急性肾衰竭的根本性措施4。缺血再灌注损伤的发病机制十分复杂，很多的研究表明，细胞凋亡是缺血再灌注致肾损伤的重要环节之一5。促进肾小管的再生及修复是改善急性肾小管坏死预后的关键所在。骨髓干细胞可分化成肾脏固有实质细胞，如系膜细胞、小管上皮细胞、足细胞等6-8。已有将骨髓干细胞用于急性肾小管损伤修复治疗的报道9-12，实验证明通过骨髓干细胞移植可促使急性肾衰竭的肾小管上皮细胞修复，展示了骨髓干细胞在肾脏病治疗中巨大的应用潜力。但是迄今为止有关骨髓干细胞促
21、进肾脏损伤修复的实验均是以体外培养的细胞移植为基础，前期准备周期长，涉及环节多，对急性肾衰竭的临床治疗缺乏可行性。近年来的研究发现以骨髓干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子、干细胞因子动员自体骨髓干细胞以治疗肾损伤、心肌细胞坏死、神经损伤、肝脏损伤及血液系统恶性肿瘤等疾病13-17。实验拟用大鼠缺血再灌注肾损伤模型，联合粒细胞集落刺激因子和干细胞因子动员自身骨髓干细胞，初步探讨骨髓干细胞动员剂对缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖的影响及促进肾小管修复的可能机制，为急性肾衰竭治疗提供理论依据和技术基础。1 材料和方法 Materials and methods设计：动物实验，对照观察。时间及地点：实验于2
22、010年1月至2011年6月在新乡医学院第一附属医院中心实验室完成。材料：动员自身骨髓干细胞对大鼠缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖实验的主要试剂及药物：药品及试剂兔抗大鼠细胞增殖核抗原多克隆抗体(编号bs-0491R)、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(编号bs-0032R)、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体(编号bs-0081R)、即用型SABC免疫组化染色试剂盒(编号SP-0023)TUNEL试剂盒(编号11 684 817 910)重组人粒细胞集落刺激因子注射液(批号200804Y21)重组人干细胞因子注射液(批号20080405)来源北京博奥森生物技术有限公司美国罗氏公司华北制药金坦生物
23、技术股份有限公司成都地奥九泓制药厂实验动物：健康雄性8-10周龄SD大鼠160只，体质量250-280 g，由郑州大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(豫)2009-052。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。实验方法：缺血再灌注肾损伤模型的建立及动物分组：160只大鼠尿筛阴性后随机均分为4组：正常对照组、模型组、细胞因子治疗组、治疗对照组。模型组和细胞因子治疗组参照Supavekin等18的方法建立大鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤模型；细胞因子治疗组于造模后24 h开始皮下注射粒细胞集落刺激因子(50 g/kg，1次/d)和干细胞因子(200 g/kg，1次/d)，连续5 d19
24、；模型组不给药，治疗对照组同时间及同剂量给正常大鼠注射治疗粒细胞集落刺激因子和干细胞因子，正常对照组仅正常喂养，不予干预。由于骨髓动员剂通常在用药后3-5 d可使外周血干细胞达到高峰20，结合预实验结果，选取干预措施第5天为检测起始时间点。肾组织标本留取：干预后5，10，17，24，31 d每组随机取出8只大鼠留取标本。10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，摘除左肾，生理盐水冲洗，用手术刀片切成1.0 cm1.0 cm0.2 cm大小的组织块，置于体积分数10%中性甲醛缓冲液中固定。TUNEL法检测肾小管细胞凋亡：实验步骤：4 m石蜡切片常规脱蜡至水。体积分数0.3%H2O2的甲醇
25、液室温作用5 min，0.01 mol/L PBS洗涤。20 mg/L蛋白酶K处理，37 孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤。加入TUNEL反应混合液50 L，37 孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗涤。POD转换液50 L，37 孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗涤。DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。计算凋亡指数(apoptotic index，AI)：在普通光学显微镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)%。免疫组织化学
26、检查：实验步骤：免疫组织化学检测采用链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶方法(SABC法)。 4 m石蜡切片常规脱蜡、水化，枸橼酸缓冲液微波修复，高火5 min，中火5 min，5%BSA封闭后，分别以兔抗大鼠CD34多克隆抗体(1200)、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体(1100)、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(1100)、兔抗大鼠细胞增殖核抗原多克隆抗体(1100)作为一抗，4 过夜，PBS洗后加入山羊抗兔lgG作为二抗，37 恒温箱孵育30 min，PBS洗涤后显色。用PBS代替一抗作空白对照。免疫组织化学结果的评价：光镜下组织呈棕色或棕黄色颗粒性沉淀区域为阳性染色部位。CD34，Ca
27、spase-3，Bcl-2和细胞增殖核抗原染色结果在400倍镜下每例切片随机选择10个不重叠的视野，应用IDA-2000计算机图像自动分析系统对选取视野内免疫组织化学阳性信号进行图像分析，分别计数每个视野CD34，Caspase-3，Bcl-2和细胞增殖核抗原阳性细胞数目占总肾小管细胞数的百分比，取其平均值为免疫组织化学染色结果。主要观察指标：观察肾组织凋亡细胞和CD34，Caspase-3，Bcl-2，细胞增殖核抗原表达变化，观察骨髓干细胞动员剂作用下损伤肾组织内是否有干细胞，并且能够抑制细胞凋亡、发挥修复损伤肾组织的作用。统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件分析，各组数据均采用s表示
28、，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用两组独立样本t 检验，以P 0.05)。表1 各时间进入结果分析的大鼠数量Table 1 Number of rats enrolled at different time for result analysis (n) 时间正常对照组模型组细胞因子治疗组治疗对照组 5 d10 d17 d24 d31 d88888877768 8 8 7 7888882.2 肾组织细胞凋亡和凋亡指数的比较 见表2，图1-3。表2 正常对照组、模型组、细胞因子治疗组及治疗对照组大鼠肾组织凋亡指数比较Table 2 The comparison of apoptotic
29、 index of the kidney among the four groups (s, %)时间正常对照组模型组细胞因子治疗组治疗对照组 5 d10 d17 d24 d31 d0.4400.1130.4850.0070.4950.0500.4900.0280.4300.05735.6081.080b30.7780.718ab25.5681.207ab8.4931.044ab6.3680.46630.6110.781bc20.8761.207abc5.5360.698abc3.8690.359abc2.7090.343bc0.4650.0780.4750.0070.4400.0850.47
30、50.0210.4800.042与同组前一时间点比较，aP 0.05；与同时间点正常对照组比较，bP 0.05；与同时间点模型组比较，cP 0.05。注：模型组和细胞因子治疗组凋亡指数高于两对照组，模型组显著高于细胞因子治疗组，随着时间推移肾小管上皮细胞凋亡逐渐减少。A：正常对照组 B：治疗对照组注：正常对照组未见到凋亡细胞；治疗对照组大鼠肾组织见到少量凋亡细胞(箭头)。图1 正常对照组及治疗对照组皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子后肾组织观察肾组织切片(TUNEL染色，200)Figure 1 Histological observation of renal sections in n
31、ormal control rats and the normal rats were injected subcutaneously with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (TUNEL staining, 200) 图2 单侧肾脏缺血再灌注损伤模型大鼠肾组织切片观察(TUNEL染色，200)Figure 2 Histological observation of renal sections of rats with unilateral renal ischemia-reperfusion inju
32、ry (TUNEL staining, 200)A：5 dC：17 dB：10 dD：24 dE：31 d注：第5天开始可见肾组织有凋亡细胞(箭头)，随着病程进展，凋亡细胞逐渐减少，细胞凋亡主要发生在皮髓质交界处的肾小管上皮细胞。B：10 dA：5 dD：24 dC：17 d注：凋亡细胞(箭头)及凋亡过程与模型组相似，但少于模型组。E：31 d图3 皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子干预后缺血再灌注损伤大鼠肾组织切片(TUNEL染色，200)Figure 3 Histological observation after rats with unilateral renal ischemia
33、-reperfusion injury were injected subcutaneously with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (TUNEL staining, 200)模型组和细胞因子治疗组凋亡指数高于两对照组(P 0.05)，模型组显著高于细胞因子治疗组(P 0.05)，随着时间推移肾小管上皮细胞凋亡逐渐减少。2.3 肾组织Caspase-3表达 见表3，图4-6。与同组前一时间点比较，aP 0.05; 与同时间点正常对照组比较，bP 0.05；与同时间点模型组比较，cP 0.05。注：模型
34、组和细胞因子治疗组Capase-3表达量高于两对照组，模型组显著高于细胞因子治疗组。模型组、细胞因子治疗组第10，17，24，31天均较前一时间点显著减少。表3 正常对照组、模型组、细胞因子治疗组及治疗对照组大鼠肾组织Caspase-3表达结果Table 3 The expression of Caspase-3 in renal tissue of four groups (s, %)时间正常对照组模型组细胞因子治疗组治疗对照组 5 d10 d17 d24 d31 d0.3200.0140.3500.0140.3700.0280.3400.0570.3450.03524.4350.581b2
35、1.4760.270ab17.5130.298ab9.4290.444ab8.4140.271ab19.5140.312bc13.5810.503abc7.5160.496abc4.4350.298abc3.5760.177ac0.4300.0280.4400.0280.4450.0640.4500.0280.4600.028A：正常对照组 B：治疗对照组注：均有少量Caspase-3表达(箭头)。图4 正常对照组大鼠及皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子后正常大鼠肾组织Caspase-3表达(免疫组织化学染色，200)Figure 4 The expression of Caspase-3
36、 in renal tissue of normal control rats and normal rats which were injected subcutaneously with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (Immunohistochemistry staining, 200)B：10 dD：24 dE：31 d注：第5天肾组织有Caspase-3阳性细胞(箭头)，随着病程进展，Caspase-3表达逐渐减少，Caspase-3表达和细胞凋亡分布一致。A：5 dC：17 d图5 单侧肾脏缺
37、血再灌注损伤模型大鼠肾组织Caspase-3表达(免疫组织化学染色，200)Figure 5 The expression of Caspase-3 in renal tissue of rats with unilateral renal ischemia-reperfusion injury (Immunohistochemistry staining, 200)C：17 dD：24 dB：10 dA：5 dE：31 d注：第5天肾组织可见Caspase-3阳性细胞(箭头)，随着病程进展，Caspase-3表达逐渐减少，Caspase-3表达和细胞凋亡分布一致，但Caspase-3阳性细胞
38、少于模型组。图6 皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子干预后缺血再灌注损伤大鼠肾组织Caspase-3表达(免疫组织化学染色，200)Figure 6 The expression of Caspase-3 in renal tissue of rats with unilateral renal ischemia-reperfusion injury which were injected subcutaneously with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (Immunohistochemistry
39、 staining, 200) 模型组和细胞因子治疗组Capase-3表达量高于正常对照组和治疗对照组(P 0.05)，模型组均显著高于细胞因子治疗组(P 0.05)。模型组、细胞因子治疗组大鼠同组对照手术后第10，17，24，31天均较前一时间点减少，差异有显著性意义(P 0.05)。2.4 肾组织Bcl-2表达 模型组和细胞因子治疗组Bcl-2阳性表达细胞均高于正常对照组和治疗对照组 (P 0.05)。模型组、细胞因子治疗组同组对照在手术后第10，17天均较前一时间点显著增强(P 0.05)，造模后第17天两组表达量最高，且细胞因子治疗组显著高于模型组，然后随着时间推移Bcl-2表达量明显
40、减少(P 0.05)。见图7-9，表4。A：正常对照组 B：治疗对照组注：均未见Bcl-2表达。图7 正常对照组大鼠及皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子后正常大鼠肾组织Bcl-2表达(免疫组织化学染色，200)Figure 7 The expression of Bcl-2 in renal tissue of normal rats and the normal rats which were injected subcutaneously with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (Immunohi
41、stochemistry staining, 200)A：5 dB：10 dD：24 d图8 单侧肾脏缺血再灌注损伤模型大鼠肾组织Bcl-2表达(免疫组织化学染色，200)Figure 8 The expression of Bcl-2 in renal tissue of rats with unilateral renal ischemia-reperfusion injury (Immunohistochemistry staining, 200)E：31 dC：17 d注：第5天肾组织中可见Bcl-2阳性细胞(箭头)，17 d时达到高峰，随后逐渐减少，Bcl-2阳性细胞主要位于肾小管。
42、B：10 dA：5 dD：24 dC：17 dE：31 d注：实验第5天肾组织中有Bcl-2阳性细胞，17 d时达到高峰，随后逐渐减少。Bcl-2阳性细胞主要位于肾小管。Bcl-2阳性细胞显著高于模型组。图9 皮下注射粒细胞集落刺激因子和干细胞因子干预后缺血再灌注损伤大鼠肾组织Bcl-2的表达达(免疫组织化学染色，200)Figure 9 The expression of Bcl-2 in renal tissue of rats with unilateral renal ischemia-reperfusion injury which were injected subcutaneou
43、sly with granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor (Immunohistochemistry staining, 200)与同组前一时间点比较，aP 0.05; 与同时间点正常对照组比较，bP 0.05；与同时间点模型组比较，cP 0.05。注：模型组和细胞因子治疗组Bcl-2阳性表达高于两对照组。模型组、细胞因子治疗组同组对照在手术后第10天、17天均较前一时间点显著增强，手术后第17天表达量最高，且细胞因子治疗组显著高于模型组，然后随着时间推移Bcl-2表达量明显减少。时间正常对照组模型组细胞因子治疗组治疗对照组 5 d10 d17 d24 d31 d1.0050.1630.9250.0071.0050.0211.0000.0280.9550.0074.5140.438b10.2900.943ab20.4340.983ab17.4050.392ab6.3680.466ab6.6930.491bc15.5610.772